Phân lập tuyển chọn các chủng của bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 5
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15
Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16
Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30]
16
Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24] 16
Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16
Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17
Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17
Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng 17
Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu
đất 28
Bảng 4.2: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập
33
Bảng 4.3 : Kết quả đo bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi
khuẩn phân lập (mm) 36
Bảng 4.4 : Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng
37
Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 38
Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme protease của KTC1 41
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3
Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26
Hình 4. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn phân lập được 32

Hình 4.2. Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 34
Hình 4.3 : Vòng phân giải casein của chủng KTB2, KTB4, KTC1 36
Hình 4.4 : Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 39
Hình 4.5: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40
Hình 4.6: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme protease của KTC1 42
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DIỄN GIẢI
h giờ
MPA Malt-Peptone-Agar
OD Optical Density
VSV Vi sinh vật
MỤC LỤC
PHẦN 1
MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Ý nghĩa của đề tài 2
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện 3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái 4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy 4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá 5
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 5
2.2. Giới thiệu về enzyme protease 6
2.2.1. Tổng quan về enzyme Protease 6
2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease 7

2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 8
2.2.4. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật 9
2.2.5. những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus
nói chung và Bacillus subtilis nói riêng 12
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Đối tượng khảo sát 14
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 14
3.2.1. Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14
3.2.2. Địa điểm 14
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 14
3.3.1. Hóa chất 14
3.3.2. Thiết bị và dụng cụ 14
3.3.3 Môi trường sử dụng 15
3.4. Nội dung nghiên cứu 18
3.5. Phương pháp thực hiện đề tài 18
3.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 18
3.5.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và
tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 26
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28
4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28
4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus
subtilis 32
4.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease
35
4.2.1 Kết quả khảo sát vòng phân giải của 10 chủng phân lập được 35
4.2.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của 3 chủng KTB2,

KTB4, KTC1. 37
4.3. Kết quả nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp
enzyme prorease của vi khuẩn KTC1. 38
4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1. 38
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1 39
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng
và tạo enzyme của chủng vi khuẩn KTC1 41
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
5.1. Kết luận 43
5.2. Kiến nghị 43
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học
đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống vật chất
càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà
sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của
người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn
nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta
hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay
thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học là một dạng
thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thông qua việc cải
tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột. Tác dụng của chế phẩm sinh học là làm tăng
khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở
manh tràng và đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có
độc tính (Lã văn kính, 1998) [7]. Protease là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi
trong chế phẩm sinh học. Người ta có thể thu enzyme protease từ nhiều nguồn khác

nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên thu enzyme từ cơ thể động vật
hay thực vật thì rất khó khăn và tốn kém vì thường phải phá bỏ tổ chức để thu
enzyme và quá trình bảo quản rất phức tạp. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là
vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzyme có hoạt tính cao. Chúng lại có khả năng
chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại
thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzyme từ các nguồn
nguyên liệu khác nhau hẳn [12].
Vì vậy vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất tiềm năng. Trong các nguồn thu
protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis vì loài vi khuẩn này rất phổ biến dễ phân lập, thu enzyme và enzyme
thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn (Nguyễn Thị Hiền và cs 2004) [7].
1
Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Phân lập tuyển
chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở
cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh
protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
Phân lập được loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn được chủng có
khả năng sinh protease. Biết và hiểu rõ hơn về các thoa tác kĩ thuật cũng như các thông
số quy trình công nghệ trong quá trình thực hiện đề tài.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu càng cao
của ngành chăn nuôi.
2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi
tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ
cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,
thực phẩm [9].
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
- Đặc điểm phân loại:
Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19]. Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
/>3
- Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn
chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu
CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus
subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử
và tế bào Bacillus subtilis [19].
2.1.3. Đặc điểm hình thái
- Đặc điểm hình thái tế bào
Bacillus subtilis là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5 -
0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di
động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa
tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt
của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia

phóng xạ [1].
- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Trên môi trường thạch đĩa MPA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Trên môi trường thạch nghiêng MPA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn
gợn sóng.
Trên môi trường gelatin: khuẩn lạc phát triển và làm tan chảy gelatin.
Trên thạch khoai tây: khuẩn lạc phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
Trên môi trường canh MPA: khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển
làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên
khó tan đều. [1].
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu
trong môi trường thiếu oxy. Chúng phát triển tốt trên môi trường MPA với nhiệt độ
tối ưu là 37
o
C, pH = 7,0 - 7,4 [19].
4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+),
catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính catalase +

Sinh indol -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)[9]
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các
chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là
một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi
chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm. Bào tử khác tế bào
dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý [1].
5
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào
tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử
theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh
dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) [1].

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử [1].
2.2. Giới thiệu về enzyme protease
2.2.1. Tổng quan về enzyme Protease
Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử
protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton.
Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên
kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là
các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và
vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức
năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều
đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và
động vật (gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật protease vi sinh
vật có những đặc điểm rất khác biệt. Trước hết hệ enzyme protease của vi sinh vật
là 1 hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối
lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng đồng nhất. Cũng do đó
6
nên protease visinh vật thường có tính đặc hiệu cao, cho sản phẩm thủy phân triệt
để và đa dạng [2].
2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH
của phân tử protein và peptid thành các axit amin tự do và một ít peptid khối lượng
phân tử nhỏ [12].

Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các
protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Hiện nay có nhiều
cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì.
2.2.2.1 Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này được chia thành 4
phân nhóm phụ
- Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ của
mạch polypeptid.
- Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của
mạch polypeptid.
- Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid.
- Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
2.2.2.2 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme
Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004)[12], protease được chia thành 4 nhóm
nhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúc
tác trong trung tâm hoạt động của enzyme.
- Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của serine
trong trung tâm hoạt động. Các protein serine này thường hoạt động ở vùng pH
kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
- Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của axit
amin cystein ở trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung
tâm hoạt động của enzyme, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia
nhiều biến đổi hoá học
7
- Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (-COOH) trong
trung tâm hoạt động. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng PH là axit, bị ức
chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các
axit amin có vòng thơm hoặc axit amin kị nước ởcảhai phía của liên kết peptit bị
thủy phân.
- Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm hoạt
động của chúng có những ion kim loại. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng

pH trung tính.
2.2.2.3 Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease
Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004) [12], dựa vào pH hoạt động của các
protease người ta chia protease ra thành 3 loại:
- Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8.
- Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9.
- Protease trung tính.
Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của Cơ
chất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein,
hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào.
Theo Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005 [15], các protease nội bào có thể có vai trò
quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để
tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn Cacbon, nito, lưu huỳnh.
8
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có
thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide
đã được tổng hợp. Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các
protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật.
2.2.4. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật
Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những

enzyme ngoại bào. Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về hình dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nên
rất khó tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme
khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu cao và cho sản phẩm
thủy phân triệt để và đa dạng. Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu được
nhiệt độ cao hơn các nguồn khác nên được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
như: công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp v.v… [2].
2.2.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Theo Lương Đức Phẩm (2007) [17]. Protease của vi khuẩn được sử dụng
trong quá trình chế biến cá. Ở mang cá, đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất
phong phú. Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá protease có trong ruột cá
thủy phân một phần protein của cá Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ
làm tăng hương vị của sản phẩm.
Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt sau
khi chế biến. Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng
hương vị thịt. Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có
trong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản
phẩm phụ khác. Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy
phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da và để sản xuất thức ăn
kiêng).
9
Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat. Protease
làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat
khác nhau. Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin. Vì thế, ta có thể
giảm giá thành trong sản xuất phomat [7].
Dùng protease của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành khác
nhau như : vecni, chất màu, hương liệu Nó cũng được sử dụng trong sản xuất
chao và các dịch thủy phân.
2.2.4.2. Trong công nghiệp nước giải khát
Protease được sử dụng để làm trong bia và nước ép trái cây. Được sử dụng

trong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm
amylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột [7].
2.2.4.3. Trong công nghiệp thuộc da
Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra
khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm và
sạch lông hơn [12].
2.2.4.4. Trong mỹ phẩm
Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm,
kem bôi mặt Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn. các
loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như:
vết máu khá tốt [12].
2.2.4.5. Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vật
nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến
hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng
protease để xử l ý sơ bộ thức ăn [17].
2.2.4.6. Trong nghiên cứu khoa học
Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein
2.2.4.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học
Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng. Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị
tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzyme.
10
Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để
chữa bệnh nghẽn tỉnh mạch. Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết
thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp [12]
2.2.4.8. Trong xử lý rác
Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượng
chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rất
nhanh. Theo tính toán của công ty công trình đô thị I, mỗi ngày người Hà Nội thải

ra khoảng 1500m
3
rác. Mỗi năm, một người dân ở thành phố Hồ Chí Minh trung
bình thải ra 160 kg rác. Như vậy, khối lượng rác mà thành phố thãi ra mỗi năm là
360000 tấn. Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổ
vào các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc
chất gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoa
màu. Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó thương
hàn tồn tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày.Rác không
được dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường phố, tạo môi
trường tốt cho ruồi muỗi và các loài trung gian truyền bệnh khác phát triển. Hiện
nay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt cho nhà mát phát
điện hoặc nhà máy hơi công nghiệp. Khi đốt như thế các chất thải là các chất tổng
hợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như SO
2
, SO
3
, P
2
O
5
, NO, NO
2
, CO gây hại cho
sức khỏe.
Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý rác
bằng con đường sinh học. Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật.
Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên
Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn protein động vật
và thực vật có trong rác hữu cơ [16]. Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống,

đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành.
Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá
thể trồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu
tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây
11
trồng. trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có
thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi
sinh vật. Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50
o
C. Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra
nhanh hơn người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces,
Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium.
Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu Cơ
cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hooc môn) công suất 5 tấn/ ngày. Tại đây ủ
phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật. Các điều kiện
bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác.
Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt động
của vi sinh vật làm cho rác hoại kỹ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng.
2.2.4.9. Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan khác
nhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp. Nó sẽ phân giải và hòa tan lớp
nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại
các loại phim và giấy ảnh quí.
2.2.5. những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ
Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng.
2.2.5.1 Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thu nhận protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm sinh học phục vụ cho con
người và các động vật.
Năm 2009 Ghafoor A và cộng sự đã nghiên cứu Chủng Bacillus subtilis AG-

1 và EAG-2, thu enzyme protease ngoại bào [22].
Năm 2002 Joo HS và cộng sự đã nghiên cứu khả năng tối ưu hóa việc sản xuất
một protease kiềm ngoại bào từ vi khuẩn Bacillus Horikoshi [32].
Năm 1999 Mehrotra S và cộng sự đã nghiên cứu Sản xuất protease kiềm bởi
các loài vi khuẩn Bacillus [31].
12
2.2.5.2 Ở Việt Nam
Năm 1995 Lê Đức Mạnh và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận và bảo quản
protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis [14].
Năm 2004 Đỗ Thị Bích Thủy đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên
khả năng sinh protease của Bacillus subtilis [20].
Năm 2013 Trần Ngọc Hùng, Lê Phi Nga đã nghiên cứu thu Protease từ
Bacillus subtilis sử dụng trong chế phẩm sinh học trong chăn nuôi [10].
Năm 2010 Nguyễn Văn Rư và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy và thu enzyme
protease từ chủng Bacillus subtilis.
Năm 2009 Nguyễn Thị Trần Thụy đã nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn
Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.
Năm 2009 Phan Trương Hương Thảo đã nghiên cứu thu nhận và khảo sát một
số đặc tính của enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
Năm 2007 Bùi Thị Phi đã nghiên cứu phân lập khảo sát đặc điểm sinh học và
tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử
nghiệm chế phẩm sinh học.
13
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng khảo sát
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh protease phân lập từ đất tại
thành phố Thái Nguyên.
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
3.2.1. Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014

3.2.2. Địa điểm
Bộ môn công nghệ vi sinh – Viện Khoa Học sự sống – Đại Học Nông Lâm
Thái Nguyên.
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.3.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Xuất xứ STT
Tên hóa
chất
Xuất xứ
1
Pepton Tây Ban Nha
8
KH
2
PO
4
Mỹ
2
Cao thịt Tây Ban Nha
9
CH
3
COONa Trung Quốc
3
Cao nấm men Pháp
10
MgSO
4

.7H
2
O Trung Quốc
4
Glucose Trung Quốc
11
MnSO
4
.H
2
O Trung Quốc
5
Agar Việt Nam
12
NaCl Trung Quốc
6
Phenol Tây Ban Nha
13
HCl Trung Quốc
7 Triammonium
citrate
Trung Quốc
14
NaOH Trung Quốc
3.3.2. Thiết bị và dụng cụ
3.3.2.1. Thiết bị sử dụng
Đề tài đã sử dụng các thiết bị nghiên cứu liệt kê trong bảng 3.2.
14
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Xuất xứ STT Tên thiết bị Xuất xứ

1
Nồi hấp
thanh trùng
Sanyo-Nhật
9
Lò vi sóng Bio-RAD-Mỹ
2 Tủ sấy
MMM Medcenter
Einrichtungen
GmbH-Đức
10
Tủ lạnh sâu
(-80
o
C)
Sanyo-Nhật
3 Tủ ấm
MMM Medcenter
Einrichtungen
GmbH-Đức
11
Máy đo quang
phổ
Bio-RAD-Mỹ
4
Tủ cấy vi
sinh
Euroclone S.p.A-
Bio Air Division-
Italia

12
Máy khuấy từ
(máy vortex)
Sartorius AG-
Đức
5 Máy ly tâm Sartorius AG-Đức
13
Cân điện tử
Sartorius AG-
Đức
6 Máy lắc Hàn Quốc
14
Cân phân tích
Sartorius AG-
Đức
7 Tủ lạnh
Sanyo-Nhật
15
Máy đo pH
Sanyo-Nhật
8 Kính hiển vi Sartorius AG-Đức
3.3.2.2. Các dụng cụ nghiên cứu
Các dụng cụ khác được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: micropipette 10-
100µl, 100-1000µl (Mỹ), đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống
eppendorf, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, giá eppendorf….
3.3.3 Môi trường sử dụng
- Môi trường phân lập, nuôi cấy và bảo quản các chủng kiểm định: môi
trường MPA dạng thạch và MPA dịch thể.
15
Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch

Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 5g Agar 18g
Pepton 10g Nước cất 1 lít
NaCl 5g pH 7
Hấp khử trùng ở 121
0
C trong 15 phút
Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30]
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Pepton 0,20 g MnSO
4
.4H
2
O 0,10g/l
Casein 4,00g NaCl 3,00g
Glucoza 0,05g K
2
HPO4 1,50g
KH
2
PO4 1,50g Agar 15,00g
Nước cất 1000ml hấp Khử trùng ở 121
o
C 1atm/15 phút
Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24]
Môi trường cơ sở
Thành phần Hàm lượng
Pepton 5,0g/l
Cao nấm men 2,5g/l
Glucose 10g/l

Nước 1000ml
hấp khử trùng ở 121
o
C 1atm/15 phút pH 5,5 – 7,8
Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 5,00g
Pepton bột 10,00g
Đường maltose 10,00g
Phenol red 0,01g
Nước cất 1000ml
pH = 6,7 – 7,1, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
16
Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar
Thành phần Hàm lượng
Sodium citrate 2,00g
K
2
PO
4
1,00g
MgSO
4
0,20g
Brothynol blue 0,08g
NaCl 5,00g
NH
4

H
2
PO4 1,00g
Agar 18,00g
Nước cất 1000ml
pH 6,9 ± 0,2, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 3g
Pepton bột 5g
NaNO
3
1g
Agar 7g
Nước cất 1000ml
pH = 7,0 ± 0,2, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 1g
Pepton bột 10g
Manitol 10g
NaCl 10g
Phenol Red 0,0025g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
hấp khử trùng ở 121

o
C 1atm/15 phút, pH = 7,2 ± 0,2
Khử trùng ở 121
o
C/15 – 20 phút. Khi môi trường nguội đến 50
o
C thêm 12,5
ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều rồi phân vào đĩa petri vô trùng Cách pha
dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng bên ngoài trứng bằng cồn. Dùng
17
kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào bacher có chứa 25 –
30ml nước muối sinh lý vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở 4
o
C để dùng.
Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs
Thành phần Hàm lượng
Pepton bột 7g
Glucose 5g
KH
2
PO
4
5g
Nước cất 1000ml
pH = 6,7 – 7,1, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
- Các dung dịch
+ Dung dich xanh metylen Loeffler
Rượu etylic : 300ml

Xanh metylen : 20g
Hòa tan hổn hợp trên rồi lọc trong :
Dịch lọc : 30ml
KOH 1% : 1ml
Nước cất : bổ sung đến 1000ml
+ Đỏ trung tính 0.5%
Đỏ trung tính : 0.5g
Nước cất : bổ sung đến 100ml
Lọc trong trước khi dùng
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
+ Quan sát hình thái khuẩn lạc
+ Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào
+ Thử các phản ứng sinh hóa để tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
- Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh protease cao
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh
trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được.
3.5. Phương pháp thực hiện đề tài
3.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
18
3.5.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới.
Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô
trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10
-1
.
3.5.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phân lập từ đất theo phương pháp của Nguyễn Lân
Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] như sau:
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự

từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có
nồng độ pha loãng 10
-1
cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được
nồng độ pha loãng 10
-2
, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn
các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10
-3
,10
-4
, 10
-5
dùng micropipete hút 0,1 ml từ
mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường MPA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và
trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa MPA này vào tủ ấm ủ ở
37
o
C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc
nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống
lại trên môi trường MPA nghiêng.
3.5.1.3 Phương pháp giữ giống và cấy chuyển
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường
thạch nghiêng trong ống nghiệm theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và
Hoàng Đức Nhuận (1976) [3].
Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống
nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng và cấy zich zắc trên bề
mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 37
o
C, sau 24h thấy xuất hiện

khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4
o
C giữ giống.
Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
3.5.1.4 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA theo
phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3]
19