Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro


B3 : Nicotinic acid
B5 : Gamborg
B6 : Pyridoxine
BA : 6-Benzylaminopurine
CV : Coefficient of Variation
Đ/C : Đối chứng
IAA : Indol axetic acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LSD : Least Significant Difference
MS : Murashige and Skoog
NAA : Napthalene axetic Acid
TN : Thí nghiệm

TDZ
: 1,2,3-Thiadiazol-5-yl
WPM : Woody Plant Medium


Hình 2.1. Sơ đồ phân hóa tế bào 7
Hình 2.2. Sơ đồ phản phân hóa tế bào 7
4


 !"
Lan Kim Tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) thuộc họ Lan -

Orchidaceae, được phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh của Việt Nam [4].Chi Lan
Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có
loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall). Là một loại thảo dược
có giá trị dược liệu, Lan Kim Tuyến có khả năng chữa trị các bệnh ung thư,
chống tăng huyết áp, lưu thông khí huyết, kháng khuẩn, làm thuốc trị lao phổi,
ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm dạ dày mãn tính, viêm
khí quản, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, v.v [4]. Ngoài tác
dụng chữa bệnh Lan Kim Tuyến còn được dùng làm cảnh [1].
Hiện nay với nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng tăng Lan Kim Tuyến
đã bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt ngoài tự nhiên [1]. Lan Kim Tuyến được
xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác sử
dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d

trong Sách đỏ Việt Nam (2007), phần thực vật [5], [4].Xuất phát từ tình hình
thực tiễn nhằm bảo tồn loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii việc
ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp hữu hiệu cho hệ số
nhân chồi cao, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và giữ được các đặc tính di
truyền của cây mẹ.
Xuất phát từ tính cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

          ! "#  $% &'()(*
(+,-,./0(12
#$%!&%'%()!"*+
Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus
roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro.

, /%0/%()!"*+
Xác định ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin
và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
Xác định ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân
nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
5
12 3'4)%()!"*+
- Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra kĩ thuật nhân nhanh chồi lan Kim
Tuyến bằng phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Giúp sinh viên tiếp cận được với công tác nghiên cứu khoa học, qua đó
nâng cao trình độ chuyên môn và tạo cho sinh viên có tác phong làm việc

nghiêm túc, sáng tạo.
- Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nhân giống lan
Kim Tuyến nhằm cung cấp cây giống với số lượng lớn, có chất lượng đồng đều
đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc.
Bảo tồn được loại dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng.
6
#
56789
#+:+'+;/%'/ 3"%<=>) ?+@/=A
3242425*(60
Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus roxburghii (Wall.) [4].

Giới (regnum) : Plantae
Ngành (Phylum) : Magnoliophyta
Lớp (Class) : Liliospida
Bộ (ordo) : Asparagales
Họ (Family) : Orchidaceae
Chi (genus) : Anoectochilus
Loài (species) : roxburghii [7].
324232789#0:%*"#$%
Lan Kim Tuyến là cây thảo, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước
mang 2-6 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có
mũi ngắn, cỡ 3,5-4,5 x 2,5-3,5 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên. Hệ gân lá mạng
lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt

trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu
đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá
ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0.6-1.2 cm, thường nhẵn và có màu trắng
xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Hoa tự chùm mọc ở đầu
ngọn thân, trục hoa dài từ 5-20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10
hoa. Mùa hoa nở tháng 9-12. Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau. Hoa có cánh
môi màu trắng. Hai bên rìa mang từ 6-8 râu mỗi bên [10].
- Về mặt cấu tạo, Lan Kim Tuyến có các đặc điểm sau:
+ Thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài.
Chiều dài thân rễ từ 5-12cm, trung bình là 7,87cm. Đường kính thân rễ từ 3-
4mm, trung bình là 3,17mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03
lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 1,99cm. Thân rễ thường có màu

xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [10].
+ Rễ: Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình
thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mấu
chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số
7
lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường
từ 3-10 rễ, trung bình là 5,4 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8cm, rễ dài nhất
trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm, chiều dài trung bình của
các rễ trên một cây là 3,82cm [10].
+ Thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi
mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-6cm, trung bình 5,4cm. Đường kính
thân khí sinh từ 2,5-3,5cm, trung bình là 2,98cm. Thân khí sinh mang nhiều

lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4
lóng, trung bình là 3,6. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4cm, trung bình 1,52cm. Thân
khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng,
đôi khi có màu hồng nhạt [10] .
+ Lá: Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần
tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3-4cm, trung bình là
4,03cm và rộng từ 2-3cm, trung bình là 3,12cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và
phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc.
Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có
màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các
gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6-
1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ

và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thường có 4 lá. Kích thước
của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt
[10].
+ Hoa: Cụm hoa dài 10-15cm, mang 4-10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình
trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5-3cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm,
môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu,
hốc chứa mật dài 7mm, bầu dài 1,3cm màu lục có nhiều lông mềm [4], [10].
3242;2789#<,=!"#$%
- Phân bố theo kiểu rừng: Lan Kim Tuyến hầu hết phân bố ở rừng kín lá
rộng, rừng thường có cấu trúc 2 tầng cây gỗ [10].
- Phân bố theo trạng thái rừng: Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu
vực Lan Kim Tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ khoảng 15-30%, độ cao

của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim
Tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi, thảm tươi dày đặc. Chúng có thể
nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ [10].
8
- Phân bố theo sinh cảnh: Lan Kim Tuyến chủ yếu phân bố trên đất,
chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm, độ xốp cao, thoáng
khí, thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng
mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây trên các
đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp Lan Kim Tuyến ở trong
rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng
trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng [10].
- Phân bố theo địa lý, địa hình:Phân bố ở hầu hết các dạng địa hình, như

chân núi, sườn núi, đỉnh núi [10].
- Phân bố theo đai cao: Lan Kim Tuyến thường phân bố ở đai cao trên
735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m [10].
Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm các tỉnh:
Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây
(Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc Uy),
Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận, Hà Tĩnh,
Quảng Trị, Đắk Lăk [4].
Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan,
Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [4].
3242>2?@A*"#$%
- Giá trị kinh tế

Hiện nay Lan Kim Tuyến ngoài tự nhiên đã bị thu hái đến mức cạn kiệt
[16] do có rất nhiều tác dụng dược liệu và làm cây cảnh. Giá bán trên thị trường
thế giới của Lan Kim Tuyến khô là 3.200USD/kg [29], cây tươi có giá từ 300-
320USD/kg, nếu được thu hái trong tự nhiên, đặc biệt có nấm cộng sinh ở rễ thì
giá này sẽ cao gấp 3 hoặc nhiều hơn nữa [17], [29]. Cây giống Lan Kim Tuyến
có thể tạo từ nhân in vitro các mắt đốt thân, hạt giống và các bộ phận sinh dưỡng
của cây. Tuy nhiên sự sinh trưởng các của cây Lan Kim Tuyến in vitro chậm,
kéo dài thời gian nhân giống. Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây Lan Kim
Tuyến từ nuôi cấy hạt in vitro.Trung Quốc, Đài Loan, Nhật bản đã trồng và xuất
khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nguồn thu lớn.
- Giá trị dược liệu
Lan Kim Tuyến có rất nhiều tác dụng dược liệu do có chứa axit 4-

hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit,
kinsenoside nên được sử dụng trong điều trị bệnh [29].
9
Theo y học cổ truyền Đài Loan, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô nấu nước
uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận [21], [26],
sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách, tim, phổi [16], [17], [26], [27].
Cây tươi sử dụng để chữa các vết thương do rắn cắn [16], [29]. Dịch chiết Lan
Kim tuyến có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng để
chữa các bệnh về gan [25], [26], [19] chống khối u, ung thư và tính chống virus
[18], điều trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống mệt mỏi [27].
Gần đây, một hợp chất 3(R)-3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên
thương mại là kinsenoside được chiết xuất từ Lan Kim Tuyến có tác dụng chống

tăng huyết áp hiệu quả và hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến
chức năng tim mạch [25]. Lan Kim Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co,
Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa, chuỗi
polysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người [19].
Cây Lan Kim Tuyến sau khi thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản
phẩm gồm thân, rễ và lá phơi khô để chế biến trà dược, thực phẩm chức năng,
thạch Lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide
từ Lan Kim Tuyến để sản xuất biệt dược kinsenoside [29].
##?'B+C/B" /D+%=@DAE*F'G%H
323242"@B#C%#C,(0
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [6]. Nhân giống vô tính in vitro
được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn
rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của
ống nghiệm [3].
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống
vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những
ưu điểm như tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm; Chủ động sản
xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệp
hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ,
ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số
lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới [3].
323232D(:C%#C,(0

- Tính toàn năng của tế bào
10
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành
nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng[13].
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả
năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế
bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào
nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ
thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận
lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh
[13].
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực

nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô
tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [13].
Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể
hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6].
- Sự phân hóa và phản phân hóa
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Ví dụ: Mô dậu
làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự
trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng [6].
Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
I '#JKL!MN'< 'O)AE*F
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân
hóa tế bào [13].
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa
Phản phân hóa tế bào
11
I '##JKL!MN'P N'< 'O)AE*F

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới,
còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương
trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử acid deoxyribonucleic của mỗi
tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được
hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước
của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [6].
3232;27EB#CFC%#C,(0
2.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm
bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi
cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của
nuôi cấy mô [12].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [12].
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó, có ý nghĩa quyết định đến thành
công trong nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử
lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất
như: HgCl
2
0,1%, NaHCl 10%, cồn 76

0
…để khử trùng. Phương tiện khử trùng:
Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng cấy và tủ cấy vô trùng, phòng nuôi cây [12].
- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá
trình sinh trưởng của mô nuôi cấy.
+ Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
12
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động

đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [12].
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng
của mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000lux (Morein,
1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái
của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so
với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao
nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay, trong các
phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-
2500lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ
35-40cm [12].
+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt
độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nhiều loài cây là 250
0
[12].
2.2.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành
công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác
nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên

cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu
một loại môi trường cơ bản phù hợp [12].
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng
cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ
biến như MS, B
5
, WPM. Ví dụ, môi trường MS là môi trường được sử dụng
rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp
cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Hay môi trường B5 dùng thử nghiệm trên
đậu tương [12].
Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều

gồm một số thành phần cơ bản sau [3] [13]:
13
Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
Nguồn cacbon.
Các vitamin và aminoacid.
Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường.
Các chất điều hòa sinh trưởng.
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:
Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan
trọng. Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào,
nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần

thiết cho hoạt động sống của tế bào [13].
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme [13].
Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi
trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật. Ví dụ: K, Ca rất quan
trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào [13].
- Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang
hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của
tế bào [13].
Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường
saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho

saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực
vật [13].
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian
để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màu
vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào.
- Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro
ở các loài khác nhau là khác nhau [13].
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin
cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất
phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axít.
Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát

14
triển của thực vật. Vitamin B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [13].
- Các chất bổ sung
+ Nước dừa
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van
Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) [24]. Sau đó, tác dụng tích cực
của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác
giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [18].
Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở
nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau

bảo quản. Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau
đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh [18].
Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng
của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản
lạnh. Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn [18].
Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích
thích phân hóa và nhân nhanh chồi.
+ Khoai tây
Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin như
vitamin C, B
1
, B

6
và các yếu tố khoáng như kali, sắt, magiê rất tốt cho sự sinh
trưởng và phát triển của mô, tế bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác [30]. Nồng độ
khoai tây thường sử dụng là 20mg/l [25].
+ Dịch chiết nấm men
Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.
Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế
bào động vật với nồng độ thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc
bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (chuối xanh) nhằm tăng
cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.

+ Agar
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn
hoá môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại tinh bột đặc
15
chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì
thiếu O
2
nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [2].
+ pH môi trường
Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH
của môi trường thường từ 5,6-6,0 [2]. Nếu pH của môi trường thấp hơn 5,0 thì
agar sẽ khó đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng.

- Các chất điều tiết sinh trưởng:
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin,
ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh
trưởng phát triển và phân hóa cơ quan.
+ Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác
dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ. Ngoài
IAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4 - diclophenoxy axit (2,4 D).
Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong
quá trình hình thành rễ [1], [2], [6].
NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện. Chất này có tác dụng tăng
hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến

trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi
trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA [13].
NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Kết quả
nghiên cứu của Butenco (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong
tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzyme và
kích hoạt enzyme hoạt động. Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin kích
thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các
enzyme phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay
đổi tính thấm của màng. Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA
kết dính vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm
ra ngoài ion H
+

làm màng tế bào mềm và kéo dài ra do đó tê bào lớn lên và sinh
trưởng. Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [3].
16
Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát
triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần
phía dưới của cây.
+ Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia
tế bào. Các cytokinin thường gặp là Kinetin, BAP. Kinetin được Skoog phát
hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axit nucleic. Kinetin thực chất là một dẫn xuất
của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính
mạnh hơn Kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào

kéo dài thời gian động của tế bào phân sinh và làm hạt chế sự hoá già của tế bào.
Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp
ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym. Cơ chế
tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương
hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với
ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [3], [13], [14].
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các
chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng
nội sinh. Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác động
tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của
Aaxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình
thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của tác giả Skoog cho thấy tỷ lệ

auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì thích hợp cho
quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát
triển mô sẹo (callus). Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác
dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp
DNA, dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Theo Dmitrieva
(1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai
đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích. Skoog và
Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế
bào cụ thể là cytokinin điều kiển quá trình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi
rễ và hạt đang phát triển [3], [13], [14] .
+ Gibberellin
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật

Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi
gây ra. Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được
17
gọi là gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì
vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình
thường. Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các
chất giống như gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất này đặt tên
theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4. Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham
gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất
điều hoà sinh trưởng khác [13].
Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó
được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem.

#,I ''I ' 3'+. %Q/ '< 3+R 3%<=8) ?+@/=A S. 'A3+:+
*SF 3 T:%
32;242$GG=!"#$%H
Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tiến hành phương pháp nhân giống
hàng loạt Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách thụ phấn chéo và nuôi
cấy hạt nảy mầm. Sau khi thụ phấn số quả đậu đạt 86,7%. Những hạt 7 tuần tuổi
được nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8%
chuối trong 4 tháng. Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA
2mg/l trong bình nón 125ml trong 2 tháng. Trước khi tiến hành thụ phấn trong
ống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy trên môi
trường ½ MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2mg/l và NAA 0,5mg/l
[29].

Năm 2004, Kiet Van Nguyen đã nghiên cứu thành công quy trình nhân
giống in vitro loài Lan Kim Tuyến - Anoectochilus formosanus. Môi trường tạo
vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l +
peptone 2g/l). Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ)
+ than hoạt tính 1% [21].
Năm 2011, Lazarus Agus Sukamto và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A.
setaceus tốt nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A. formosanus với TDZ là 0,5 mg/l. Số lá
cao nhất của A.setaceus với TDZ 0,001 mg/l, còn A. formosanus với hàm lượng
TDZ là 0,005mg/l. Số chồi được tạo ra trên môi trường TDZ đối với loài A.
setaceus là 0,01mg/l còn với A. formosanus là 0,05mg/l. Số rễ cao nhất của A.
setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A. formosanus là 0,005mg/l [22].
Năm 2012, N. Ahamed Sherif và cs đã nghiên cứu thành công quy trình

tái sinh tạo cây hoàn chỉnh loài Anoectochilus elatus Lindley từ nguyên liệu ban
đầu là mắt đốt thân và chồi đỉnh. Chồi phát triển tốt nhất ở nồng độ TDZ 3,0mg/l
18
và chiều dài chồi đạt cao nhất ở nồng độ KIN 3,5mg/l với mắt đốt thân, ở
0,01mg/l đối với chồi đỉnh. Anoectochilus elatus Lindley ra rễ 100% ở môi trường
có bổ sung than hoạt tính 0,3g/l [23].
Năm 2008, Yang Bai-yun đã nghiên cứu về loài Anoectochilus
roxburghii đã kết luận môi trường tốt nhất cho nhân nhanh protocom là MS +
BA 2,0mg/l + NAA 0,2 mg/l cho hệ số nhân của 9.4 lần. Môi trường ra rễ phù
hợp nhất là 1/2 MS + NAA 0,2 mg/l + than hoạt tính 0,05% + agar 0,7 số
rễ/cây đạt 4.4 rễ [28].
32;232$GG=!"#$%IB#

Năm 2009, Phùng Văn Phê và cs đã đưa ra kết quả nghiên cứu về đặc
điểm hình thái và phân bố của loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus
Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10].
Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nhân
nhanh chồi in vitro loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
Kết quả cho thấy: Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
in vitro là Knud. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ
2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sung
BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa 100ml/l + dịch chiết
khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l [9].
Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã tiến hành nghiên cứu kĩ thuật
nhân giống loài Lan Kim Tuyến in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý. Kết quả

cho thấy: Cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được
khử trùng và đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Sau
đó, các chồi và mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung
BA, Kinetin, αNAA trong 4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể
chồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + αNAA
0,3mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là
6,55 chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3-4cm được sử dụng để ra rễ in vitro.
Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có
bổ sung α-NAA 1mg/l [11].
19
,
U89V7WXYZ

,H>+;/*N'[@+ 3'+. %Q/
;24242I0*B
Vật liệu nuôi cấy là giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghi)
được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa
học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
;2423256#
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus
roxburghii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
,#\)!+]@'^+3+)  3'+. %Q/
;232427A9#
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sự
sống, Đại học Nông LâmThái Nguyên.

;23232$F
Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014
,,O)%'*'+AE\
;2;242JKK
- Micropipette 200µl
- Đầu côn vô trùng
- Pank, dao, kéo, đĩa cấy
;2;232LM
- Cồn 96
0
- Môi trường MS cơ bản
- Myo-Inositol

20
- Saccharose
- Agar
- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, Kinetine, NAA
- Chất hữu cơ tự nhiên: Khoai tây, nước dừa, chuối xanh
;2;2;2$,A
- Máy đo pH
- Máy khuấy từ
- Cân phân tích, cân kỹ thuật
- Bếp gas
- Tủ sấy
- Nồi hấp vô trùng

- Box cấy vô trùng, đền cồn
- Tủ lạnh
,1_+`/ 3*N'TL 3N'BN 3'+. %Q/
;2>242NO
_+`/ 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus roxburghii).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh
chồi Lan Kim Tuyến.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP tốt nhất kết hợp với Kinetin
đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP và Kine tốt nhất kết hợp với

NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
_+`/ 3#: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên
(khoai tây, nước dừa, chuối xanh) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus roxburghii).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetin và NAA tốt nhất
kết hợp với khoai tây đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetin và NAA tốt nhất
kết hợp với chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetin và NAA tốt nhất
kết hợp với nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
21
;2>2325<@<

3.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số chất kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh
chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
- Cách tiến hành
Chồi tái sinh từ mẫu cấy khoảng 4-6 tuần sinh trưởng và phát triển bình
thường có đầy đủ thân, lá được sử dụng làm mẫu cấy chuyển sang môi trường
nhân nhanh.
Sử dụng dao đã khử trùng cắt lấy đoạn chồi có chiều dài từ 1,5-2 cm,dùng
pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi cấy vào
môi trường nhân nhanh.
Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều.
Sau khi cấy xong

các bình này
được đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất
lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
'& 3'+;@JNghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng
nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi
bình cấy 5 chồi. Thí nghiệm được bố trí như sau:
D 3'Q% M 3!_a@3b>c
CT1 (Đ/C) MT nền + 0,0
CT2 MT nền + 1,0
CT3 MT nền + 1,5

CT4 MT nền + 2,0
CT5 MT nền + 2,5
CT6 MT nền + 3,0
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.
Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.
22
Nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ở thí
nghiệm 1 (kí hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
'& 3'+;@#: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP tốt nhất kết
hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày

nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi
bình cấy 5 chồi. Kinetine và A (nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi
Lan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 1) được bổ sung vào môi trường nền với
các nồng độ sau:
D 3'Q% M 3!_d+ e+ ea@3b>c
CT1 (Đ/C) MT nền + A + 0,0
CT2 MT nền + A + 0,1
CT3 MT nền + A + 0,2
CT4 MT nền + A + 0,3
CT5 MT nền + A + 0,4

CT6 MT nền + A + 0,5
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.
Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.
Nồng độ BAP và kinetine thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
ở thí nghiệm 2 (kí hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
'& 3'+;@,JNghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine tốt
nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35
ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi

bình cấy 5 chồi. NAA được bổ sung vào môi trường nền và B ( nồng độ BAP và
kinetine thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được xác định ở thí
nghiệm 2).
D 3'Q% M 3!_a@3b>c
23
CT1 (Đ/C) MT nền + B + 0,0
CT2 MT nền + B + 0,1
CT3 MT nền + B + 0,2
CT4 MT nền + B + 0,3
CT5 MT nền + B + 0,4
CT6 MT nền + B + 0,5
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.

Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.
Nồng độ BAP, kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến ở thí nghiệm 3 (kí hiệu C) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số
chất hữu cơ tự nhiên (khoai tây, nước dừa, chuối xanh) đến khả năng nhân
nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
- Cách tiến hành: như nội dung 1
'& 3'+;@1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine và
NAA tốt nhất kết hợp với khoai tây đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy).

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi
bình cấy 5 chồi. Khoai tây được bổ sung vào môi trường nền và C (nồng độ
BAP, Kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được
xác định ở thí nghiệm 3).
D 3'Q% M 3!_d'F)+<=a3b>c
CT1 (Đ/C) MT nền + C + 0,0
CT2 MT nền + C + 20
CT3 MT nền + C + 30
CT4 MT nền + C + 40
24
CT5 MT nền + C + 50

CT6 MT nền + C + 100
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.
Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.
'& 3'+;@fJNghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine và
NAA tốt nhất kết hợp với chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi
bình cấy 5 chồi. Chuối xanh được bổ sung vào môi trường nền và C (nồng độ
BAP, Kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được

xác định ở thí nghiệm 3).
D 3'Q% M 3!_%'/R+g) 'a3b>c
CT1 (Đ/C) MT nền + C + 0,0
CT2 MT nền + C + 20
CT3 MT nền + C + 30
CT4 MT nền + C + 40
CT5 MT nền + C + 50
CT6 MT nền + C + 100
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.
Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.

'& 3'+;@hJNghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine,
NAA tốt nhất kết hợp với nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với
6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗi
bình cấy 5 chồi. Nước dừa được bổ sung vào môi trường nền và D (nồng độ
25
BAP, Kinetinen, NAA và khoai tây thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến được xác định ở thí nghiệm 4).
D 3'Q% M 3!_ T:%`i)a@>b>c
CT1 (Đ/C) MT nền + 0,0
CT2 MT nền + 20

CT3 MT nền + 30
CT4 MT nền + 40
CT5 MT nền + 50
CT6 MT nền + 100
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, chất lượng chồi.
Ghi chú:
Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung saccharose 20g/l +
6g agar/l + Inositol 0,1g /l, pH = 5,7.
3.4.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi
- Thường xuyên theo dõi hàng ngày, đánh giá tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn…
- Sau 35 ngày theo dõi tiến hành xác định các chỉ tiêu:
Hệ số nhân chồi (lần)

- Chất lượng chồi đánh giá ở 3 mức:
+ Chồi tốt (+++): Chồi khỏe, mập, cao, hình thái bình thường (không di
dạng).
+ Chồi trung bình (++): Chồi gầy, sinh trưởng bình thường.
+ Chồi xấu (+): Chồi bị dị dạng.
;2>2;25<@<+P*Q=*B
- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excell 2007
- Quá trình xử lý thực hiện trên máy tính theo chương trình IRRISTAT 5.0