Xác định kiểu gen virut viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử real time – PCR

Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong
huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ
thuật sinh học phân tử Real time – PCR

Phương Thị Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS.BS. Nguyễn Văn Tiến
Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Trình bày đặc điểm sinh học virut viên gan C (HCV), genotype HCV, bệnh
học viêm gan virut C và các kỹ thuật real-time PCR. Phân tích những mẫu huyết thanh
và các bệnh nhân đã xác định anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền
nhiễm bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/ 2011 đến tháng 01/2012. Đưa ra kết quả
nghiên cứu: tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo giới tính; tỷ lệ bệnh nhân
chuẩn đoán viêm gan C theo mạn; mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả
định type; xác định lại kiểu gen type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen
(Sequencing) trên đoạn NS5B.

Keywords: Vi sinh vật học; Virus viêm gan C; Kiểu gen; Sinh học phân tử

Content
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều
trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như
thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu
gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) Để xác định được genotypes HCV thì ngày
nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học
phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công
ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes

HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được
áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes HCV: Real-time PCR
(RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán
có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những
nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc
trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại
các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm

2
PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù
hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến
subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn
đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm
gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”,
với những mục tiêu như sau :
1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman
probe.
2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn
gen NS5B.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)
1.1.1.Hình thái cấu trúc virut viêm gan C
Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV
có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1).
Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng
vỏ (Hình 1.2).

Kích thước khoảng 60nm
Hình 1.2. Cấu trúc của virut viêm gan C
1.1.2. Genome HCV

Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực
dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại
bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb.
Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan
C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho
protein của virut [17,40,47].
Mà ng vỏ
ARN virus
Mà ng vỏ
glycoprotein
Core

3
Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng
Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:
- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo
nuclecapsit.
- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.
- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70.
Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:
- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23).
- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72).
- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein
p27.
- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-
Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép.
Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame),
mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3).
Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống
như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu

trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-
Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế
riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].


Cấu trúc Không cấu trúc

Tổng hợp chuỗi polyprotein
Protein


4
Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica
và ARN-polymerase

Hình 1.3: Tổ chức genome HCV
Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được
đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi
cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3). Các protein cấu trúc là hợp
phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết
với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50].
1.1.3. Vòng đời của virut viêm gan C
Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in vitro để thể
hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV. Nhưng vì hình thành hệ thống replicon đã như một
cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV.

Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trƣởng HCV [51] (1:Sự hấp phụ bề mặt
tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận. 2: Xâm nhập nội tế bào. 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào
gan. 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải phóng ARN (+). 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web
màng. 6: Tập hợp và đóng gói. 7: Tạo virut hoàn chỉnh. 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan)

1.2. Genotype HCV

5
HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men
RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ
đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type)
khác nhau[7,50].
Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được từ các
bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm tại các vùng
miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất là 06 nhóm gen chính
bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39]. Khi tính toán mức trung bình
trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự
biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen
nhân và một số gen không có cấu trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn. Khả năng khác
nhau của các chuỗi ở mức thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại
đó chuỗi riêng lẻ và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng
chuyển hóa[44,47].
Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước trên đoạn
gen là có sự đồng nhất. Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự biến đổi của chuỗi trình
tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của protein là không có sự bảo tồn cao với
kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng
ý với ý kiến này cho rằng có khả năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có
sự biến đổi codon thứ ba của gen lõi[42,44].

6




Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44].

Mỗi nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV đều có chứa một chuỗi
các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đó, sự khác biệt của mỗi subtype vào
khoảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con số này là >30%. Một số genotype như
1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng hơn cả, điều này có thể là kết quả của quá trình truyền máu
và dùng chung kim tiêm giữa những người sử dụng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây
giờ phần lớn là phân bố ở các nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp
phổ biến nhất trong các thử nghiệm lâm sàng và thông tin mới nhất đã được thu thập trên các
phản ứng với interferon (INF) và các phương pháp điều trị virus khác). Trong đó 1a phân bố
toàn thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân bố địa trung hải và Trung
Đông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung đông, type 5 ở Nam Phi, type 6 ở
Hồng Kông và Việt Nam [42,44].
Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực châu Phi
và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ thể. Ví dụ, sự lây
nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi những người ở Trung Phi, chẳng
hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu
Kiểu gen 1a được phân bố rộng rãi ở
bắc Âu và Mỹ, các nước có nền công
nghiệp hóa.
Kiểu gen 1b thường thường phân
bố toàn thế giới
Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung
Đông

Type 5a thường
tìm thấy duy nhất
ở Nam Phi
Type 6a tìm thấy ở Việt Nam, các
khu công nghiệp ở Hồng Kông và
gần đây tìm thấy ở Autralia
Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu

vực công nghiệp hóa ở Châu Âu
Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thấy
chủ yếu ở các nước vùng Địa
Trung Hải và viễn Đông

7
gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng
sự có mặt của các kiểu gen này có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất
vài thế kỷ [42,44].
Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật vậy, kiểu
gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu
phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm
của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO
xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây
nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của
Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và
Indonesia [42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông
Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42]
và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30
triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á là do kiểu gen 6 và sự phân bố
kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á.
Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp
ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với
54,9%)[2]
Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:
+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV
mạn cao (>80%)
+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm
+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu
hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới)

1.3. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV
Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ thuật Real-
time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing).
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

8
Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định Anti HCV
dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai.
2.2. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu.
Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó tổng hợp thành
cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA của các mẫu bệnh
nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time
Kĩ thuật tách chiết ARN
Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên
Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh lượng HCV-RNA.
Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen HCV
Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng.
Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa
chọn.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu
3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính

3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn
3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR
3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type
3.2.2. Tỉ lệ kiểu gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype
Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV
Kiểu gen
HCV
Type 1
Type 2
Type 3
Type 6
Không xác
định đƣợc
Tổng
Số mẫu
151
5
0
70
2
228

Tỉ lệ %
66.23%
2.19%
0%
30.7%
0.88%
100%

Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type
1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ
lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu

9
với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân
nghiên cứu.
Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3

Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ
thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường
hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2
chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50].
Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại
trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác
định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả
cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6. Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type
1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a)
23,9% và kiểu gen 2 là 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là
kiểu gen 3b (0,3%)[ 50].
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ thuật Real-
time PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong nghiên cứu của Hồ
Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng 5’NC, cho thấy kết quả nghiên
cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng
gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm
cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những
người nhiễm HCV tại Việt Nam.
Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV

10
Kiểu gen
HCV
Type 1
Type 2
Type 3
Type 6
Không xác
định đƣợc
Tổng
Số mẫu
151
5
0
70
2
228

Tỉ lệ %
66.23%
2.19%
0%
30.7%
0.88%
100%


Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type
1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ

lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu
với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân
nghiên cứu.
Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3

Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ
thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường
hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2
chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50].
Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại
trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác
định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả
cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6. Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type

11
1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a)
23,9% và kiểu gen 2 là 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là
kiểu gen 3b (0,3%)[ 50].
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ thuật Real-
time PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong nghiên cứu của Hồ
Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng 5’NC, cho thấy kết quả nghiên
cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng
gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm
cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những
người nhiễm HCV tại Việt Nam.
3.2.3. Tỉ lệ kiểu gen lưu hành theo giới tính
3.2.4. Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi
3.3. Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phƣơng pháp giải tình tự gen (Sequencing)
trên đoạn NS5B.

Đối với hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA
chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription
RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6. Việc bố trí thí nghiệm cũng
được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe
1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các
genotype còn lại (Hình 3.6)




HCV genotype 1
HCV genotype 3
HCV genotype2
HCV genotype 6
Chứng âm

Hình 3.6 Kết quả
khảo sát khả năng
khuếch đại của mồi
và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV

12
Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dò đặc trưng
thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm (được thiết kế với các
thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh
quang thấp hơn tín hiệu nền.
Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết quả cho
hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7).

Hình 3.7 Tín hiệu dƣơng tính genotype 1 và 6
Vậy tín hiệu mẫu dò giữa type 1 và type 6 là có sự tương đồng cao.Theo một số nhà
nghiên cứu trên thế giới [18] chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ
phân biệt các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’NC, cũng như là phân biệt được type 6 với
subtype 1b.
Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định là genotype l ta l ấy ngẫu nhiên 30 trường
hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b được kết quả như bảng sau:
Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b của HCV
Kiểu gen
Type 1
Type 6
Không
xác định
được
Type 1a
Type 1b
Type 6k
Type 6e
Type 6f
Type 6h
Số mẫu
9
7
2
6
1
2
3

Tổng
16
11
3
Tín hiệ u mẫu
dò type 6

Tín hiệ u mẫu
dò type 1
Tín hiệ u mẫu
dò type 2
Tín hiệ u mẫu
dò type 3


13

Tỉ lệ %
53.33
36.67
10.0


Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết thanh
xác định là type 6 và có 3 mẫu là không giải được trình tự gen, không chỉ xác định type mà
giải trình tự gen còn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết thanh định type bằng
phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát hiện genotype HCV
cho tín hiệu dương tính với genotype 1 còn phương pháp giải trình tự gen cho kết quả là type
6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng
3.7 ).

Kết quả định type bằng kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với genotype1 ta đem
giải trình tự được kết quả như hình dưới,kết quả giải trình tự gen là type 6h (Hình 3.8).
78 HCV
GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCC
TGACCGCTCGGGCTCGGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCT
GAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCGGGAGAGTACCCATGGAGTGAGAA
TGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCGGAGTGATT
GAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTG
CCTGGAGTATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGG
GGGCATACATAATGATGTTCCCTAACCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGT
CTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGAGTGAGGTAGTAATAT
CTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b
Trong 3 mẫu không giải trình tự gen được thì có 2 mẫu có ARN-HCV thấp nhất là
1,1x10
2
và 4,2x10
2
và có 1 mẫu là 5,8x10
3
. Như vậy tuy giải trình tự gen có xác định kết quả
chính xác đến subtype tránh được sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 nhưng nếu định lượng

14
ARN-HCV có số copies< 10
3
thì ta không định được type, điều này cũng được các nhà sản
xuất bộ kit và hóa chất khuyến cáo.
Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương

pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng 40,74%.
Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù hợp với
đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ lệ nhầm lẫn giữa
type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều trị của bệnh nhân,do các
genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị
và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các genotype khác (Genotype 1 thường điều trị
trong vòng 48 tuần còn các genotype khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác
định là type 1 bằng phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >10
3
copies/ml nên kiểm
tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN
1. Qua kết quả nghiên cứu định genotype HCV bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real-time
PCR cho tỉ lệ genotype 1 là cao nhất chiếm 66,23%, tiếp đó là type 6 chiếm tỉ lệ 30,7%, type
2 có tỉ lệ thấp nhất là 2,19%, type 3 không có trong 228 trường hợp nghiên cứu
2. Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu đã xác định là genotype 1 bằng kỹ thuật Real-time PCR giải
trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1trong đó có 9 mẫu là type 1a và 7 mẫu là type 1b ,
có 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 trong đó 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu
là type 6f và 2 mẫu là type 6h . Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30
mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là
40,74%, tuy nhiên khi nồng độ virut thấp không làm được giải trình tự gen.

KIẾN NGHỊ:
1. Vẫn có thể dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type khi nồng độ virut thấp.
2. Khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp Real-time PCR và có kết quả định lượng
>10
3
copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing).

References
Tài liệu tiếng viêt:

15
1. Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm
PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định
kiểu gen HCV”, Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh.
3. Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus viêm gan C
(HCV) sử dụng chỉ thị 5’ UTR trên bệnh nhân viêm gan virus ở Hà Nội”, Tạp chí y học Việt
Nam, 7, pp.29-36.
4. Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm và nhiệt đới, NXB y học. Hà Nội.
5. Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
6. Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội.
7. Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE cơ bản, hiện đại và cập nhật, NXB Y học, Hà
Nội.
8. Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội.
9. Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội.
10. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp,
NXB y học, TP Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
11. Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth H.,
Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T. (2007), “ CD81 expression is important the
permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus infection”, Journal of
Virology, 81, pp.5036-5045.
12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H. (2005), “Intra-host evolutionary
dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of General Virology, 86,
pp.2781-2786.
13.Alter M.J. (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J Gastroenterol, 13(17),

pp.2436-2441.
14. Batey R.G. (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of hepatitis C”,
World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176.
15. Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K., Toida T.,
Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F. (2003), “ Cellular
Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate”,
The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp. 41003-41012.

16
16. Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C., Rouille Y.
(2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis”, Journal of
Virology, 80(14), pp.6964-6972.
17. Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L. (2005), “ The hepatitis virus
alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame
protein/F-protein, the double-frameshift, and others”, Seminars in liver disease 2005, 25(1),
pp.105-117
18. Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David H., Yawn
M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D. (1992), “ The declining risk of post-
transfusion hepatitis C virus in fection”, The new England Journal of Medicine, 327(6),
pp.369-373.
19. Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J. (2002), “
Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a
mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell line”, Insttutde Biologie delille/
Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex, France.
20. Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K. (2010), “
Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-loop-mediated
isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology Research, 4(23), pp.2580-
2586.
21. Friebe P., Bartenschlager R. (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’ nontranslated
region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”, Journal of Virology,

76(11), pp.5326-5338.
22. Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R. (2005), “ Kissing-loop interation in the 3’
end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication”, Journal of Virology,
79(1), pp.380-392.
23. Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K. (2011), “New treds of HCV
infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined from firt-time
volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52.
24. Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H. (1999), “ Determination of hepatitis C virus
genotype by direct sequence analysis of products generated with the amplicon HCV test”,
Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630.
25. Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V. (2008), “ Cellular
determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and seretion”, Journal of
Virology, 82(5), pp.2120-2129.

17
26. Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn J.M.,
Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P. (2001), “ Hepatitis C virus genotyping based
on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of Clinical Microbiology, 39(5),
pp.1771-1773.
27. Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J. (2007), “ Hepatitis C virus p7 protein is
localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a replication-competent
genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142.
28. Helle F., Dubuisson J. (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand Molecular
Life Sciences, 65, pp. 100-112.
29. Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M. (1999), “ A phylogenetically conserved stem-
loop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus is
required for cap-independent viral translation”, Journal of Virology, 83(2), pp.1165-1174.
30. Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma M. (1994), “
Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b region sequences”,
Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051.

31. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A. (2003), “
Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retro viral
particles”, 1230 York Avenue, New York.
32. James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D.,
Kenrad E. (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection”, The
new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.

33. Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V. (2007), “ Initiation of
hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and
scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383.
34. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. (1996), “ Identification of a highly conserved
sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”, Journal of Virology,
70(6), pp. 3363-3371.
35. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D., Neri B.P.,
deArruda M. (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in the United States by
Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of Clinical Microbiology, 35(12),
pp.3156-3162.

18
36. Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia J. (1999), “
High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of hepatitis C virus
RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332.
37. Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-louis S.,
Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R. (2004), “ Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the
Caribbean island of martinique: evidence for a large radiation of HCV for a recent
introduction from Europe of HCV-4”, Journal of Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791.
38. McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S., Medgyesi
G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-rasheed A.M. (1994),
“ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors : an international
collaborative survey”, Journal of Clinical microbiology, 32(4), pp.884-892.

39. Moradpour D., Cerny A., Heim M H., Blum H.E. (2003), “ Hepatitis C: an update”, Swiss Med
Wkly, 131, pp.291-298.
40. Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B. (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus isolates
indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of General Virology,
84, pp. 2333-2341.
41. Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong B.,
Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman P. (2009), “
Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology, 83(2), pp.1071-1082.
42. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L.,
Kolberg J., Urdea M.S. (1993), “ Classification subtype by phylogenetic analysis of the NS-5
rigion”, Journal of General Virology, 74, pp. 2391-2399.
43. Simmonds P. (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on”, Journal
of General Virology, 85, pp.3173-3188.
44. Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al. (2005), “ Consensus proposals for a unified system of
nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp. 962-973.
45. Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M. (2006), “ The
hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology, 80(23),
pp.11579-11588.
46. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al. (2001), “ Evidence for a new hepatitis C virus
antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710-721.
47. Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D. (2008), “ Comparative analysis of nearly full-length
hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break through during antiviral

19
therapy: clustered mutations in three functional genes, E2,NS2 and NS5a”, Journal of
Virology, 82(19), pp.9417-9424.
48. You S., Rice C.M. (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing partners
and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195.
Trang web
49.

50.
51.