NGHIÊN cứu sự đa DẠNG DI TRUYỀN của một số GIỐNG đậu TƯƠNG có KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH gỉ sắt KHÁC NHAU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
Vũ Thanh Trà
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ
NĂNG
KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 70 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
:
1. PGS.TS.
Chu Hoàng
Mậu
2. TS.
Trần Thị Phương
Liên
Thái Nguyên - 2012
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các
số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong
luận án này.
Thái Nguyên, ngày
tháng năm 2012
Tác giả luận án
Vũ Thanh Trà

ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và
TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập,
nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn
Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn
dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã
ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh.
Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang
thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng
Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào
thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng
thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa
Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên).
iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình viii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Cây đậu tương và và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.1. Cây đậu tương
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9
1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương
1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái
1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học
1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA
1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Máy mọc và thiết bị
2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo
4459
1111
2
223333
44
iv
2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh
2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA
2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương
nghiên cứu
3.2. Phân tích đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 58
3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của
các giống đậu tương nghiên cứu
3.2.2. Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của
một số giống đậu tương
3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng
khác nhau với bệnh gỉ sắt 64
3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân
tử RAPD
3.3.2. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị
phân tử SSR
3.4. Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản
ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt
3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu
tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
3.4.2. Lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều
3.4.3. Nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu tương bằng kỹ
thuật điện di hai chiều
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99
1. Kết luận 99
2. Đề nghị 100
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO 102
4
4
455
667
77

79
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
µl
2DE
AFLP
APS
AUDPC
Microliter
Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều
Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các
phân đoạn được nhân bản
Ammonium persulfate
Area Under Disease Progress Curve
Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh
AVRDC
Bp
CHAPS
Cm
CTAB
DNA
dNTPs
DTT
EDTA
ESI-Q
TRAP
EtBr
HPLC
IAA
IEF

IMA
INTSOY
IPG
IRRI
Kb
Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát
triển rau màu Châu Á, Đài Loan
Base pair
3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio]
Centimeter
Cetylmethylammonium bromide
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleotide Triphosphates
Dithiothreitol
Ethylendiamine tetra acetic acid
Elecspray ionization Q Trap - Phương pháp khối phổ sử dụng tính
năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử
Ethidium bromide
High-performance liquid chromatography-Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Indole-3-acetamide
Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện
Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria
International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu
tương Quốc tế, Hoa Kỳ
Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định
International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc
tế, Philippin
Kilo base
vi
kDa

mA
MAS
ml
MS/MS
NST
OD
PCR
PEG
PIC
PMSF
PR protein
QTL
R gen
R protein
RAPD
RFLP
RNA
SAR
SDS
SDS-
PAGE
SSR
TAE
TCA
TEMED
UPGMA
V
w/v
Kilo Dalton
MiliAmpe

Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử
Mililiter
Mass spectrometry/ Mass spectrometry - khối phổ liên tục
Nhiễm sắc thể
Optical Density - Mật độ quang học
Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase
Polyethylene glycol
Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình
Phenylmethanesulphonylfluoride
Pathogenesis-related protein - protein liên quan đến mầm gây bệnh.
Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng
Resistant gen – gen kháng bệnh
Resistant protein - protein kháng bệnh
Ramdom amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân
bản ngẫu nhiên
Restriction fragment length polymorphism - đa hình về chiều dài
phân đoạn cắt hạn chế
Ribonucleic acid
Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống
Sodium dodecyl sulfate
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis -Điện di biến tính trên
gel polyacrylamide có SDS
Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản
Tris acetate EDTA
Trichloracetic acid
N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine
Phương pháp phân nhóm
Volt
Weight/volume
vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR
Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide
Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt
Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương
Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương
Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống DT2000 được
nhận diện bằng phương pháp khối phổ
Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm
và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK)
Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí
nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK
Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh
gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống
kháng (DT2000, CBU8325)
Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm
với và giống kháng bệnh gỉ sắt
3
334455
6
6
7
8
9

99
9
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 2.1.
Hình 2.2.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.
Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh
bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (A)
Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P. pachyrhizi chụp
dưới kính hiển vi điện tử
Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm
Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2DE
Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng
thí nghiệm
Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry
Lá của các giống đậu tương với 3 mức độ phản ứng với bệnh
gỉ sắt
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18
Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương
đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân
nhóm UPGMA
Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt
005 (D) của 50 giống đậu tương
Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản
ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR
Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá
đậu tương VMK, CBU8325 đối chứng và nhiễm bệnh ở hai
giống đậu tương DT12 và VMK 9 ngày tuổi
1111445666777
ix
Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu
tương giống DT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B)
So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống
DT12, DT2000, CBU8325 và VMK
Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký -
khối phổ
Hình 3.11. Phân nhóm chức năng hệ protein lá đậu tương giống DT2000
Hình 3.12. So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm
của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK)
Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9
ngày của hai giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2
giống kháng bệnh gỉ sắt (DT2000 và CBU8325)
7
8
8

8
9
9
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có
giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt
có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tương
chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế (lysine,
leucine, tryptophan, methionine, cysteine…), 12-25% lipid và các vitamin
(B1, B2, C, D, E, K…) cần thiết cho cơ thể. Các sản phẩm từ đậu tương được
sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực
phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị
dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R.
Japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần. Vì thế, việc trồng
cây đậu tương không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn có tác dụng cải
tạo đất. Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính
được ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc.
Việt Nam từng là một nước “xuất khẩu” đậu tương vào những năm
1980 theo hạng mục tiểu ngạch, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành
nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn hàng triệu tấn khô dầu đậu tương
đang được nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng
năm nhưng năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng
chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói
riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm
năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế.
Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và
đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây

thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở
2
nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Yêu cầu đặt ra hiện nay là cần
phải chuyển giao các tiến bộ khoa học kỹ thuật đặc biệt là tạo ra những giống
cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở
rộng diện tích gieo trồng và nâng cao chất lượng hạt, đáp ứng được nhu cầu
đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu. Do đó, nghiên cứu chọn
tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải
pháp mang tính chiến lược cho sự phát triển bền vững.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã
được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các
nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh,
nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng
bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt
cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng
kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này. Việc nghiên
cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối
với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng
kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có
chất lượng cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng
kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ
sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới.
2.2. Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu
tương nghiên cứu.
3
2.3. So sánh đa hình protein, lập được bản đồ điện di protein lá đậu tương, sơ

bộ rút ra được nét đặc trưng về protein giữa giống kháng và giống nhiễm.
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương.
- Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt
của các giống đậu tương nghiên cứu.
- Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu
bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR.
- Lập bản đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá
bằng phương pháp điện di một chiều, hai chiều và nhận diện protein trên hệ
sắc ký-khối phổ. Đồng thời phân tích, so sánh sự đa dạng thành phần protein
lá của một số giống đậu tương nhiễm và kháng bệnh gỉ sắt.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae).
Chi Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Chi phụ Soja có hai loài là
G.max (L.) Merrill và G. soja Sieb. et Zucc. Glycine soja là dạng mọc leo
hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản lượng thấp nên không được sử dụng trong
nông nghiệp. Glycine max không thấy mọc hoang dại.
Về nguồn gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á, có thể mọc hoang
dại từ thung lũng sông Dương Tử, các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung
Quốc, hoặc các vùng kế cận của Cộng hòa liên bang Nga, Triều Tiên và Nhật
Bản. Hầu hết các giống đậu tương địa phương đang trồng tại nước ta hiện nay
đều du nhập từ Trung Quốc [8].
Về đặc điểm hình thái, cây đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá
mầm (lá tử diệp), lá nguyên (lá đơn) và lá kép, mỗi lá kép có từ 3 - 4, thậm
chí đến 5 lá chét, mọc so le. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng
cánh bướm, có màu sắc tuỳ từng giống khác nhau: màu trắng, tím, tím nhạt.

Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi
cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có
diệp lục) khi chín có màu nâu. Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 -
400 quả. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt có giá trị
dinh dưỡng cao. Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000
hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g. Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau
là một biểu hiện đặc trưng của giống [9].
Về đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể
(NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo.
5
Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương
có từ 1,29 x 10
9
đến 1,8 x 10
9
bp cho bộ đơn bội. Trong số đó có khoảng 40 -
65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb),
các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb)
được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95].
Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm
(từ 75 - 78 ngày); chín trung bình (từ 80 - 100 ngày) và chín muộn (từ 110
- 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây
trồng luân canh hay xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều
kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ
khác nhau [3]
.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương
Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Thực tế cho
thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein

trong hạt của loài thực vật này nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của
nhiều loài thực vật khác [6]. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng
cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình
nảy mầm của hạt. Loại potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin.
Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu thành 3 loại: 11S
- legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Những loại protein chính trong hạt đậu
tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzyme, các chất ức
chế protease và lectin. Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%),
globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin -
protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7%.
Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần:
conglyxinin (7,9S) và glyxinin (12,2S). Conglyxinin là vixilin của đậu tương,
6
có hệ số lắng là 7,9S, là protein dự trữ phổ biến trong hạt. Conglyxinin tách
biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của
hạt. Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn carbon và
nitơ cho hạt phát triển. β-conglyxinin là một trong những cấu tử của
conglyxinin, có khối lượng phân tử là 140 - 180 kDa. β-conglyxinin gồm có
nhiều tiểu phần khác nhau, trong đó có 3 tiểu phần chính là α (76 kDa), α’
(72 kDa), β (53 kDa). Ngoài ra, còn có các tiểu phần nhỏ khác hiếm hơn đã
được mô tả là α’, γ, δ [94]. Thành phần thứ hai là glyxinin với hệ số lắng
12,2S và là dạng legumin của đậy tương. Glyxinin là protein chứa nhiều nhất
trong đậu tương. Glyxinin là một hexamer protein gồm 5 tiểu phần. Mỗi tiểu
phần bao gồm một chuỗi polypeptide có tính acid (trọng lượng phân tử xấp xỉ
31 - 45 kDa) ký hiệu là A1a, A1b, A2, A3, A4 và chuỗi polypeptide có tính
kiềm (khối lượng phân tử xấp xỉ 18 - 20 kDa) ký hiệu là B1b, B1a, B2, B3,
B4, được nối với nhau bằng cầu nối disulfide [114]. Các giống đậu tương
khác nhau cũng khác nhau về thành phần các chuỗi polypeptide cấu tạo nên
glyxinin. Glyxinin của các giống khác nhau đã được chứng minh là khác nhau
về thành phần amino acid, trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric

point-pI). Tỷ lệ giữa glyxinin và β-conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ
3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống). Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và
được tích trữ trong quá trình hình thành phôi.
Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi
là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa
tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein
của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ
cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine,
cysteine vẫn còn thấp [3].
7
1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạt đậu tương
Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà
tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như
ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả Lipid còn là thành phần quan trọng của
màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể. Ở đậu tương, hàm
lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu
tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến
thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là
vitamin E (200 mg/100g lipid). Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một
số chất khác như carbohydrade, muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh
trưởng [3]. Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao. Giá trị của
nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm
lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho
hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức
ăn cho gia súc. Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau.
Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là
hạt đậu tương có màu đen.
1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậu tương
Protein là các đại phân tử có ở lượng lớn trong tất cả các loại tế bào và
các bào quan. Protein lá đậu tương rất đa dạng, có hàng nghìn loại với kích

thước phân tử khác nhau, từ những peptide nhỏ đến những phân tử với khối
lượng lớn. Protein có nhiều vai trò khác nhau về chức năng sinh học, nhưng
chủ yếu đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp giúp tổng hợp chất
dinh dưỡng từ nguồn năng lượng ánh sáng mặt trời.
Hệ protein (Proteome) là phần bổ trợ của hệ gen (Genome), hệ protein
lá đậu tương bao gồm tất cả các protein có mặt trong tế bào lá ở một thời
điểm nhất định. Trong lá có các protein liên quan đến chu trình quang hợp,
8
các protein tham gia vào phản ứng quang hóa, các protein dự trữ, các enzyme,
các chất đề kháng, chất oxi hóa Ở các mô khác nhau, các giai đoạn khác
nhau hệ protein lại có sự khác nhau. Vì hệ protein lá rất phong phú, đa dạng
và không ổn định như hệ gen của cây đậu tương cho nên nghiên cứu hệ
protein lá không hề đơn giản và đòi hỏi sự kết hợp của rất nhiều công nghệ và
kỹ thuật [68], [86], [100].
Chức năng chính của lá thực vật là thu nhận năng lượng ánh sáng,
chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học. Do đó, có một
số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá
trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Các protein lá đậu tương có
liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như PSI reaction centre subunit,
PSII oxygen-evolving complex protein, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các
enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như Rubisco,
malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase, phosphoglycerate
kinase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố
định carbon. Ngoài ra, protein lá đậu tương có thể là các protein dự trữ như
vegetative storage protein, stem 28 kDa protein, cyclophilin hoặc các protein
có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid
hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress như ascorbate
peroxidase, catalase.
1.1.2.4. Một số nghiên cứu về hệ protein lá đậu tương

Gần đây, các nghiên cứu về hệ protein thực vật sử dụng phương pháp
điện di 2 chiều (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33],
[58], [74], [86], [92]. Một số nghiên cứu tập trung vào hệ protein của các bào
quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực
vật như lá ngô [92], lá đào [101]. Các nghiên cứu trên rễ đậu tương [116]
9
hoặc trên hạt đậu tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86],
tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai.
Trong nghiên cứu của Sarma và cộng sự, các tác giả đã thành công trong việc
phân tách hàng trăm các protein của các mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử
dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiều [100]. Trong khi đó,
Krishnan và cộng sự đã nghiên cứu hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp
điện di 2 chiều và khối phổ, các tác giả đã phát hiện được 28 loại
phosphoprotein trong lá [68]. Tương tự trong nghiên cứu của Xu và cộng sự,
bằng phương pháp điện di và khối phổ các tác giả đã phân tách được 119
điểm protein trong đó đã nhận diện được 71 protein ở lá đậu tương [113]. Đây
là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn, bằng việc áp dụng các kỹ thuật proteomics
(kỹ thuật nghiên cứu, phân lập, tách chiết, phân tách và nhận diện cấu trúc,
chức năng của hệ protein) các tác giả đã gợi ý các ứng dụng trong việc xác
định các protein kháng bệnh.
Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế.
Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và lập bản đồ hệ protein lá đậu
tương còn ít được công bố [113]. Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án
này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và lập bản đồ hệ protein của lá
đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.2.1. Bệnh gỉ sắt
ở cây đậu tương
Bệnh gỉ sắt do nấm
Phakopsora pachyrhizi

gây ra là một trong những
bệnh chính trên cây đậu tương (
Glycine max
) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng
kể về năng suất ở các nước
trồng
đậu tương. Hầu hết các nước nhiệt đới và cận
nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương.
Bệnh gỉ sắt (soybean rust) được phát hiện đầu tiên vào năm 1902 ở Nhật Bản sau
đó lan nhanh sang hầu hết các nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ [80] và Mỹ
10
[102]. Các phát hiện về bệnh gỉ sắt ở Hawaii năm 1994 [67], Zimbabwe năm
1998 [69], Nigeria năm 1999 [28], Nam Mỹ năm 2001 [93], và Argentina năm
2002 [99] cho thấy nấm P. pachyrhizi vẫn đang lan tràn sang các vùng địa lý
mới và ảnh hưởng nghiêm trọng đến mùa màng. Bệnh gỉ sắt được coi là mối đe
dọa chính đối với năng suất đậu tương tại Mỹ [102]. Ở Brazil, bệnh này gây thiệt
hại 1,2 tỷ đô la chỉ riêng trong năm 2003 [115]. Tại các nước bệnh đã trở thành
dịch, năng suất đậu tương có thể giảm từ 10% đến 80% [90].
Về mầm bệnh, bệnh gỉ sắt ở đậu tương do hai loài nấm là P. pachyrhizi
và P. meibomiae gây ra. Loài nấm gỉ sắt ở Châu Á P. pachyrhizi Sydow là
loài gây hại nhất cho đậu tương và có độc tính cao hơn loài P. Meibomiae
(hình 1.2). Nấm gỉ sắt là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế
giới cũng như ở Việt Nam. Nấm gỉ sắt là loại nấm ký sinh phá huỷ lớp tế bào
bao bọc làm cho cây bị thoát hơi nước mạnh, các bộ phận cung cấp nước
không thể tiếp tế đủ số nước bị mất đi, dẫn đến mất cân bằng giữa lượng nước
hút vào và lượng nước thoát hơi, kết quả cây đậu tương bị héo.
A
B
Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử
nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) [118]

11
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: Nấm gỉ sắt phát triển trên tế bào và có
mặt ở hầu hết các vụ cây trồng, nhưng bệnh chỉ phát sinh và phá hại nặng
nhất trong vụ đậu tương xuân. Bệnh gây hại nặng nhất ở lá, nhưng cũng có
thể ở trên thân, cành và quả. Biểu hiện sớm nhất của bệnh là những chấm màu
trong ở phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới
kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh (Hình 1.1A). Các vết
bệnh có thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng, làm cho
phiến lá bị rách nát. Ở mặt dưới phiến lá, nơi có vết bệnh, xuất hiện lớp bột
màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm. Khi bị nấm tấn công, trong mỗi đốm lá
bị tổn thương có nhiều vết nứt, hoặc các ổ bào tử hạ (uredinia) màu nâu đỏ
bên trong chứa các bào tử hạ (urediniospore) hình oval, màu sẫm, bề mặt có
nhiều gai nhỏ (hình 1.1B và 1.2). Các thể bào tử sẽ được giải phóng từ các lỗ
nhỏ hoặc vết nứt trên mặt lá. Bệnh gỉ sắt phát sinh ở các lá già gần mặt đất, sau
lan lên các bộ phận khác ở phía trên của cây. Tác hại của bệnh gỉ sắt là làm cho
lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng quang hợp, gây rụng lá hàng loạt dẫn
đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao. Từ khi cây đậu tương có 5-6 lá và
nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và sau đó phát triển kéo
dài tới khi thu hoạch. Nấm xâm nhiễm cả vào quả làm cho hạt không thể phát
triển bình thường. Do đó, năng suất và phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút
nghiêm trọng. Những ruộng bị bệnh nặng hầu như không cho thu hoạch. Bệnh
gỉ sắt thường tập trung cao điểm vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 20 -
28
0
C và cây đậu có từ 3 lá kép đến khi thu hoạch quả. Đặc điểm này liên quan
tới sự tích luỹ và biến động hàm lượng protein và amino acid trong các giai
đoạn sinh trưởng ở các tuổi cây khác nhau [6].
12
Hình 1.2. Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P. pachyrhizi chụp dưới
kính hiển vi điện tử [118]

Vòng đời và quá trình nhiễm bệnh: Ở loài nấm P. Pachyrhizi có hai
dạng bào tử là bào tử hạ (urediniospore) và bào tử đông (telliospore) [37].
Bào tử hạ là dạng phổ biến được phát hiện thấy ở các mùa vụ, chúng phát
tán, lây lan trên đồng ruộng. Giai đoạn bào tử hạ có thể lặp lại nhiều lần
tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Khi gặp điều kiện không thuận lợi hoặc
vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây, trên vết bệnh có thể hình thành ổ
bào tử đông màu đen. Bào tử đông đơn bào, hình oval hoặc hình cầu có
núm, vỏ dày, kích thước 24-35µm x 20-29µm. Bào tử đông đóng vai trò là
nguồn bệnh bảo tồn cho vụ sau. Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ
nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đường kính
5-400 µm) cho đến khi sợi áp (appressorium) hình thành. Ổ bào tử hạ
thường phát triển từ 5-8 ngày, tối đa lên đến 4 tuần sau khi lây nhiễm, quá
trình sinh bào tử có thể kéo dài đến 3 tuần. Từ khi lây nhiễm cho đến khi
hình thành bào tử có thể kéo dài đến 15 tuần. Thậm chí dưới điều kiện khô
hạn, quá trình này còn diễn ra dài hơn.
13
1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng và vật
gây hại trong môi trường sống. Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo
mô hình tương tác gen đối gen (gen for gen) [49]. Theo đó, để xuất hiện tính
kháng bệnh ở cây cần có gen trội hoặc bán trội ở cây (dominant resistance
gene) và cả gen không gây hại cũng mang tính trội (dominat avirulence gene)
ở vật ký sinh. Tuy nhiên cho đến nay, cơ chế kháng bệnh gỉ sắt và sự tương
tác giữa mầm bệnh và cây chủ vẫn cần nhiều nghiên cứu để làm sáng tỏ.
Theo giả thiết, sau khi bị nhiễm bệnh gỉ sắt, cây đậu tương sẽ có các
phản ứng tự vệ. Hiện tượng tự vệ có thể do hệ thống SAR (Systemic acquired
resistance) với sự tham gia của nhiều nhóm protein liên quan đến mầm bệnh
(Pathogenesis-related protein - protein PR) hoặc protein kháng (Resistant
protein - protein R) đảm nhận [44]. Cụm gen R đã được phát hiện ở nhiều loài
như lúa [105], Arabidopsis [34], [78], ngô [60], và đậu tương [51], [54], [66].

Cho đến nay, có nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được
phát hiện [73]. Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi lây
nhiễm bệnh từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn,
kháng nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm
bệnh [10], [44]. Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein
Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được
chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác
nhau [44],[64], [73]. Protein Avr có nhiều loại và là các protein nhỏ có trong
giác mút của sợi nấm được tiết vào tế bào thực vật cùng với các protein khác
qua các màng giác mút. Protein R trong nguyên sinh chất của cây chủ nhận
biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế bào thực vật [39].
Ở cây lanh (Linum usitatissimum) kháng nấm gây bệnh gỉ sắt, protein
AvrL567 của nấm gây bệnh được nhận biết bằng các protein kháng của cây
14
chủ như protein L4, protein L6 và protein L7, hoặc các protein AvrM, AvrP4
của nấm được nhận biết bằng các protein M và P4 của cây chủ [46]. Ngoài ra,
từ sợi nấm, protein Avr cũng có thể xâm nhập vào nguyên sinh chất và tương
tác với protein R theo các cách khác nhau như hình 1.3.
Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm
Tại Trung tâm phát triển Rau màu Châu Á (AVRDC), việc xác định
tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu
tương
là một mục tiêu quan trọng với
hơn 9000 dòng đậu tương đã được sàng lọc. Cả tính kháng làm giảm tốc độ
phát triển, tính kháng chuyên biệt và tính chống chịu đều xuất hiện trên chất
mầm (germ plasm)
của
cây đậu tương
[79].
Đặc tính kháng bệnh gỉ sắt của đậu tương là không ổn định và khá phức

tạp [79]. Chúng có thể do một hoặc một số gen trội quyết định và được di
truyền cho thế hệ sau theo các quy luật di truyền cơ bản hoặc có thể là di
truyền theo qui luật tương tác đa gen. Ví dụ, trong 3 cặp lai (UPSL 13 x
Brogg, UPSL 85 x Harelec, UPSL - 3 x Clacrk 63), các giống làm mẹ là
những giống kháng cả bệnh gỉ sắt và bệnh virus gây vàng lá, các giống làm bố
là các giống năng suất cao và mẫn cảm với bệnh. Sự phân ly ở F2 cho kết quả
có một quần thể tuân theo tỷ lệ 3:1 (3 kháng: 1 nhiễm), hai quần thể khác