Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng, môi trường và một số hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây gừng núi ðá (zingiber purpureum roscoe

LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu ảnh hưởng của chất khử trùng, môi trường và một số hợp chất hữu cơ tự
nhiên đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây Gừng Núi Ðá (Zingiber
purpureum Roscoe)” tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Khoa
CNSH-CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên.
Hiện nay, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đại học. Được kết quả như ngày
hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa
cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, tạo
điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài
của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Lanh
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ADN : Acid deoxyribonucleic
B1 : Thiamin
B3 : Nicotinic acid
B5 : Gamborg’s
B6 : Pyridoxine
BA : 6-Benzylaminopurine
Cồn : C
2
H
5

OH
CV : Coefficient of Variation
Đ/C : Đối chứng
HSN : Hệ số nhân
IAA : Indol axetic acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LSD : Least Significant Difference Test
MT : Môi trường
MS : Murashige and Skoog’s
NAA :
α
- Naphlene axetic acid
TLMTS : Tỷ lệ mẫu tái sinh
TN : Thí nghiệm
WPM : Woody Plant Medium
DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng
HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy) 20
Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường MS, B5, WPM đến
khả năng tái sinh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 22
(sau 20 ngày nuôi cấy) 22
Bảng 4.4:Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy) 24
Bảng 4.5:Kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả
năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 27
(sau 8 tuần nuôi cấy) 27
Bảng 4.6: Kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết cà rốt đến
khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 30
(sau 8 tuần nuôi cấy) 30

Bảng 4.7: Kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây và
cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 32
(sau 8 tuần nuôi cấy) 32
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cây và hoa Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe) 3
Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất
khử
trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy) 19
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử
trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy) 20
Hình 4.2: Ảnh: Kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng
tạo mẫu Gừng Núi Đá sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá 21
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy) 21
Hình 4.3: Biểu đồ thể hiện kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường
MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Gừng Núi Đá 22
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 20 ngày nuôi cấy) 22
Hình 3: Ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 20 ngày nuôi cấy). 23
Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện kêt quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa
đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 25
(sau 8 tuần nuôi cấy) 25
Hình 4.4: Ảnh: Kết quả TN ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy) 26
Hình 4.5: Biểu đồ thể hiện kêt quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết
khoai tây đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá(Zingiber purpureum
Roscoe.) 28
(sau 8 tuần nuôi cấy) 28
Hình 4.5: Ảnh: Kết quả TN ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả

năng nhân nhanh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 28
(sau 8 tuần nuôi cấy) 28
Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
dịch chiết cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy) 30
Hình 4.6: Ảnh: Kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết
cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
31
(sau 8 tuần nuôi cấy) 31
Hình 4.7: Biểu đồ thể hiện kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
dịch chiết khoai tây và cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá 32
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy) 32
(HSN: 2,30 lần; ++) (HSN: 2,43 lần; ++) (HSN: 2,83 lần; ++) (HSN:
1,57 lần; +)
Hình 4.7: Ảnh: Kết quả TN nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết
khoai tây và cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá 33
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy) 33
MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 1
1.3. Yêu cầu nghiên cứu 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về Gừng Núi Đá 3
2.1.1. Phân loại 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái 3
2.1.3. Đặc điểm của hoa 4

2.1.4. Đặc điểm của củ 4
2.1.5. Đặc điểm phân bố 4
2.1.6. Sinh thái, trồng trọt 4
2.1.7. Thành phần hóa học 5
2.1.8. Tác dụng dược lý 5
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.2.1. Khái niệm về nuôi cây mô tế bào thực vật 6
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 7
2.3.1. Auxin 7
2.3.2. Cytokinin 8
2.4. Tình hình nghiên cứu cây Gừng Núi Đá ở Việt Nam và trên thế giới 9
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 10
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 10
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 10
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 10
3.3. Hóa chất và thiết bị 10
3.3.1. Hóa chất 10
3.3.2. Thiết bị 10
3.4. Nội dung nghiên cứu 11
3.4.1. Nội dung nghiên cứu 11
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 12
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu 16
3.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi 16
3.5.2. Phương pháp xử lí số liệu 17
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu

sạch nấm, vi khuẩn cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 18
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo vật
liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 18
4.1.2.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến
khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn 19
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 21
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng
nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 23
4.3.1.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân chồi Gừng Núi
Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 24
4.3.2.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng nhân chồi
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 27
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết cà rốt đến khả năng nhân
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 30
4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây và cà rốt đến
khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) 32
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
5.1. Kết luận 34
5.2. Kiến nghị 34
PHẦN 6
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
6.1. Tài liệu tham khảo tiếng Việt 35
6.2. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 36
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Họ gừng bao gồm khoảng 47 chi và hơn 1.000 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới
và cận nhiệt đới, chủ yếu ở nam và đông nam châu Á. Ở Việt Nam, hiện biết gần 20
chi và gần 100 loài [3], [11]. Từ đời Minh Trung Quốc, nhà y học nổi tiếng Lý Thời

Châu đã viết trong cuốn “Bản thảo Cương mục” như sau: “gừng đắng mà không hôi
tanh có thể xua tà, đuổi ác, có thể ăn sống, ăn chín, ngâm giấm, làm tương, ngâm
muối, xào với mật, đường. Cũng có thể làm rau, làm kẹo, làm thuốc rất có lợi”. Nước
gừng tính hơi ôn có công dụng long đờm, chữa ho. Vỏ gừng tính mát có công dụng
hòa tỳ vị, tiêu viêm, sưng. Gừng khô tính nhiệt, dùng ấm có công dụng giải hàn, trừ
tỳ vị hư hàn. Lá gừng tính ôn có công dụng hỗ trợ tiêu hóa, hoạt huyết, tiêu nhỏ, có
thể chữa ăn nhiều thịt không tiêu, làm tiêu vết bầm tím khi ngã, [9]. Ngày nay, cùng
với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, cây gừng có tác dụng đặc biệt đã được phát
hiện và nghiên cứu. Cụ thể như: hoạt tính kháng virus, chống oxi hóa và kháng
khuẩn [18]; tăng cường nhận thức tiềm năng cho phụ nữ trung niên [21]. Tuy nhiên
nguồn gen cây họ gừng đang có nguy cơ mất mát nhanh do sự khai thác quá mức.
Theo Quyết định số 80/2005/QĐ- BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn từ năm 2005 cây Gừng Núi Đá đã được xếp vào nhóm giống cây thực phẩm
quý hiếm cần được bảo tồn [10]. Vì vậy, cây Gừng Núi Đá rất cần có định hướng
bảo tồn đúng đắn để phục vụ xã hội trong tương lai.
Ở Việt Nam, mới chỉ có một số nghiên cứu lẻ tẻ về phân loại thực vật và bảo
tồn tại các gia đình, còn các nghiên cứu sâu về chọn tạo nhân giống và lưu giữ bảo
quản gừng in vitro hầu như chưa có nghiên cứu nào được thực hiện. Vì vậy chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng, môi
trường và một số hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)”. Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn
thiện quy trình nhân giống các loài gừng nói chung và Gừng Núi Đá nói riêng để bảo tồn
và tạo ra số lượng cây giống lớn, sạch bệnh, đồng đều phục vụ cho sản xuất.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng, môi trường và một số hợp chất hữu
cơ tự nhiên đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây Gừng Núi Đá (Zingiber
purpureum Roscoe.)
1
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
Xác định được chất khử trùng, nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng

cho hiệu quả tạo mẫu Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) vô trùng cao nhất.
Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
Xác định được ảnh hưởng của một số hợp chất hữa cơ (nước dừa, dịch chiết
khoai tây và dịch chiết cà rốt) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Gừng
Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân
giống cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bảo tồn được loại dược liệu quý
Góp phần nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) tạo số lượng cây lớn phục vụ sản xuất, nâng cao thu
nhập cho người dân
2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Gừng Núi Đá
2.1.1. Phân loại
Theo Võ Văn Chi trong Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam (2007), cây Gừng
Núi Đá được phân loại như sau [5]:
Giới (Regnum) : Plantae
Ngành (Phylum) : Magnoliophyta (Angiospermae)
Lớp (Class) : Liliopsida (Monocotyledones)
Bộ (Ordo) : Zingiberales
Họ (Family) : Zingiberaceae
Chi (Genus) : Zingiber
Loài (Species) :purpureum Roscoe
Tên Việt Nam: Gừng Dại, Gừng Đá, Gừng Núi Đá

Tên khoa học: Zingiber purpureum Roscoe
Tên khác: Cây Ngải, Zơ Rơng, Gừng Gié, Gừng Tía.
Tên nước ngoài: Zingiber cassumunar Roxb., Bengle (Java)
Hình 1: Cây và hoa Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe)
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây thân thảo cao 1,5- 2m, có thân rễ lớn hơn củ gừng, màu đỏ, không cay
gắt và có mùi thơm đặc trưng. Lá không cuống, hình thuôn, dài nhọn, giáo gốc tròn,
đầu thót nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông như bột, dài 20-40cm, rộng 2-
3,5cm; lưỡi bẹ dạng vẩy mỏng, bẹ lá có khía, có lông [4].
3
2.1.3. Đặc điểm của hoa
Cán hoa có lông, đài trung bình 15-20 cm, vẩy có lông ở gốc, hình nhọn
giáo, không lợp lên nhau; cụm hoa hình thoi, dày hoa, dài khoảng 11 cm, rộng 4-6
cm; lá cánh hoa dày xếp lợp lên nhau, cánh hoa tạo thành một ống, mép lá màu tía.
Hoa mau tàn. Tràng có ống không vượt quá các lá bắc; thùy hẹp dài. Bao phấn ngắn
hơn cánh môi; trung đới dài và mềm yếu. Cánh môi hình tròn, chẻ sâu, màu vàng
nhạt, có thùy bên do nhị lép tạo thành. Bầu có lông. Quả nang tròn, cao 1,3 cm.
Mùa hoa tháng 7-8, mùa quả tháng 9-10 [4].
2.1.4. Đặc điểm của củ
Củ có màu đỏ vàng gần giống như màu củ cà rốt. Nhân dân thường dùng củ
làm gia vị và làm thuốc [4].
Có nơi dùng củ gừng để chữa lỵ mãn tính. Tại Ấn Độ, người ta sử dụng thân
rễ với mục đích tương tự như củ gừng. Ở Malayisa, gừng được dùng làm thuốc trị
giun cho trẻ em và nước sắc của củ được dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ. Người ta
lại còn ngâm củ trong rượu và dùng thoa và bụng cho phụ nữ mới sinh. Thân rễ
gừng dại cũng được dùng để điều trị bệnh thấp khớp. Ở Thái Lan, gừng dại được sử
dụng với nhiều công dụng, còn dùng làm thuốc tiêu viêm, chữa bong gân và đau cơ,
vết thương chảy máu [4].
2.1.5. Đặc điểm phân bố
Họ gừng (Zingiberaceae) có khoảng 45 chi và hơn 1300 loài, phân bố ở

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu ở Nam và Đông Nam châu Á như Ấn Độ,
Việt Nam, Thái Lan, Malayisa và Indonexia. Ở nước ta hiện biết đến gần 20 chi và
gần 100 loài, gặp ở Lạng Sơn, Hà Tây, Ninh Bình và nhiều tỉnh phía Nam. Trong
đó, nhiều cây có giá trị [4], [11].
2.1.6. Sinh thái, trồng trọt
2.1.6.1. Sinh thái
Đặc điểm sinh thái riêng của các giống gừng tùy thuộc vào điều kiện vùng
trồng. Tuy nhiên, chúng có đặc điểm là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng.
Trong tự nhiên, gừng dại thường mọc ở ven đường, thung lũng nơi ẩm, trong hốc đá
có mùn và dưới tán rừng thưa [1].
4
2.1.6.2. Trồng trọt
Gừng thích hợp trồng trên đất nhẹ, nhiều mùn, thoát nước, đủ ẩm, có che
bóng một phần càng tốt.
2.1.7. Thành phần hóa học
Gừng chứa 2-3% tinh dầu với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocacbon
sesquiterpenic: β-zingberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một
lượng nhỏ các hợp chất alcohol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol [1].
Nhựa dầu gừng chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay. Thành phần
chủ yếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol. Trong đó, zingerol
chiếm tỉ lệ cao nhất. Zingerol là một chất lỏng, màu vàng, tan trong cồn 50º, ether,
cloroform, benzen, tan vừa trong ether dầu hỏa nóng [1].
Ngoài ra, tinh dầu gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol và
các gingerol [1].
Nãm 1999, Bordoloi và cộng sự đã phân lập được các loại dầu thiết yếu của
Zingiber cassumunar Roxb. từ Ðông Bắc Ấn Ðộ. Kết quả cho thấy, trong thân rễ có
terpinen-4-ol (50,5%), (E)-l-(3,4-dimethoxyphenyl) buta-1,3-diene (19,1%), (E)-1-
(3,4-dimethoxyphenyl)but-1-ene (6,0%) và β-sesquiphellandrene (5,9%) là thành
phần chính trong số 21 hợp chất được xác định. Trong tinh dầu lá có 39 thành phần
được xác định, và các hợp chất chính đã được tìm thấy là l (10), 4-furanodien-6-1

(27,3%), curzerenone (25,7%) và β -sesquiphellandrene (5,7%) [15].
2.1.8. Tác dụng dược lý
Theo nghiên cứu của Chaiwongsa R. và cộng sự năm 2013, hợp chất (E)-4-
(3′,4′-dimethoxyphenyl)but-3-en-1-ol của Z. cassumunar chứa hoạt tính kháng viêm
mạnh, chống lại các biểu hiện gen interleukin- 1β dị hóa gây ra có liên quan đến sự
thoái hóa sụn trong, nguyên nhân gây ra bệnh viêm khớp măn tính [16].
Một nghiên cứu khác của Tg Siti Amirah Tg Kamazeri và cs (2012) thì các
loại tinh dầu hiển thị mức độ khác nhau của hoạt động kháng khuẩn. 2,6,9,9 -
tetramethyl -2,6,10 - cycloundecatrien 1- one ( 60,77 %) và α-caryophyllene ( 23,92
%) là phong phú trong dầu Z. cassumunar [22].
5
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm về nuôi cây mô tế bào thực vật
Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh
dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt
ghép và nuôi cấy mô in vitro. Trong đó nuôi cấy mô được coi là phương pháp hữu
hiệu nhất. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy
in vitro các nguyên liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có
kích thước phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm để tạo thành mô hay cây
hoàn chỉnh [3].
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có thể tạo
ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiên quanh năm không phụ thuộc
vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu [3].
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Haberlandt (1902) là người đầu tiên khởi xướng ý tưởng về nuôi cấy tế bào
thực vật từ quan điểm rằng mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả
năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [1]. Nguyên lý cơ bản
của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng di truyền của tế bào. Mỗi tế bào
đều mang đầy đủ thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp

mỗi tế bào riêng rẽ bất kỳ có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính
đó được gọi là tính toàn năng di truyền của tế bào. Hiện nay, người ta đã thành công
trong việc phát triển một tế bào hay một bộ phận của cây thành một cá thể hoàn
chỉnh [2].
2.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan
được hình thành từ các loại tế bào khác nhau, có chứ năng khác nhau chức năng khác
nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên là tế bào
hợp tử. Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh
chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục
được phân chia, biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan
khác nhau [8].
6
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào chuyên hoá
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở
điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ,
quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
phân hóa tế bào
tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào
Hình 1: Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) cho tính trạng mới, còn một số gen
khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã
hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng

phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong
một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt
hóa các gen của tế bào [8].
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều nhất và có tác động sinh lý nổi bật
nhất ở thực vật là Indol axetic acid (IAA). Ngoài ra còn có 4-Cloroindol-3-axetic acid
(A4-C1-IA) và Indol-3-butyric acid (IBA). Ở thực vật bậc cao, IAA tập trung nhiều
trong các chồi, lá đang sinh trưởng, trong tầng phát sinh, trong hạt đang lớn, trong
phấn hoa. IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Các dẫn xuất của IAA là Naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4 -
7
Diclophenoxy acid (2,4 D) cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô
và trong quá trình hình thành rễ. NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi
cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả
năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt
tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và
tạo rễ [3], [10].
Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và
vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới
của cây [3].
2.3.2. Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào. Các cytokinin thường gặp là Kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA). Kinetin
được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic. Kinetin thực chất là
một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. Kinetin và BA đều được tổng hợp nhân tạo,
chúng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế
bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Tuy nhiên, hoạt tính của BA
cao hơn so với Kinetin. Ngoài ra, các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi

chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của
một số enzym. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện
bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết
của histone với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [3], [10].
Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích
thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hormone sinh trưởng nội sinh.
Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ
giữa các hormone ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin
có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho
sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi.Nếu tỷ lệ này ở
mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus). Das (1958) và Nitsch
(1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới
kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Theo
Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn
8
giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích. Skoog và
Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào
cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mô và giữ cho quá trình
này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát
triển[3], [10].
2.4. Tình hình nghiên cứu cây Gừng Núi Đá ở Việt Nam và trên thế giới
Trịnh Đình Chính và cộng sự (2007) đã thực hiện nghiên cứu: “Bước đầu
nghiên cứu thành phần hóa học của cây Gừng dại (Zingiber cassumunar Roxb.) ở
tỉnh Kon Tum” [6]
Chirangi P. and Sharma G. L. (2005) khi nghiên cứu về loài Zingiber
cassumunar Roxb đã thấy rằng chồi ngủ của Zingiber cassumunar Roxb. được nuôi
trên môi trường MS bổ sung 4,44 mM BAP cho 70% nhiều chồi, 30% cho chồi đơn.
Môi trường hiệu quả nhất để nhân chồi (8 chồi/mẫu, 6 rễ/mẫu) là môi trường MS có
bổ sung 0,54 mM NAA + 4,44 mM BAP; 7 và 9 % sucrose sau 8 tuần nuôi cấy [17].

Abbas M.S. và cs (2011) đã tiến hành nghiên cứu trên loài gừng Zingiber
officinale. Ở giai đoạn nhân nhanh, gừng Zingiber officinale ðýợc nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung BAP với nồng độ khác nhau là 1,5; 2,5; 3,5; 4,5 mg/l. Sau
4 tuần kết quả cho thấy, bổ sung với nồng độ 4,5 mg/l BAP cho hiệu quả nhân chồi
cao nhất (8,00 chồi/mô nuôi cấy; 15,50 lá/chồi nuôi cấy; độ dài chồi: 4 cm). Ở giai
đoạn ra rễ, chồi gừng Zingiber officinale được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung NAA với nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy ở nhiệt
độ 25ºC ± 1ºC, ánh sáng 16 giờ/ngày, kết quả cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/l NAA
cho số lượng rễ nhiều nhất (13,67 rễ/chồi) và độ dài rễ dài nhất (6,37 cm) [13].
9
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mầm ngủ trên củ cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) thu thập
từ tỉnh Lạng Sơn về trồng tại vườn lan Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Khoa CNSH-CNTP,
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu
sạch bệnh nấm, vi khuẩn của cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên (nước dừa,
dịch chiết khoai tây và dịch chiết cà rốt) đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.)
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Khoa CNSH-
CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian: 12/2013- 06/2014
3.3. Hóa chất và thiết bị
3.3.1. Hóa chất
- Hóa chất khử trùng: Cồn (C
2
H
5
OH), Oxy già (H
2
O
2
), Javel (NaClO), Thủy
ngân clorua (HgCl
2
)
- Môi trường cơ bản MS, WPM, B5
-Đường
- Agar
- Than hoạt tính
- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, BAP, NAA
3.3.2. Thiết bị
-Cân kỹ thuật 10-2 (Olhous-Vietlabcu)
10
-Máy đo pH (Hanna HI2210)
-Máy khuấy từ
-Lò vi sóng (Sanyo)
-Nồi hấp vô trùng (ALP)
-Tủ sấy (Memmert)
-Box cấy vô trùng (Airtech)
-Máy chuẩn pH Hanna HI2210

Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của Phòng thí nghiệm Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng
tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu
sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất A
đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber
purpureum Roscoe.)
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng
tái sinh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường (MS, WPM, B5) đến khả năng tái
sinh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ đến khả
năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân chồi Gừng Núi
Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng nhân chồi
Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết cà rốt đến khả năng nhân chồi Gừng
Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây và cà rốt đến khả năng
nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
11
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng
tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Cách tiến hành:

+ Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu là các chồi hay đoạn thân chứa chồi ngủ
không sâu bệnh, dập nát. Sau khi lấy mẫu về đem rửa dưới vòi nước cho sạch đất và
dùng bông rửa lại bằng xà phòng loãng, sau đó tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4
lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được rửa sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần chết, dập nát
tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% và tráng lại bằng nước cất khử trùng nhiều lần
cho sạch cồn trong box cấy. Sau đó, tiến hành ngâm mẫu trong các dung dịch H
2
O
2
5%,
Javel 1%, HgCl
2
0,1%, cồn 70% trong thời gian 5 phút; tráng bằng H
2
O khử trùng 5-6 lần.
(TN1). Ngâm mẫu trong dung dịch HgCl
2
0,1% trong thời gian lần lượt là 3, 5, 8, 10 phút
(TN2).
+ Khử trùng dụng cụ: Pank, dao được hơ kỹ trên ngọn lửa đèn cồn rồi để nguội.
+ Tiến hành: Dùng pank gắp mẫu đặt lên giấy thấm cho ráo nước rồi dùng
dao cấy cắt bỏ phần mẫu bị hóa chất làm hoại tử. Sau đó, đưa mẫu vào bình môi
trường được chuẩn bị trước. Mỗi bình cấy 1 mẫu.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ
phòng từ 22 – 25
0
C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, quang chu kì 16h
sáng/8h tối, độ ẩm: 60 – 65 %. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Thí nhiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả

năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum
Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 công thức, được bố trí theo kiểu ngẫu
nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại cấy 15
bình, mỗi bình cấy 1 mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
CT Hóa chất Thời gian (phút)
1 (Đ/C) Nước cất vô trùng 5
2 H
2
O
2
5% 5
3 NaClO 1% 5
4 HgCl
2
0,1% 5
12
Chú ý: Môi trường kiểm tra khả năng tạo mẫu sạch: Thành phần khoáng MS
+ Agar 5g/l, pH: 5,6-5,8
- Chỉ tiêu theo dõi: Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm,
tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
Ghi chú: Chất khử trùng cho hiệu quả cao nhất sẽ được sử dụng cho thí
nghiệm sau (Kí hiệu: A)
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng hóa
chất A đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy)
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 CT được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên
hoàn toàn. Mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình,
mỗi bình cấy 1 mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
•CT1 : 3 phút

•CT2 (Đ/C) : 5 phút
•CT3 : 8 phút
•CT4 : 10 phút
Chú ý: Môi trường kiểm tra khả năng tạo mẫu sạch: Thành phần khoáng
MS + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8
+ Chỉ tiêu theo dõi: Sau7 ngày nuôi cấy tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu sống
không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
3.4.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng
tái sinh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM
đến khả năng tái sinh chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 20
ngày nuôi cấy)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi
bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức bổ sung thêm: Đường 30g/l + Agar 5g/l, pH: 5,6-
5,8. Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Công thức thí nghiệm
+ CT1: Môi trường MS (Đ/C)
+ CT2: Môi trường B5
+ CT3: Môi trường WPM
13
- Cách tiến hành:
+ Sử dụng môi trường MS, B
5
, WPM có bổ sung Đường 30g/l + Agar 5g/l, pH:
5,6-5,8.
+ Mẫu sống, sạch bệnh được bóc, cắt bỏ phần bị hoại tử rồi cấy sang môi trường đã
chuẩn bị trước. Mỗi bình cấy 1 mẫu.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ
22-25

0
C, cường độ chiếu sáng 2000-2500 lux, quang chu kì 16h sáng/8h tối, độ ẩm:
60-65%. Tiến hành theo dõi chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
- Chỉ tiêu theo dõi: Sau 20 ngày nuôi cấy tiến hành theo dõi tỷ lệ tái sinh
chồi, chất lượng chồi.
Chú ý: Môi trường thích hợp cho khả năng tái sinh chồi Gừng Núi Đá được
dùng cho các thí nghiệm sau (Kí hiệu: B)
3.4.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự
nhiên đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
- Cách tiến hành:
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, đã tái sinh từ mầm ngủ củ Gừng Núi Đá, sinh
trưởng tốt có chiều dài từ 2-5cm, dùng pank, dao đã được khử trùng trên ngọn lửa
đèn cồn, chờ nguội rồi bóc, tách, cắt bỏ phần tế bào già, chết.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường đã chuẩn bị sẵn, mỗi bình cấy 1 chồi. Sau
khi cấy xong đưa vào phòng nuôi. Sau đó, tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng
chồi (quan sát bằng mắt thường).
+ Sử dụng môi trường nền là môi trường B + BAP 4,4 mg/l + NAA 0,5 mg/l
+ Đường 30g/l + Agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi
bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức nước dừa được bổ sung vào MT nền với các nồng
độ sau:
14
Công thức Nồng độ nước dừa (ml/l)
1 (Đ/C) 0
2 50
3 100
4 150

5 200
-Môi trường nền là môi trường B + BAP 4,4 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Đường
30g/l + Agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
-Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần tiến hành theo dõi số chồi tạo ra, hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả
năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy)
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi
bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức dịch chiết khoai tây được bổ sung vào MT nền với
các nồng độ sau:
Công thức
Nồng độ dịch chiết khoai tây
(g/l)
1 (Đ/C) 0
2 10
3 50
4 100
- Môi trường nền là môi trường B + BAP 4,4 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Đường
30g/l + Agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
- Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần tiến hành theo dõi số chồi tạo ra, hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết cà rốt đến khả năng
nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8 tuần nuôi cấy)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi
bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức dịch chiết khoai tây và cà rốt được bổ sung vào
MT nền với các nồng độ sau:
15
Công thức Nồng độ dịch chiết cà rốt (g/l)

1 (Đ/C) 0
2 10
3 50
4 100
- Môi trường nền là môi trường B + BAP 4,4 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Đường
30g/l + Agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
- Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần tiến hành theo dõi số chồi tạo ra, hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây và cà rốt
đến khả năng nhân chồi Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 8
tuần nuôi cấy)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình môi
trường, mỗi bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức dịch chiết khoai tây và cà rốt được bổ
sung vào MT nền vớicác nồng độ sau:
Công thức
Nồng độ dịch chiết
khoai tây (g/l)
Nồng độ dịch chiết
cà rốt (g/l)
1 (Đ/C) 0 0
2 10 10
3 50 10
4 10 50
- Môi trường nền là môi trường B + BAP 4,4 mg/l + NAA 0,5 mg/l + Đường
30g/l + Agar 5g/l, pH = 5,6-5,8.
- Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần tiến hành theo dõi số chồi tạo ra, hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi.
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu
3.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (tỷ lệ mẫu nhiễm):
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
16
- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (tỷ lệ mẫu sạch):
Tỷ lệ mẫu sạch
(%)
=
Tổng số mẫu sạch (mẫu)
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ mẫu chết:
Tổng số mẫu chết (mẫu)
Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ tái sinh chồi:
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Hệ số nhân chồi:
Hệ số nhân chồi
(lần)
=
Tổng số chồi (chồi)
Tổng số chồi nuôi cấy
(chồi)
- Chất lượng chồi:
+ Chồi mập, xanh đậm
+ Chồi mập, xanh nhạt; chồi nhỏ, xanh đậm
+ Chồi nhỏ, xanh nhạt
3.5.2. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được kiểm tra, xử lí trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Office

Excel và Irristat 4.0
17
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng
tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum
Roscoe.)
Đây là giai đoạn đầu tiên trong quá trình nuôi cấy in vitro - giai đoạn khử
trùng vật liệu nuôi cấy. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được vật liệu vô trùng,
sạch bệnh. Vì vậy, yêu cầu tất yếu là giảm số lượng mẫu chết và mẫu nhiễm; đồng
thời tăng số lượng mẫu sống. Có 2 phương pháp thường dùng để xử lý mẫu là
phương pháp vật lý và phương pháp hóa học. Ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng
các chất hóa học có tác dụng diệt khuẩn và nấm khác nhau và thời gian khử trùng
khác nhau để khử trùng vật liệu nuôi cấy. Sau 7 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành
đánh giá kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng nghiên cứu tới khả năng tạo
vật liệu sạch nấm, vi khuẩn như sau:
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng
tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum Roscoe.)
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả
năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá (Zingiber purpureum
Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy)
Công thức
Chất
khử trùng
Tổng số
mẫu/CT
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
Tỷ lệ mẫu
sạch (%)

Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)
CT1
(Đ/C)
Nước cất khử
trùng
45 0,0 0,0 100,0
CT2 H
2
O
2
10% 45 11,1 60,0 28,9
CT3 NaClO 1% 45 8,8 55,6 35,6
CT4 HgCl
2
0,1% 45 4,4 77,8 17,8
LSD
.05
8,1
CV% 8,9
Chú thích: Môi trường kiểm tra khả năng tạo mẫu sạch: Thành phần khoáng MS +
Agar 5g/l, pH: 5,6-5,8
18
Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử
trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng Núi Đá
(Zingiber purpureum Roscoe.) (sau 7 ngày nuôi cấy)
Kết quả bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: Với giá trị LSD
.05

đạt 8,9 thì các
CTTN so với CT Đ/C có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Tỷ lệ mẫu
sạch cao nhất ở CT4 (HgCl
2
0,1%) đạt 77,8%. Kế tiếp là CT2 (H
2
O
2
10%) đạt
60,0% và CT3 (NaClO 1%) đạt 55,6%. Thấp nhất là công thức Đ/C đạt tỷ lệ mẫu
sạch là 0%.
Sự khác nhaucủa tỷ lệ mẫu sạch giữa các CT TN là do khả năng diệt khuẩn
và nấm của mỗi chất khử trùng khác nhau là khác nhau.
Như vậy, HgCl
2
là hóa chất được chọn để thực hiện thí nghiệm 2 về ảnh
hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm, vi khuẩn của Gừng
Núi Đá.
4.1.2.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl
2
0,1%
đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn
19