Nghiên cứu sử dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar agar trong nuôi cấy mô thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG




ĐẶNG THỊ SÁU





NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL ALGINATE
LÀM GIÁ THỂ THAY CHO AGAR-AGAR TRONG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT




LUẬN VĂN THẠC SĨ





Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch
Mã số : 60.54.10
Người hướng dẫn khoa học : PGS-TS Ngô Đăng Nghĩa

Nha Trang – Tháng 06 năm 2008
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả trong luận
văn hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trên bất cứ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Đặng Thị Sáu
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô Khúc Thị An, thầy Trang Sỹ Trung và các
thầy cô trong bộ môn Chế Biến trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và có những
ý kiến đóng góp rất quý báu cho tôi trong quá trình làm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phan Ngọc Hùng trường Đại học Yersin Đà
Lạt, thầy Nguyễn Duy Hạng - Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã giúp đỡ và đóng
góp những ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Viện Công Nghệ Sinh Học trường
Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn

Đặng Thị Sáu



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1
DANH MỤC CÁC BẢNG 2
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ 2
DANH MỤC CÁC HÌNH 4
MỞ ĐẦU 5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE 6
1.1.1. Tổng quan về rong nâu 6
1.1.1.1. Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 7
1.1.1.2. Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam 8
1.1.2. Tổng quan về alginate 9
1.1.2.1. Cấu trúc alginate 9
1.1.2.2. Một số tính chất quan trọng của alginate 12
1.1.2.3. Tách chiết alginate 17
1.2. TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ 20
1.2.1. Lịch sử nuôi cấy mô 20
1.2.2. Các điều kiện nuôi cấy mô 21
1.2.2.1. Điều kiện vật lý 21
1.2.2.2. Môi trường nuôi cấy mô thực vật 22
1.2.3. Kỹ thuật vi nhân giống 25
1.3. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
27
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 27
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 27
1.4. TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂU TÂY 29

1.4.1. Sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây 29
1.4.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại của cây dâu tây 29
1.4.1.2. Đặc tính sinh học 30
1.4.2. Các phương pháp nhân giống dâu tây tại Đà Lạt 32
1.4.2.1. Phương pháp truyền thống 32
1.4.2.2. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô 32
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33
2.1.1. Alginate 33
2.1.2.Các hóa chất dùng trong tạo gel alginate 34
2.1.3. Vật liệu nuôi cấy mô 35
2.1.4. Môi trường nuôi cấy mô 36
2.1.5. Phòng thí nghiệm và các dụng cụ 37
2.1.6. Điều kiện nuôi cấy 38
2.1.7. Điều kiện kỹ thuật 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng của alginate 38
2.2.2. Các thí nghiệm kiểm tra tính chất lý hóa của hệ gel alginate 39
2.2.2.1. Xác định biến đổi pH của hệ gel alginate 39
2.2.2.2. Xác định độ bền của hệ gel alginate 40
2.2.3. Nghiên cứu ứng dụng hệ gel alginate trong nuôi cấy mô 41
2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường
đến tốc độ nhân chồi dâu tây 41
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
đến tốc độ nhân chồi dâu tây 42
2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA)
đến tốc độ nhân chồi dâu tây 43
2.2.2.4. So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và

giá thể agar 44
2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 44
2.2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 46
2.2.2.7. So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate
và giá thể agar 46
2.2.3. Phương pháp lấy các chỉ tiêu và xử lý số liệu 47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Kết quả nghiên cứu về tính chất ban đầu của alginate 49
3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc tính lý hóa của hệ gel alginate 49
3.2.2. Kết quả xác định pH của hệ gel alginate 49
3.2.3. Kết quả xác định độ bền hệ gel alginate 51
3.3. Kết quả các nghiên cứu về nuôi cấy mô dâu tây trên hệ gel alginate 53
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate đến công đoạn
nhân chồi dâu tây 53
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
đến tốc độ nhân chồi 56
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine
(BA) đến tốc độ nhân chồi 60
3.3.4. Kết quả so sánh nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 64
3.3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 67
3.3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường

đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 70
3.3.7. Kết quả so sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể agar và
giá thể alginate 72
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 83


1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
NT : Nghiệm thức
KTSTTV : chất kích thích sinh trưởng thực vật.
TB ± SE : trung bình ± độ lệch chuẩn
GDL : glucono-δ-lactone.
NAA : 1- NaphthlAcetic Acid.
IAA : Indol- 3- Acetic Acid.
IBA : Indol- 3- Butyric Acid.
Kinetin : 6-furfuryamino purine.
BA : 6-Benzylamino purine
MS : Murashige & Skoog, 1962.

2
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng Trang
1.1 Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới 12
1.2 Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của dung
dịch alginate natri ở 20
0
C
14
2.1 Bảng phân tích phương sai 48
3.1 Một số thành phần của alginate và agar nghiên cứu 49

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị Tên đồ thị Trang
3.1 Biến đổi pH của hệ gel alginate theo nồng độ GDL và CaCO
3
50

3.2 Biến đổi độ bền của hệ gel alginate theo nồng độ alginate và
CaCO
3
52
3.3a Số lượng chồi trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau

54
3.3b Chiều cao chồi trên giá thể alginate với các nồng độ khá c nhau. 54
3.3c Trọng lượng cụm chồi trên giá thể alginate với các nồng độ
khác nhau
54
3.4a Số chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO
3
khác nhau 57
3.4b

Chiều cao chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO
3
khác
nhau.
57
3.4c Trọng lượng cụm chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO
3


khác nhau.
57
3.5a Số lượng chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ BA
khác nhau.
61

3.5b Chiều cao chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ
BA khác nhau.
61
3.5c Trọng lượng cụm chồi tạo thành trên giá thể alginate với
nồng độ BA khác nhau.
62
3
3.6a Kết quả nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 65
3.6b So sánh khả năng nhân chồi dâu tây trên giá thể alginate và
agar sau 30 ngày nuôi cấy
66
3.7a Số rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ alginate 68
3.7b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 68
3.8a Số lượng rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3
khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy
70
3.8b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3

khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy
71
3.9a Kết quả tái sinh rễ trên giá thể alginate và giá thể agar 73
3.9b So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate
và giá thể agar.
75

4

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang
1.1 Cấu trúc của β-D- Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G
)
theo cổ điển.
10
1.2 Cấu trúc của β-D - Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G
)
theo hiện đại.

10
1.3 Mô hình block GGG; MMM và GMGMGM 11
1.4 Sự tạo gel của alginate theo mô hình vĩ trứng 16
1.5 Sơ đồ quy trình chung để sản xuất alginate 19
1.6 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống 26
2.1 Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S. mcclurei. 33-34
2.2 Công thức cấu tạo của GDL và gluconic acid 34
3.1 Hình mô phỏng tạo gel alginate khi có mặt của tác nhân GDL
và CaCO
3

51
3.2
Chồi dâu tây trên giá thể alginate ở các nồng độ khác nhau sau
30 ngày nuôi cấy
55
3.3 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3

khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy
58
3.4
Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ BA khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy.
63
3.5 Chồi trên giá thể alginate và giá thể agar sau 30 ngày nuôi cấy 64
3.6 Rễ cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy trên giá thể alginate với
các nồng độ khác nhau.
69

3.7 Rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3
khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy
71
3.8 Rễ dâu tây trên giá thể alginate và trên giá thể agar sau 30 ngày
nuôi cấy
74
5
MỞ ĐẦU
Sự phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực công nghệ sinh học trong những
năm gần đây, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ tế bào đã làm tăng nhu cầu và sự
tạo mới của nhiều tác nhân gel làm giá thể cho môi trường đặc trong nuôi cấy.
Trong suốt thập niên cuối thế kỷ XX các nhà khoa học thế giới đã có nhiều
nổ lực trong nghiên cứu và thử nghiệm để tìm ra một số cơ chất mới dùng trong
nuôi cấy mô. Một số cơ chất đã được thử nghiệm và sử dụng như: Plantgar
13
;
carragenan; alginate; Isubgol; Xyloglutan; tinh bột; Sago và Isubgol…Trong đó,
alginate là tác nhân gel có tính tương thích sinh học cao đã được các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu ứng dụng thành công trong nuôi cấy mô thực vật.
Nước ta được thiên nhiên ưu đãi về nguồn lợi rong biển, nguồn rong vô cùng
phong phú, với sản lượng lớn và chất lượng cao. Mặc dù vậy sự đầu tư phát triển
nuôi trồng, chế biến, khai thác, ứng dụng rong biển còn hạn chế và chưa có hiệu
quả. Đặc biệt loài rong mơ Sargassum ở các vùng biển Việt Nam, cho alginate có
hàm lượng guluronic khá cao, tức là khả năng tạo gel tốt. Do đó việc nghiên cứu để
ứng dụng hệ gel alginate từ nguồn rong này vào trong lĩnh vực công nghệ sinh học
là một vấn đề có ý nghĩa thực tiễn. Đến nay nước ta chưa có nghiên cứu nào về
dùng alginate chiết xuất từ rong nâu ở vùng biển Việt Nam trong nuôi cấy mô.
Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử

dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar-agar trong nuôi cấy mô thực vật”
do PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa hướng dẫn.
Mục đích của đề tài:
- Xác định được các thông số để tạo ra hệ gel alginate đồng thể có độ ổn
định cao, có pH phù hợp trong ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật.
- Thử nghiệm nuôi cấy mô thực vật trên giá thể gel alginate và so sánh hiệu
quả với gel agar chuẩn.
Khả năng áp dụng của đề tài: kết quả nghiên cứu thành công của đề tài góp
phần làm tăng phạm vi ứng dụng của alginate sản xuất từ rong Sargassum ở Việt
Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật.
6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE
1.1.1. Tổng quan về rong nâu.
Rong nâu tên gọi chung các loài rong thuộc ngành Phaeophyta, ngành này chỉ
có một lớp Phaeophyceae, gồm 265 chi và khoảng 1500 đến 2000 loài. [55]
Rong nâu cần có các vật bám nên nó mọc trên đá hoặc trên trên các chân đập,
cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác. Rong nâu
cần có đủ ánh sáng để quang hợp nên nó chỉ mọc ở vùng nước trong và ở độ sâu
không lớn lắm sao cho ánh sáng có thể xuyên qua được.
Một số loài rong nâu quan trọng trong công nghiệp alginate.[38]
Phaeophyceae

Laminariales Fucales

Laminariacea Alariacea Lessoniaceae Fucaceae Sargassaceae

Laminaria Ecklonia Macrocystis Ascophyllum Fucus Sargassum

L. digitata E. maxima M. pyrifera A . nodosum F.serratus
L.hyperborea
Loài Laminaria hyperborea được thu hoạch chính ở Pháp, Ireland, Na Uy và
Scotland. Loài Laminaria digitata có ở Pháp, Na Uy, Scotland. Trung Quốc là quốc
gia thành công nhất trong việc trồng rong Laminaria japonica, sản lượng hàng năm
của Trung Quốc lên đến một triệu tấn rong tươi, hai phần ba số đó dùng làm thực
phẩm, phần còn lại dành cho sản xuất alginate.
Loài Ascophyllum nodosum mọc ở Scotland và Ireland . Ngoài ra nó còn có ở
phía bắc Nova Scotia.
7
Loài Durvillaea antarctica mọc ở Chi Lê và loài Durvillaea potatorum ở Úc
được dùng để sản xuất alginate tại Anh và Hoa Kỳ.
Loài Ecklonia cava mọc ở độ sâu 20 m, phân bố tại Nhật Bản và Hàn Quốc.
Các loài thuộc chi Sargassum phân bố ven biển các nước như Trung Quốc,
Ấn Độ, Philippines, Việt Nam.
1.1.1.1. Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu.
Rong nâu có chứa các sắc tố fucoxanthin, xanthophyll, -carotene,
chlorophyll a, c
1
và c
2 .
Các sắc tố này xuất hiện với tỷ lệ khác nhau tùy theo loài.
Chúng còn biến động theo ánh sáng mặt trời, nhiệt độ nước và các nhân tố khác của
môi trường làm cho rong nâu có màu sắc khác nhau từ nâu -vàng nâu - nâu đậm -
vàng lục.[14],[21]
Các hợp chất dự trữ khác là mannitol, laminarin và lipid. Hàm lượng manitol
dao động trong khoảng 6,24÷ 16,74%, hàm lượng trung bình khoảng 6,78÷ 14%,
trong đó loài S. mcclurei có hàm lượng cao hơn cả vào tháng 4 đạt khoảng 15,9 %
so với trọng lượng khô. Hàm lượng manitol biến động theo thời gian sinh trưởng
trong năm, đạt cực đại vào lúc trưởng thành sau đó giảm dần.[21]

Các acid béo ở trong rong rất đa dạng. Aknin đã tìm ra và định danh 40 loại
acid béo, 10 loại sterol khác nhau từ 8 loài rong nâu ở vùng biển Senegal [30]
Hàm lượng protein trong rong nâu khá hoàn hảo. Hàm lượng protein trong rong
nâu ở vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05 ÷ 21,11% so với trọng lượng rong khô.
Hàm lượng iod trong một số loài rong nâu dao động từ 0,05÷ 0,16% so với
rong khô tuyệt đối. Các tháng mùa đông hàm lượng iod trong rong cao hơn trong
các tháng mùa hè.[14]
Thành phần hóa học quan trọng nhất của rong nâu là alginate. Alginate tồn tại
chủ yếu trong vách tế bào ở dạng muối không tan. Alginate còn được tìm thấy trong
tế bào chất.
Hàm lượng alginate biến đổi theo loài rong, độ trưởng thành, vùng sinh trưởng
và vị trí trên cây rong, lớn nhất là trên thân, rồi đến lá, phần ngọn và đế
(receptacles). Hàm lượng alginate đạt cực đại lúc cây rong đạt độ phát triển lớn
8
nhất. Các loài rong mơ Việt Nam hàm lượng acid alginic dao động trong khoảng
26,41÷ 47,16%. So với các loài rong nâu trên thế giới, rong mơ Việt Nam có hàm
lượng acid alginic khá cao, đây là một nguồn nguyên liệu để sản xuất alginate có ý
nghĩa thương mại.
Thành phần khoáng trong rong nâu rất đa dạng bao gồm các nguyên tố đa
lượng như K, Na, Ca, Mg, S, P, Cl, I và các nguyên tố vi lượng như Sr, Al, B, Fe,
Zn, Cu, Mn, Mo,…Rong nâu còn có khả năng tích tụ một số nguyên tố như Sr 90,
Cs 137 là những chất liên quan đến các chất thải phóng xạ. Hàm lượng khoáng của
các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và
thời kỳ sinh trưởng.[14]
1.1.1.2. Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam
Họ rong mơ (Sargassaceae) tại Việt Nam thuộc bộ rong đuôi ngựa
(Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyta). Đây là nhóm rong có kích thước cá thể
lớn, chiều dài có thể lên đến 8m, sinh lượng có nơi đạt đến 12kg rong tươi trên một
mét vuông. Hình dạng của chúng rất giống thực vật bậc cao, sinh sản hữu tính hoặc
sinh dưỡng. Rong mơ bám vào vật bám như đá, san hô, nhờ đĩa bám hay hệ thống

rễ bò phân nhánh. Thân cây rong gồm một trục chính ngắn, khoảng trên dưới 1cm.
Từ đỉnh trục chính sẽ phân ra các nhánh chính, hai bên nhánh chính sẽ mọc ra nhiều
nhánh bên. Trên các nhánh có cơ quan sinh dưỡng, tại đó xảy ra sự quang hợp
giống như lá của thực vật bậc cao mà người ta gọi là tản hay giả diệp (frond, blade).
Rong mơ còn có các nang chứa khí gọi là phao. Khi rong trưởng thành, trên các
nhánh bên sẽ mọc ra các nhánh ngắn mang các cơ quan sinh sản đực và cái, được
gọi là đế . Đế có kích thước khá nhỏ nên khó nhận ra.
Ở miền Bắc, rong mơ tập trung nhiều ở Quảng Ninh, Hải Phòng, Thanh Hóa,
Nghệ Tĩnh [4], ở miền Trung, rong mơ phân bố nhiều ở Đà Nẵng, Quảng Nam,
Quảng Ngãi, Quy Nhơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Phan Thiết và Vũng Tàu [7]
Theo Nguyễn Hữu Đại [7], sản lượng rong mơ các tỉnh ven biển miền trung
ước tính 30.000 tấn rong tươi/năm, trong đó quan trọng nhất là Khánh Hòa, Quảng
Ngãi, Ninh Thuận, Qui Nhơn, Quảng Nam, Đà Nẵng.
9
Thời điểm rong đạt mức tăng trưởng cực đại phụ thuộc vào điệu kiện sinh
sống. Ở nơi sóng mạnh, nước nông, rong phát triển sớm, còn ở nơi nước sâu, rong
mọc chậm hơn. Do đó, thời điểm khai thác sẽ khác nhau.
Loài S. Mcclurei tập trung ở ven biển các tỉnh miền trung. Loài rong này dài
1-2m, có khi đến 4m khi mọc ở sâu. Đĩa bám rộng khoảng 1cm, thường mọc liên
kết 2-3 đĩa bám chung. Đĩa bám có xẻ thùy nhưng không sâu. Trục chính hình trụ
ngắn khoảng 1cm. Nhánh chính nhiều từ 3-5, hình trụ, không có gai, to khoảng 1,5÷
2mm. Các nhánh bên mọc cách nhau 3÷ 7cm, dài 20cm. Lá hơi dày và dai chắc hình
bầu dục, dài 1÷ 3cm, mép lá có răn cưa. Cây có nhiều phao.
S. mcclurei thích nghi rộng với các dạng vật bám và điều kiện môi trường khác
nhau. Chúng có thể mọc lên cao đến vùng triều thấp hay xuống sâu đến 4÷5m tùy điều
kiện môi trường và vật bám nhưng thường bị giới hạn bởi dãi san hô và đá mềm ở độ
sâu 2÷ 4m. Chúng có thể mọc trên vách đá dốc đứng hay bãi san hô bằng phẳng.
Chu kỳ sống của S. mcclurei là một năm. Kể từ lúc rong bắt đầu mọc (tháng
9 đến tháng 1) S. mcclurei có xu hướng tăng trưởng chậm về chiều dài, giai đoạn
này tương ứng với việc rong hình thành giai đoạn phát triển trục chính. Từ tháng 1

trở đi các nhánh chính của rong phát triển nhanh về chiều dài và đạt kích thước tối
đa vào tháng 4, giai đoạn này tương ứng với thời kỳ rong phát triển nhanh chóng
các nhánh thứ cấp. Sau khi đạt kích thước tối đa, rong sẽ dần tàn lụi vào các tháng
sau đó. Do đó để đạt được sản lượng khai thác lớn cũng như bảo tồn được rong,
rong nên được khai thác vào cuối tháng 4 đầu tháng 5 [24]
1.1.2. Tổng quan về alginate
1.1.2.1. Cấu trúc của alginate
Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Alginic là một
polyme mạch thẳng được cấu tạo từ 2 gốc monome là β-D-Mannuronic acid (M) và
α-L-Guluronic acid (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid. Trên phân tử
alginic số lượng M và G không theo tỷ lệ 1/1, tỷ lệ này khác nhau tùy thuộc vào
từng loại rong, vị trí địa lý, mùa vụ khai thác và vị trí trên thân rong dùng để tách
chiết alginate. Tỷ lệ M/G là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo gel của alginic.
10
Theo công thức cổ điển Haworth thì cấu tạo của 2 monome chỉ khác nhau ở
nhóm cacboxyl nằm trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza.[14],[62]



Hình 1.1: Cấu trúc của β-D- Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic
acid (G) theo cổ điển.
Theo quan niệm hiện đại, hai gốc Uronic đó có cấu tạo dạng ghế nhưng có
cấu hình khác nhau, acid Manuronic có cấu hình
4
C
1
, còn acid Guluronic có cấu
hình
1
C

4
. Như vậy, ở cả hai cấu hình nhóm cacboxyl đều gắn vào vòng pyranoza ở
vị trí xích đạo.








Acid -D- mannuronic Acid -L- guluronic
Hình 1.2: Cấu trúc của β-D-Mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid
(G) theo hiện đại.
Sự liên kết giữa 2 uronic này không phải ngẫu nhiên mà tạo thành 3 loại
block như sau:
Block homopolyguluronic : gồm các gốc acid guluronic nối tiếp với nhau
theo dạng GGGG.
O

O

COOH

COOH
HOOC

OH

OH

OH

OH


OH

OH

OH

OH

11
Block homopolymanuronic: gồm các gốc aicd manuronic liên kết với nhau
theo dạng MMMMM.
Block luân hợp: (Alternating) gồm các gốc acid guluronic và aicd manuronic
liên kết luân phiên với nhau theo dạng MGMGMGMG







G block

M block







MG block
Hình 1.3: Mô hình block GGG; MMM và GMGMGM
Cấu trúc các block cho thấy, chuỗi polyG có dạng nếp gấp còn chuỗi polyM
có dạng phẳng. Chính đặc thù này sẽ quy định tính chất khác nhau của chúng khi
kết hợp với các ion đa hóa trị.
O

COO
_

COO-

COO
_

COO
_

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

O


O

O

O

O

0,87 nm

O

HO

COO
-

COO
_

COO
_

OH

O

O

HO

O

O

O

1,03 nm

o

12

Như vậy, alginate được xem là một copolyme block. Độ dài trung bình của
mạch phân tử, độ dài của mỗi chuỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng khác
nhau theo nguồn gốc của alginate. Điều này làm cho alginate có tính chất biến đổi
trong một dãi rộng.[45]
Để đặc trưng cho thành phần hóa học của alginate, trước đây người ta chỉ
dựa vào tỷ lệ mol của 2 gốc monome cấu tạo nên alginate, tức tỷ lệ M/G nhưng tỷ lệ
này chưa đủ để mô tả chi tiết sự phức tạp trong cấu tạo alginate.
Bảng 1.1 : Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới. [14]
Loài rong Tỷ lệ M/G
Macrocystis Pyrizera (Mỹ)
Lamanria Digitata (Nhật)
Eisenia Bryclis (Nhật)
Azeophyllum Nodium (Bắc Âu)
S. Polycystum
Aldrich
1,55
1,45
1,6
1,6
1,04
1,5

Để đặc trưng sâu xa hơn cho cấu trúc tinh tế của alginate người ta đưa ra các
khái niệm về tần suất các khúc đôi (diad) , khúc ba (triad)…Như vậy, alginate sẽ có
4 khúc đôi đó là MM, GG, MG, GM và 8 khúc ba đó là : MMM, MMG, GMM,
GMG, GGG, GGM, MGG, MGM. Bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân,
người ta đã xác định được tần suất của các diad, triad của phân tử alginate. [21],[35]
1.1.2.2. Một số tính chất quan trọng của alginate
a. Khối lượng phân tử và độ nhớt của dung dịch alginate.
Hầu hết các loại alginate thương mại có khối lượng phân tử trung bình trên

150.000 tương ứng với độ polyme hóa dP khoảng 750. Alginate, giống như các
polysaccharid khác là một polyme đa phân tán theo khối lượng phân tử của nó. Về
mặt này, nó giống một polyme tổng hợp hơn là một polyme sinh học như protein
hay acid nucleic. Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của alginate được
tính bằng gía trị trung bình của phân bố khối lượng phân tử.
13
Nếu gọi N
i
là số phân tử, w
i
là khối lượng của các phân tử có cùng khối lượng
phân tử M
i
, thì giá trị trung bình số và giá trị trung bình khối của khối lượng phân tử
alginate được tính như sau:
M
n
=

N
i
M
i
/

N
i

M
w

=

w
i
M
i
/

w
i
=

N
i
M
i
2
/

N
i
M
i
Tỷ số M
w
/ M
n
được gọi là chỉ số đa phân tán PI. Đối với alginate , chỉ số PI
nằm trong khoảng từ 1,4 đến 6 tùy theo loài rong và phương pháp tách chiết. Sự
phân bố khối lượng phân tử cũng như cấu trúc phân tử có liên quan đến tính chất và

ứng dụng của alginate [56]
Các đoạn mạch ngắn giàu mannuronic sẽ không tham gia quá trình tạo gel và
do đó dễ thất thoát ra khỏi hạt gel.
Acid alginic không tan trong nước nhưng nó có khả năng hấp thụ một lượng
nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão. Ngược lại, alginate natri và các
muối K
+
, NH
4
+
, (CH
2
OH)
3
NH
+
của alginate tan trong nước và tạo thành dung dịch
có độ nhớt cao. Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt
dung dịch của nó càng lớn. Alginate natri với độ nhớt từ 200-400 mPa.s là loại được
sử dụng rộng rãi nhất.
Khi còn nằm trong vách tế bào, alginate có độ nhớt rất cao nhưng khi tách
chiết bằng các phương pháp khác nhau, nó bị giảm độ nhớt. Độ nhớt là một trong
những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của alginate.
Dung dịch 1% của alginate thương mại có độ nhớt nằm trong khoảng 20-
2000mPa.s. Độ nhớt dung dịch alginate phụ thuộc vào bốn yếu tố chính:
- Mức độ polyme hóa tăng làm tăng độ nhớt.
- Nồng độ tăng thì độ nhớt tăng
- Nhiệt độ tăng thì độ nhớt giảm
- Dung dịch trong nước cứng hoặc có mặt của các chất điện ly sẽ ảnh hưởng
đến độ nhớt của alginate.[31]

14
Bảng 1.2: Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của
dung dịch alginate natri ở 20
0
C [21], [38]
Nồng độ alginate Loại alginate
1% 1,5% 2% 3% 4%
Độ nhớt rất thấp 10 20 45 130 350
Độ nhớt thấp 20 60 180 650 2200
Độ nhớt trung bình 350 1800 6000 Không đo được
Độ nhớt cao 800 4000 9000 Không đo được

Độ nhớt dung dịch alginate phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng độ
nhớt giảm khoảng 2,5% cho một độ C. Khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp
hơn ban đầu một ít. Tuy nhiên, nếu duy trì nhiệt độ 50
0
C trong nhiều giờ thì sẽ làm
alginate cắt mạch và giảm độ nhớt. Trái lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông đặc và rã
đông thì không làm giảm độ nhớt của alginate.
Độ nhớt của alginate khá ổn định trong khoảng pH =5-11. Khi pH thấp hơn 5
thì các ion -COO
-
bắt đầu bị proton hóa thành –COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa
các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hidro, làm độ nhớt
tăng. Khi pH giảm sâu hơn khoảng từ 3 đến 4 sẽ tạo thành gel. Nếu alginate có
chứa một ít ion Ca
2+
thì sự tạo gel xẩy ra sớm hơn, khoảng pH 5. Nếu pH giảm
nhanh đến 2 thì kết tủa acid alginnic hình thành. Khi pH trên 11, alginate sẽ bị

depolyme hóa từ từ và làm giảm độ nhớt. Liên kết glycosid rất nhạy cảm với cả acid
và kiềm, do đó dưới các điều kiện thuân tiện cho việc thủy phân, alginate sẽ bị cắt
mạch rất nhanh chóng. Ngoài ra, tác dụng oxi hóa bởi các gốc tự do cũng làm cho
dung dịch alginate bị giảm độ nhớt.[56]
Độ nhớt của alginate còn phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, hàm lượng các
ion đa hóa trị trong alginate và nguồn gốc của rong.
Một vấn đề cần lưu ý là bột alginate natri khô, ở nhiệt độ thường sẽ bị cắt
mạch và giảm khối lượng phân tử chỉ sau vài tháng. Nếu hạ nhiệt độ và bảo quản
nơi tối, sẽ duy trì được lâu hơn. Nếu đông sâu có thể bảo quản vài năm mà không
15
làm giảm đáng kể khối lượng phân tử. Ngược lại, acid alginic khô rất kém ổn định ở
nhiệt độ thường do nó bị thủy phân dưới tác dụng của sự thủy phân nội phân tử do
acid xúc tác.
Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị tiêu hóa bởi một số loại
vi sinh vật. Enzyme thủy phân alginate ngoại bào được phân lập từ đất, biển, các
loài nhuyễn thể có thể cắt mạch liên kết glycosid do phản ứng -elimination
Dung dịch alginate là một dung dịch phi Newton, độ nhớt của nó biến thiên
theo tốc độ trượt [39]
Tốc độ trượt càng cao, độ nhớt của nó càng giảm. Do đó, khi đo độ nhớt của
alginate bằng nhớt kế rotor, cần phải ghi chú tốc độ quay của rotor. Thường người
ta đo độ nhớt dung dịch alginate 1% (w/v) ở 20
0
C hoặc 25
0
C với tốc độ quay của
rotor là 60 vòng /phút (rpm).
b. Tính chất gel của alginate
Khi có mặt của các ion kim loại hóa trị 2, 3 trở lên dung dịch alginate sẽ tạo
gel. Các gel này được hình thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào cho đến
100

0
C và chúng không tan chảy khi đun nóng. Gel của alginate có rất nhiều ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là gel canxi alginate. Đã có
nhiều công trình nghiên cứu về sự tạo gel của alginate canxi nhưng mô hình được
chấp nhận rộng rãi nhất hiện nay là mô hình vĩ trứng (egg-box model) được minh
họa trên hình 1.4.
Do cấu trúc đặc biệt của đoạn mạch GGG nó tạo thành dạng nếp gấp như
một cái vĩ trứng. Khoảng không gian tạo thành giữa các vĩ khi xếp lên nhau tương
tự như chổ đặt quả trứng, điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống này
khá phù hợp với kích thước của ion Ca
2+
. Các ion có kích thước lớn hơn ion Ca
2+
sẽ
cho liên kết mạnh hơn còn các ion có kích thước nhỏ hơn sẽ không tạo gel theo mô
hình này. Ái lực của ion đối với alginate theo thứ tự như sau:
Pb
2+
> Cu
2+
>Cd
2+
>Ba
2+
>Sr
2+
> Ca
2+
>Co
2+.

[12]
Tuy vậy, sự liên kết của ion canxi với các nhóm chức của alginate cụ thể ra
sao vẫn còn nhiều bàn cãi. Trước đây, người ta cho rằng ion canxi chỉ liên kết với
16
hai nhóm carboxyl của hai gốc guluronic nằm trên hai đoạn mạch khác nhau nhưng
gần đây, một số công trình nghiên cứu sâu hơn cho thấy có sự liên kết phức tạp hơn
với cả các nhóm hydroxyl [ 58]
Một cách tổng quát, mô đun đàn hồi của gel alginate phụ thuộc vào số lượng
và độ bền của các liên kết ngang, vào chiều dài và độ cứng của các chuỗi tham gia
liên kết. Khi khối lượng phân tử lớn, mô đun đàn hồi không phụ thuộc vào khối
lượng phân tử nữa [42,44]



Hình 1. 4: Sự tạo gel của alginate theo mô hình vĩ trứng
Khi nghiên cứu gel alginate canxi, người ta nhận thấy mô đun đàn hồi phụ
thuộc mạnh mẽ vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronate. Alginate có
block G nhiều và dài sẽ cho gel bền hơn. Mô đun đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion
17
tạo liên kết ngang, do đó ái lực giữa cation liên kết ngang và polyme càng lớn thì
gel càng bền. Độ bền gel còn phụ thuộc vào thời gian và các yếu tố của môi trường [51].
1.1.2.3. Tách chiết alginate
Alginate được Standford tách chiết ra lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1881
từ rong nâu Laminaria stenophyllum. Năm 1927 Thernley thành lập một công ty để
sản xuất alginate cho ngành đồ hộp tại San Diego Hoa Kỳ. Vào năm 1929, công ty
được tổ chức lại thành Kelco Company. Ở Anh, alginate được sản xuất lần đầu bởi
công ty Alginate Industries Ltd vào năm 1934. Ở Na Uy alginate được sản xuất sau
chiến tranh thế giới thứ hai. Đến năm 1981 sản xuất alginate lan sang nhiều nước
trên thế giới, tổng cộng có khoảng 17 nhà máy trên 9 quốc gia trên thế giới sản xuất
alginate. Hai công ty sản xuất alginate lớn nhất thế giới là Kelco Company của Mỹ

và công nghiệp sản xuất alginate ở UK, chiếm 70% sản lượng alginate trên thế giới.
Công ty lớn tiếp theo là Protan A/S của NaUy, rồi đến các công ty của Pháp, Nhật
Bản và Trung Quốc.
Việc nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta được thực hiện lần đầu tiên vào
năm 1961 dùng để hồ sợi. Năm 1966, bộ môn Chế biến trường đại học Thủy sản đã
tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa
trên vải. Quy trình sản xuất alginate natri đã được đúc kết trong Hội nghị alginate
natri tại Uỷ ban Khoa Học Kỹ thuật Nhà Nước tháng 11 năm 1981[2]
Trong báo cáo này, quy trình sản xuất với các thông số kỹ thuật cũng như
định mức tiêu hao nguyên vật liệu đã được đúc kết. Sau đó, vào năm 1982, Trần
Văn Ân trong luận án phó tiến sĩ đã đẩy việc nghiên cứu sâu hơn trong việc cải tiến
quy trình tách chiết alginate. Gần đây tác giả Ngô Đăng Nghĩa nghiên cứu tối ưu
hóa công đoạn tách chiết alginate từ rong nâu S. Kjellmanianum và S. mcclurei ở
vùng biển Hòn Chồng-Nha Trang với phương pháp acid hóa và xử lý bằng formol.
Đối với rong mơ S. mcclurei có nguồn gốc Hòn Chồng - Nha Trang thì tác giả sử
dụng chế độ nấu chiết như sau: nồng độ Na
2
CO
3
1,54-1,68 %; tỷ lệ dung dịch 20 lần
rong khô, nhiệt độ nấu chiết 55-60
0
C, thời gian nấu chiết 1,15-2,2giờ. Tác giả Trần
Thị Luyến và cộng sự cũng đã nghiên cứu tách chiết alginate cho hai loài rong
18
S. Kjellmanianum và S. mcclurei ở vùng biển Hòn Chồng- Nha Trang theo quy
trình canxi hóa. Xử lý bằng CaCl
2
0,1%, nhiệt độ 45
0

C, thời gian xử lý 1giờ, tỷ lệ
dịch CaCl
2
so với rong là 24/1, sau đó nấu chiết và xử lý tẩy trắng.[14]
Nguyên tắc để tách chiết alginate: Alginate tồn tại trong rong nâu phần lớn
dưới dạng muối của ion hóa trị hai không hòa tan như Ca
2+
, Mg
2+
. Cần phải xử lý
acid để chuyển alginate sang dạng acid alginic. Sau đó nấu chiết trong dung dịch
kiềm Na
2
CO
3
, acid alginic sẽ trao đổi ion và trở thành dạng alginate natri hòa tan
vào dung dịch. Sau đó lọc sạch cặn bã rong không tan, ta sẽ thu được phần dịch
chứa alginate natri. Vấn đề tách alginate ra khỏi dịch nấu chiết dẫn đến 2 quy trình
khác nhau:
Một quy trình tách alginate ở dạng muối alginate canxi không tan và tách ra
khỏi nước, sau đó muối alginate canxi được chuyển về dạng acid alginic.
Một quy trình tách alginate ở dạng gel acid alginic kết tủa. Hai quy trình chỉ
khác nhau căn bản có một khâu canxi hóa. Sở dĩ người ta dùng thêm khâu canxi hóa
là vì alginate canxi dễ ép tách nước hơn acid alginic.

19
Rong nâu

Xử lý sơ bộ

Rửa

Nấu chiết trong kiềm

Dịch chiết alginate natri

Pha loãng

Lọc thô

Lọc tinh

Hình 1.5 : Sơ đồ quy trình chung để sản xuất alginate [21].
A. Quy trình canxi hóa

Canxi hóa

Gel alginate canxi

Tẩy trắng

Acid hóa

Tách nước

Trung hòa

Sấy khô

Nghiền

Bột alginate Na
B. Quy trình acid hóa

Aicd hóa

Gel acid alginaic

Lọc kết tủa

Tách nước

Trung hòa, tẩy trắng, loại nước
(Ethanol, NaOH, NaOCl)

Sấy khô

Nghiền

Bột alginate Na