Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, nhân hạt tạo trong nhân nhanh một số cây có giá trị kinh tế

bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
viện di truyền nông nghiệp









báo cáo tổng kết đề tài kc 04.19

nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính,
hạt nhân tạo trong nhân nhanh một số cây
có giá trị kinh tế


chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Đỗ Năng Vịnh

5783
28/4/2006



Hà Nội 12-2005



danh sách những ngời thực hiện đề tài kc 04-19

TT Họ và tên Cơ quan công tác Trách nhiệm
đợc giao
A
PGS.TS Đỗ Năng Vịnh Viện Di truyền Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài
B
Cán bộ tham gia nghiên cứu

1 PGS. TS Trần Văn Minh Viện SH Nhiệt Đới CN đề tài nhánh
2 TS. Dơng Tấn Nhựt TT KH Đà lạt CN đề tài nhánh
3 TS. Nguyễn Thị Lý Anh Trờng ĐH NN I CN đề tài nhánh
4 TS. Đoàn Duy Thanh Viện Di truyền Nông nghiệp
5 PGS.TS Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp
6 ThS. Cao Thị Huyền Trang Viện Di truyền Nông nghiệp
7 TS. Hà Thị Thuý Viện Di truyền Nông nghiệp
8 KS. Chu Bá Phúc Viện Di truyền Nông nghiệp
9 CN. Dơng Minh Nga Viện Di truyền Nông nghiệp
10 CN. Đỗ Minh Phú Viện Di truyền Nông nghiệp
11 CN. Phạm Thị Kim Hạnh Viện Di truyền Nông nghiệp

Mục lục


Danh mục các chữ viết tắt
Bài tóm tắt
Mở đầu
I. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây lily
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng lily
2. Tổng quan tài liệu về lily
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Qui trình công nghệ tạo củ nhỏ và siêu nhỏ ở lily
- Qui trình tạo hạt nhân tạo
- Qui trình tạo củ siêu nhỏ trong bioreactor
- Qui trình công nghệ vờn ơm
5. Kết luận
II. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây hồng môn
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng hồng môn
2. Đặt vấn đề
3. Phơng pháp thí nghiệm
4. Kết quả và thảo luận
- Nghiên cứu khảo sát ảnh hởng của các giống cây hồng môn lên
cảm ứng tạo callus từ mô lá
- Nghiên cứu ảnh hởng của nồng độ và sự phối hợp các chất nhóm
auxin với cytokinin đến phản ứng tạo callus của các loại mô in vitro
- Nghiên cứu tái sinh chồi bất định qua nuôi cấy lỏng và nuôi cấy
lỏng lắc kết hợp nuôi cấy đặc
- Nghiên cứu ảnh hởng của hàm lợng đờng và chất điều tiết sinh

trởng đến tạo phôi vô tính và nảy mầm phôi
- Nghiên cứu nhân phôi bằng nuôi cấy bioreactor
- Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo
- Nghiên cứu giá thể cho cây vờn ơm giai đoạn sau in vitro
5. Kết luận
III. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây sa nhân
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng sa nhân
2. Tổng quan tài liệu về sa nhân
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Hoàn thiện qui trình nhân nhanh sa nhân in vitro
- Tạo củ siêu nhỏ từ cây sa nhân in vitro
- Nghiên cứu tạo, tái sinh mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính ở sa nhân
- Nghiên cứu nhân sinh khối callus phôi hoá sa nhân
- Nghiên cứu khả năng phát sinh phôi vô tính của sa nhân
- Các nghiên cứu giai đoạn vờn ơm
5. Kết luận
VI. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây gỗ tếch
1.
Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở cây tếch
2. Tổng quan tài liệu về cây tếch
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Tạo vật liệu nuôi cấy in vitro cây tếch
- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các loại mô nuôi cấy khác nhau
ở cây tếch
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá ở cây tếch
- Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá

- Quy trình tạo hạt tếch nhân tạo
- Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây tếch
- Quy trình kỹ thuật chăm sóc tếch sau nuôi cấy in vitro
5.
Kết luận
V. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây Bạch đàn
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng Bạch đàn
2. Đặt vấn đề
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các lát cắt thân và lá non Bạch
đàn
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá ở Bạch đàn
- Nghiên cứu tạo phôi mầm từ lát cắt mỏng thân chồi Bạch đàn in
vitro
- Quy trình tạo hạt Bạch đàn nhân tạo
- Quy trình kỹ thuật chăm sóc Bạch đàn sau nuôi cấy in vitro
5. Kết luận
VI. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây Trầm hơng
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở Trầm hơng
2. Tổng quan tài liệu về cây Trầm hơng
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Tạo vật liệu nuôi cấy in vitro cây Trầm hơng
- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các loại mô nuôi cấy khác nhau
ở cây Trầm hơng
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá và tạo phôi vô
tính

- Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy phát sinh phôi mầm Trầm hơng
- Quy trình tạo hạt nhân tạo từ phôi mầm Trầm hơng
- Hoàn thiện quy trình vi nhân giống Trầm hơng
- Quy trình kỹ thuật chăm sóc Trầm hơng sau nuôi cấy in vitro
Kết luận
VII. Nghiên cứu áp dụng công nghệ Bioreactor trong nhân nhanh
một số cây có giá trị kinh tế
1. Mở đầu
2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá thông qua hệ thống
bioreactor (lily, sa nhân, hồng môn, bạch đàn
- Nuôi cấy tạo và tăng sinh khối củ siêu nhỏ lily trong hệ thống
bioreactor
4. Kết luận

Kết luận và đề nghị

Tài liệu tham khảo
Phụ lục1. Khóa luận sinh viên và luận văn tốt nghiệp
Phô lôc 2. C¸c bµi b¸o cã liªn quan ®Õn ®Ò tµi KC 04-19
Phô lôc 3. C¸c hîp ®ång ®µo t¹o vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ
liªn quan ®Õn ®Ò tµi KC 04-19





C¸c ch÷ viÕt t¾t

α-NAA α- Naphtalene acetic acid
2,4-D 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid
BAP Benzyl amino purine
C§HST ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng
GA3 Giberrelin
IAA Indole-3-acetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
MT M«i tr−êng
TB Trung b×nh

















Mở đầu
Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng hoàn thiện quy trình tạo phôi vô tính ở quy mô thí nghiệm và trong các

bioreactor.
- Xây dựng đợc quy trình tạo hạt nhân tạo.
- Xây dựng quy trình công nghệ sau in vtrro, xác định đợc giá thể và điều kiện môi
trờng thích hợp cho hạt nhân tạo và củ siêu nhỏ. Tạo đợc một trăm nghìn cây
khoẻ.
Mục tiêu dài hạn: Mở rộng ứng dụng công nghệ mới cho các cây lâm đặc sản và
cây trồng quý hiếm khác.
Nội dung nghiên cứu
1.1. Tạo phôi vô tính
Nghiên cứu ảnh hởng của các mô nuôi cấy khác nhau lên quá trình phát sinh, phát
triển và nhân nhanh phôi vô tính ở các đối tợng nghiên cứu của đề tài (Cây lâm
nghiệp: Dòng bạch đàn U6, tếch, cây Trầm hơng; Cây dợc liệu: sa nhân, Các cây
hoa: hồng môn và hoa loa kèn thơm - Lily thơm).
Nghiên cứu ảnh hởng của các yếu tố môi trờng đối với sự phân hoá, sinh sản và
sinh trởng của phôi vô tính trong điều kiện nuôi cấy đặc, lỏng lắc và Bioreactor.
Xây dựng quy trình nhân phôi vô tính ở quy mô thí nghiệm và quy mô sản xuất trong
các Bioreactor.
1.2. Tạo củ siêu nhỏ - Micro
Nghiên cứu quá trình phát sinh củ siêu nhỏ ở cây Loa kèn và cây sa nhân trong các
môi trờng và phơng thức nuôi khác nhau (môi trờng đặc tĩnh, lỏng lắc, Bioreactor)
Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng lên sự phát sinh, số lợng và
chất lợng của củ micro ( khả năng nảy mần của củ)
1.3. Công nghệ hoá quá trình nhân giống bằng Bioreactor
Xây dựng quy trình công nghệ bioreactor nhằm sản xuất phôi vô tính, củ nhỏ và siêu
nhỏ.
1.4. Tạo hạt nhân tạo
Nghiên cứu tạo các màng bọc hạt nhân tạo từ các chất liệu khác nhau và một số chất
bổ sung thích hợp cho bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo (gồm phôi vô tính và
củ).
Nghiên cứu quy trình sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính và củ siêu nhỏ.

1.5. Công nghệ vờn ơm
Nghiên cứu các kỹ thuật vờn ơm thích hợp cho nảy mầm của hạt nhân tạo và củ
siêu nhỏ trong điều kiện nhiệt đới nớc ta
Nghiên cứu chế tạo và sản xuất giá thể từ vật liệu hữu cơ và khoáng vật sẵn có ở nớc
ta. Nghiên cứu các mẫu khay chậu trồng cây thích hợp cho số lợng cây sống khoẻ
mạnh tối đa / m2.
1.6. Xây dựng mô hình:
Nghiên cứu xây dựng mô hình trồng thử các cây của đề tài







1


nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính,
hạt nhân tạo trong nhân nhanh lily
Sản phẩm của đề tài:
A. Các giống tuyển chọn
- Viện Di truyền Nông nghiệp tuyển chọn 12 giống lily (thứ tự 1 đến 12)
- Trờng đại học Nông nghiệp I tuyển chọn 4 giống (thứ tự 13 đến 16)
- Phân viện sinh học Đà Lạt sử dụng 2 giống (thứ tự 17, 18)
18 giống trên đều là những giống cho hoa đẹp, hấp dẫn, màu sắc đa dạng, có
khả năng thơng mại hoá cao, đặc biệt nhiều giống sinh trởng tốt, thích hợp
với khí hậu nhiệt đới.
Bảng 1. Danh sách 18 giống tuyển chọn làm vật liệu nghiên cứu
TT Giống KH Vật liệu nghiên cứu

1 Asiatic Lily Antarctica 1
2 Asiatic Lily Malta 2
3 Asiatic Lily Toscana 3
4 Asiatic Lily London 4
5 Asiatic Lily Rhodos 5
6 Asiatic Lily Grandcru 6
7 Oriental Lily Casablanca 7
8 Oriental Lily Parmount 8
9 La Lily My Fair Lady 9
10 Trumpet Lily Regal 10
Đốt thân, vảy củ
11 Lilium Oriental Sorbone Th Lát cắt ngang bầu, vòi nhụy, đế hoa
12 Lilium longiflorum L4 Lát cắt ngang vảy củ in vitro
13 Lilium Oriental Hybrid StaGazer chồi in vitro, lá non, đoạn thân mang mắt
ngủ, cánh hoa, bầu quả, bao phấn, đế hoa
14 Lilium Asiatic Hybrid Conecticut King
15 Lilium LA Hybrid Royal Trinial
chồi in vitro thu đợc từ protocorm

16 Lilium Oriental Hybrid Siberia Vảy củ in vitro
17
Lilium longiflorum 'nellie white'
Vảy củ in vitro và ex vitro, đế hoa, thân non
18
Lilium Oriental Tiber
đế hoa, thân non

2

1
2
3
5
4 - 6
7
8
9
10
Lilium longiflorum Thunb.
Lilium Oriental Sorbone
Lilium Oriental Tiber
Lilium longiflorum 'nellie white'
Sta
Sib
Conectic
Royal Justice,
H×nh 1. C¸c gièng hoa lily sö dông trong nghiªn cøu

3


B. Quy trình
- Quy trình công nghệ tạo củ siêu nhỏ từ vảy củ, lát mỏng tế bào vảy củ và
mô sẹo phôi hoá
- Quy trình tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính, chồi mầm (protocorms) và củ
siêu nhỏ
- Quy trình công nghệ tạo củ siêu nhỏ bioreactor
- Quy trình công nghệ vờn ơm

C. Cây giống
- Tổng số cây giống đạt đợc: 52.000 cây
D. Các kết quả khác:
- Đào tạo:
Thạc sỹ: 02 ngời
Cử nhân, kỹ s : 20 ngời
- Bài báo:
+ Nguyễn Thái Hà, Dơng Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Thu Về, Lê
Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003). Nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro
các giống hoa Lilium. Báo cáo khoa học, Hội nghị CNSH toàn quốc,
Hà nội, trang 875-879
+ Nguyễn Thái Hà, Dơng Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Thu Về, Lê
Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003). Nghiên cứu khảo nghiệm và nhân
nhanh một số giống Lilium nhập nội, Thông tin Công nghệ sinh học,
Viện Di truyền Nông nghiệp.
+ Nghiên cứu tạo củ lily in vitro và sự sinh trởng của cây trồng từ củ
in vitro. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn số 1/2005
+ Nguyễn Thị Thanh Hiền, Mai Thị Ngọc Hơng, Trần Ngọc Thuỷ
Tiên, Phan Xuân Huyên, Dơng Tấn Nhựt, Đỗ Năng Vịnh (2003).
Bớc đầu nghiên cứu việc tạo hạt nhân tạo và ứng dụng trong nhân
giốn vô tính và bảo quản. Báo cáo khoa học, Hội nghị CNSH toàn
quốc, Hà nội, trang 935-938.

4


+ Dơng Tấn Nhựt, Nguyễn Quốc Thiện, Nguyễn Thành Hải, Đoàn Thị
Quỳnh Hơng, Nguyễn Thị Thuý Hằng, Nguyễn Ngọc Kim Vy,
Nguyễn Văn Bình, Phan Xuân Huyên, Nguyễn Thị Diệu Hơng, Đỗ
Năng Vịnh (2004). Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc

gia tăng sự tái sinh chồi và nâng cao chất lợng cây hoa lily ( Lilium
longiflorum). Tạp chí CNSH 2 (4): 487-499
+ Dơng Tấn Nhựt, Trần Ngọc Thuỷ Tiên, Mai Thị Ngọc Hơng,
Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phan Xuân Huyền, Bùi Văn Lệ, Đỗ Năng
Vịnh (2004). Một số kết quả nghiên cứu về hạt nhân tạo của hoa lily
(Lilium spp.), Tạp chí CNSH, 2 (3): 359-370.
+ Dơng Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Huyền Trâm, Nguyễn Thành Hải, Phan
Nhã Uyên, Hà Thị Thuý, Đỗ Năng Vịnh (2006). ảnh hởng của kiểu
gen hoa lily lên khả năng tái sinh từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt
ngang thân non và vảy củ. Tạp chí CNSH. Đã chấp nhận đăng.

+ Duong Tan Nhut, Nguyen Thi Huyen Tram, Truong Kim Phuong,
Nguyen Thi Dieu Huong, Phan Xuan Huyen, Nguyen Tri Minh, Tran
Linh Thuoc, Bui Van Le, Do Nang Vinh. (2005) Effect of explant age
on direct somatic embryogenesis by culturing young stem transverse
thin cell layers of Lilium longiflorum. Proceedings of Vietnam-Korea
International symposium on Biotechnology and Bio-system
engineering. Nong Lam University, pp. 139-144.

+ Quy trình TBKT:
Đợc Bộ NN và PTNT công nhận tạm thời (QĐ 2215QĐ/BNN-KHCN
22/8/04: Biện pháp kỹ thuật nhân nhanh giống hoa lilium bằng nuôi cấy
mô. Tác giả: Đỗ Năng Vịnh và cộng sự: Nguyễn Thái Hà, Dơng Minh
Nga, Hà Thị Thuý, Lê Thu Về, Lê Huy Hàm


1


Chơng i

Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu về chi Lilium
1.1.1. Phân loại
Chi Lilium thuộc họ Liliaceae, bộ Liliales, phân lớp Liliidae, lớp
Liliopsida (Võ Văn Chi, 1977). Họ Liliaceae là một trong những họ thực vật
lớn nhất với 200 chi và hơn 3000 loài. Chi Lilium gồm khoảng 220 loài, trong
đó một số loài đợc trồng cách đây tới 3000 năm . Sau năm 1950, khoảng
1000 giống lily mới đã đợc lai tạo và đăng ký trên thế giới với nhiều giống
lai có nguồn gốc từ hai loài Nhật Bản L. auratum và L. speciosum (Pelkonen,
2005).
Dựa vào nguồn gốc phát sinh, ngời ta chia các loài thuộc chi Lilium
thành 7 nhóm nh sau (Woodcock and Stearn, 1950):
Bảng 1.1. Phân loại các loài thuộc chi Lilium
Nhóm Loài
1. Nhóm Martagon L. distichum, hansonii, martagon, tsingtauense
2. Nhóm American a) L. bolander, columbianum, kelloggii, humboldtii, rubescens,
washingtonianum
b) L. maritimum, nevadense, occidentale, pardalinum, parryi, parvum, roezlii
c) L. canadense, grayi, iridollae, michauxii, michiganense, superbum
d) L. catesbaei, philadenphicum
3. Nhóm Candidum L. bulbiferum, candidum, carniolicum, chalcedonicum, monadelphum,
polyphyllum, pomponium, pyrenicum
4. Nhóm Oriental L. auratum, brownii, japonicum, nobilissimum, rubellum, speciosum
5. Nhóm Asiatic a) L. davidii, duchartrei, henryi, lancifolium, lankogense, leichtlinii,
papilliferum
b) L. amabile, callosum, cernuum, concolor, pumilum
c) L. bakerianum,
6. Nhóm Trumpet a) L. leucanthum, regale, sargentiae, sulphureum
b) L. formosanum, longiflorum, neilgherrense, philippinense, wallichianum
7. Nhóm Dauricum L. dauricum, maculatum

2


Dựa vào kiểu nảy mầm, ngời ta chia lily
thành hai nhóm chính: nhóm nảy mầm trên mặt đất
và nhóm nảy mầm dới mặt đất (hình 1.1). Theo
kiểu thứ nhất, hạt nảy mầm ngay sau khi gieo,
không có ngủ nghỉ và cây con không bị ức chế sinh
trởng. Ngợc lại, kiểu nảy mầm thứ hai thờng bị
kiểm soát bởi ngủ nghỉ, ngủ nghỉ chỉ đợc giải
phóng sau khi xử lý hạt và củ ở nhiệt độ thấp.
Kiểu nảy mầm đóng vai trò quan trọng trong
tiến hoá do nó có tính di truyền và tính đặc hiệu loài. Hầu hết các loài lily
Eurasian và American đại diện cho kiểu nảy mầm gián đoạn dới mặt đất
trong khi phần lớn các loài Asiatic đại diện cho kiểu trên mặt đất không gián
đoạn (Pelkonen, 2005).
1.1.2. Phân bố
Lilium phân bố chủ yếu ở châu á, châu Âu và Bắc Mỹ (hình 1.2). Trung
Quốc là trung tâm phát sinh chủ yếu của lily, chiếm khoảng 50% các loài lily
trên thế giới, trong đó có 30 loài và 18 giống nguyên bản (Zhao et. al., 1996).
Khu vực Bắc Mỹ đóng góp 20 loài đợc phân thành loài phơng Đông và
phơng Tây. Cha tìm thấy loài lily nào có nguồn gốc từ bán cầu Nam
(Pelkonen, 2005).
Nh vậy, hầu hết các giống Lilium đều thích hợp với khí hậu khô, mát
mẻ, đặc biệt trên các vùng núi cao. Ngoài ra, có một số giống chịu nhiệt
thờng tập trung ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt, trong đó có 3 loài quan
trọng là L. neilgherense từ Nam ấn Độ, L. formosanum từ Đài Loan, Trung
Quốc và L. longiflorum từ Nam Nhật Bản và Đài Loan. Những loài này đều có
đặc điểm là cây khoẻ, chịu nhiệt, ra hoa sớm và thích hợp ra hoa quanh năm.

(Woodcock and Stearn, 1950)


a
b
Hình 1.1. Các kiểu nảy mầm
ở lily; a) Kiểu trên mặt đất;
b) Kiểu dới mặt đất

3


Hình 1.2. Bản đồ phân bố địa lý của các loài
lily nguyên bản
a) Các loài Eurasian phân bố từ Đại Tây Dơng qua Địa
Trung Hải và Trung Âu tới dãy núi Caucasus và Uran
b) Hầu hết các loài American phân bố từ Đại Tây Dơng
đến Trung Tây. Sự phân bố của các loài phơng Đông
bị giới hạn bởi dãy núi Rocky và Thái Bình Dơng.
c) Hầu hết các loài lily nguyên bản đều có nguồn gốc
Đông á, phân bố từ Thái Bình Dơng đến dãy núi Uran
và Caucasus, Bắc ấn, Burma ở phía Nam và Siberia ở
phía Bắc.
1.1.3. Đặc điểm sinh học của chi Lilium
a) Cấu trúc cơ quan
Hầu hết các thành viên thuộc chi Lilium là những cây lu niên, có cơ
quan dự trữ dạng củ, hoa lỡng tính nhng thờng có tính tự bất hoà hợp.
Hình 1.3 cho thấy cơ quan chính của cây lily trởng thành bao gồm rễ chính,
củ và cành hoa. Kích thớc, hình dáng của các cơ quan này thay đổi rất nhiều
trong cùng một chi. Củ thờng không có lớp vỏ bảo vệ, đĩa gốc củ là thân, còn

vảy củ là lá chuyên hoá chứa nớc và dinh dỡng
dự trữ. Mô phân sinh đỉnh tạo ra cành hoa trong
khi mô phân sinh nách sẽ tiếp tục sinh trởng và
tạo ra các củ bên sau khi chồi chính chết đi. Hoa
mọc cách hoặc đối xứng toả tròn trên đỉnh cành.
Hoa lily đẹp, hấp dẫn với nhiều kích thớc, màu
sắc khác nhau và là hình mẫu cho cấu trúc hoa của
cây một lá mầm (Võ Văn Chi, 1977; Pelkonen,
2005).
b) Cấu trúc hệ gen
Lily là một trong những thực vật có kích
thớc hệ gen lớn nhất và thay đổi giữa các loài. Ví
dụ, hệ gen ADN của L. henryl có tới 32 tỷ cặp
Hình 1.3. Cấu trúc cơ
q
uan ở lil
y
Chồi hoa
Hoa
Lá
Thân cành
Củ
Rễ


4


basơ và ở một số loài có thể tới 100 tỷ. Kích thớc lớn một phần là do các
trình tự lặp lại liên tiếp trong NST, các trình tự này vẫn tồn tại qua hàng triệu

năm tiến hoá, chứng tỏ tính bảo thủ cao trong cấu trúc hệ gen lily (Suzuki and
Nakano, 2002). Hệ gen đợc cấu tạo bởi các NST tâm giữa và tâm cận mút
lớn. Số lợng NST lỡng bội bình thờng (2n=24) chiếm u thế ở các loài và
giống lai, cũng nh các giống tuyển chọn, chỉ có một số rất nhỏ là dạng tam
bội (3n=36) bất thụ. Ngoài ra, dạng tứ bội cũng đợc tìm thấy trong tự nhiên
và những loài này thờng hữu thụ. Số lợng NST bất thờng cũng có thể quan
sát đợc ở các loài nghiên cứu nhng sự tồn tại của chúng rất hiếm (Pelkonen,
2005).
1.1.4. Chi Lilium- một chi có giá trị kinh tế cao
Lily, tulip và fressia là ba cây có củ quan trọng nhất, chiếm 24% thị
trờng hoa thế giới (Nhut, 2001a). Lilium đứng hàng thứ bảy về sản lợng hoa
cắt và cũng là cây trồng chậu rất phổ biến, chủ yếu nhờ hoa lớn, đẹp, có hơng
thơm ngọt ngào với nhiều màu sắc hấp dẫn (Suzuki and Nakano, 2002).
Tuy nhiên, đây là loại cây đợc trồng bằng củ nên nguồn củ giống đóng
vai trò quyết định đến tình hình sản xuất lily trên quy mô thơng mại. Năm
2002, sản lợng củ Lilium chiếm 19% tổng sản lợng củ thế giới, chỉ đứng sau
Tulipa (39%) và tơng đơng với Narcissus (20%) (De Hertogh and Le Nard,
2003). Trong đó, Hà Lan là nớc đứng đầu về xuất khẩu củ với thị trờng tiềm
năng nhất là Mỹ, tiếp theo là Đức, Nhật, Anh, Italy, Pháp và Canada (Trim ,
2005). Hàng năm, Hà Lan sản xuất tới một tỷ củ giống lily cho hoa cắt xuất
khẩu, đạt giá trị khoảng 300 tỷ guider (Van Tuyl, 1997). Hiện nay, thị trờng
hoa tại Mỹ, Đức và Nhật Bản đang phát triển mạnh. Đặc biệt, Nhật Bản đợc
đánh giá là quốc gia có tốc độ tăng trởng nhanh nhất về nhập khẩu và tiêu
thụ hoa trên thế giới. Ngoài ra, các nớc châu á nh Trung Quốc, Hàn Quốc,
ấn Độ cũng đóng góp đáng kể vào ngành công nghiệp này (Cut Flower
Production in Asia, FAO, 1998).


5

Bảng 1.2. Tình hình sản xuất hoa lily ở một số nớc
TT Nớc Năm 89/90/ha Năm 97/98/ha Năm 99/2001/ha
1 Hà Lan 1200 4000 5000
2 Pháp 30 150 420
3 Canada và Mỹ 200 215 235
4 Nhật 370 350 360
5
úc
50 250 400
6 Tân Tây Lan 4 40 70
7 Chi Lê 8 45 135
8 Hàn Quốc 131 209 250
Đối với nớc ta, lily chỉ đợc sản xuất giới hạn ở những khu vực có khí
hậu mát quanh năm nh Đà Lạt, Sapa. Lily đợc xem là loại hoa cao cấp,
trớc đây chỉ xuất hiện trong những dịp lễ trọng đại hoặc ngày Tết, nhng
hiện nay khi đời sống đã đợc cải thiện, nhu cầu về loài hoa này có xu hớng
tăng lên rõ rệt song giá hoa vẫn rất cao, từ 15.000 đến 25.000 đồng một cành,
đặc biệt là những giống có hơng thơm (Ly and Linh, 2004).
Với các điều kiện thuận lợi đó, ngành trồng hoa Việt Nam đang có
những bớc chuyển biến mạnh mẽ nh đầu t, mở rộng diện tích trồng hoa,
nâng cao sản lợng và chất lợng hoa xuất khẩu tại các trang trại lớn ở Lâm
Đồng và một số tỉnh miền Bắc. Hiện nay, công ty Dalat Hasfarm là nhà xuất
khẩu hoa lily chính ở nớc ta.
Quy trình vi nhân giống Lilium spp. bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
đã và đang đợc xây dựng hoàn thiện sẽ là nguồn cung cấp củ giống với số
lợng lớn, chất lợng cao, đồng nhất và ổn định. Qua đó, giúp các nhà trồng
hoa giảm chi phí nhập củ giống từ nớc ngoài cũng nh chủ động về nguyên
liệu sản xuất trong nớc cho hoa cắt và cây trồng chậu.
Nh vậy, tiềm năng sản xuất hoa lily ở nớc ta là rất lớn, cùng với sự

phát triển của các quy trình vi nhân giống hiện nay, chắc chắn ngành trồng
hoa Việt Nam sẽ có những bớc tiến vững chắc hơn trong thời gian tới.

6


1.2. Nghiên cứu nhân giống vô tính trên đối tợng lily
Nhân giống vô tính lily theo phơng pháp truyền thống

Nhân giống truyền thống ở lily gặp nhiều khó khăn do những trở ngại
chính trong việc điều khiển ngủ nghỉ của củ. Mặt khác, thời gian ngủ nghỉ rất
khác nhau giữa các giống lily gây bất lợi cho sản xuất hoa trên quy mô thơng
mại (Vũ Văn Vụ, 1997; Okubo, 2000).
Củ lily có thể tái sinh bằng các phơng pháp thông thờng dựa trên
nguyên lý chung: ở phần nách vảy hoặc nách lá (phần tiếp xúc giữa vảy và đĩa
gốc hoặc giữa gốc lá và thân) có một mắt ngủ, sau này sẽ phát triển thành củ
bên. Trong đó, phơng pháp phổ biến nhất của sản xuất củ truyền thống là kỹ
thuật tách vảy sinh đôi (twin-scaling). Củ cái đợc loại bỏ lá, rễ và cắt dọc
thành 4- 16 mảnh tuỳ theo kích thớc của củ, mỗi mảnh đợc cắt thành các
mảnh nhỏ hơn gồm 2 vảy gắn với đĩa gốc. Từ một củ lớn có thể thu 30- 60 vảy
đôi, những vảy này đợc vùi trong giá thể ẩm, thoáng khí nh cát hoặc đất pha
và tạo củ nhỏ sau 2-3 tháng (Meerow, 2001).
Nhõn ging bng ht cú nhiu u im nh cú th thu c nhiu ht
trong mt thi gian ngn t mt vi cõy m cú cht lng cao, c bit l
Lilium thỡ virus khụng th no lõy lan t cõy m sang cõy con bng ht. Do
vy, mc
nhim virus ca cỏc cõy nhõn ging bng ht l khỏ thp.
Tuy nhiờn, ngoi nhng thun li trờn thỡ hu ht cỏc ging Lily u c
nhõn ging vụ tớnh vỡ cỏc cõy nhõn ging hu tớnh t ht thng khụng ng
nht, thng xut hin nhng bin d di truyn. Sau õy l mt vi phng phỏp

nhõn ging vụ tớnh cõy hoa Lily:
a. To c t thõn
Nhiu loi cú giỏ tr thng mi quan trng u to c t ph
n phớa
di ca thõn. Cỏc c ny cú ngun gc t nỏch ca cỏc lỏ ging nh lỏ bc
(Blaney v Roberts, 1966). S lng v tc tng trng ca c cú rt nhiu

7


khác biệt, phụ thuộc vào điều kiện trồng như chiều sâu bên dưới đất của củ
mẹ, cách cắt chồi hoa.
b. Tạo củ từ thân khí sinh
Củ từ thân k
ý sinh được tạo thành từ nách của những thân mọc bên trên
mặt đất. Sự cắt chồi hoa thúc đẩy sự tăng trưởng của các củ con này. Những
giống Lily không tự tạo củ bằng cách này, chẳng hạn như L. longiflorum, có
thể được cảm ứng bằng cách phun lên lá hợp chất cytokinin 6-benzylamino-9-
(tetrahydropyrany-2-yl)-9H-purine (PBA) (Nightingale, 1979).
c. Tạo củ bất định từ vảy củ
Khi tách vảy củ khỏi củ mẹ thì từ
vảy củ đó có thể tạo thành củ bất định
hướng vào vị trí gần với vết thương dưới những điều kiện thích hợp. Các củ
này có nguồn gốc từ sự phân chia của các tế bào biểu bì và bên trong biểu bì
(Godden và Watson, 1962). Nhiều loài Lily có thể được nhân giống vô tính
theo cách nêu trên và phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sản xuất một
số lượng lớn các cây sạch bệnh và có chấ
t lượng. Tất cả các vảy củ, ngoại trừ
vảy củ nhỏ nhất nằm phía bên trong củ, đều có thể sử dụng được (Rees,
1972).

Sau khi đã được bảo vệ khỏi sự tấn công của nấm (bằng cách ngâm vảy
trong dung dịch Benlate, Difolatan, hay những hợp chất diệt nấm khác) thì
các vảy củ có thể trồng trực tiếp ngoài đất trồng (như trường hợp của L.
longiflorum) hoặc có thể ủ ở nơi cát ẩm hay vermiculite đã bão hòa nước
trong những túi polyethylene trước khi mang ra trồng trong đất (Hartmann và
Kester, 1975). Nồng độ oxygen trong túi phải đủ cao, đặc biệt trong 7 tuần
đầu.
Củ có thể lấy vảy vào bất kỳ thời điểm nào trong năm, tuy nhiên
khoảng thời gian đầu tiên ngay sau khi hoàn tất sự ra hoa được cho là tốt nhất
(Emsweller, 1957). Trong thực tế thì củ thường được lấy vảy vào sau vụ thu

8


hoch hố mun hoc vo thu. Vy t nhng c ó qua x lý ụng lnh (3-5
thỏng 10
o
C i vi L. longiflorum Hinomoto hoc 2 tun 0
o
C i vi
ging Enchantment) thỡ ra nhiu c hn (Matsuo v Arisumi, 1979).
Nói chung, các kỹ thuật nhân giống vô tính thông thờng có một số
nhợc điểm: hệ số nhân rất thấp, thờng chỉ tạo đợc một củ nhỏ từ mảnh vảy
củ với thời gian cảm ứng ngủ nghỉ kéo dài (2- 3 tháng), tốc độ sinh trởng
chậm và chỉ giới hạn ở một số giống Lilium, lây lan bệnh trong quá trình
nhân giống (Nhut, 1998).
Nuôi cấy mô tế bào ở Lilium spp.

Nuôi cấy mô tế bào đợc xem là phơng pháp hiệu quả nhất để tạo củ giống
chất lợng cao, sạch bệnh với số lợng lớn, ổn định, đồng nhất về mặt di

truyền, đáp ứng mục đích sản xuất củ trên quy mô thơng mại ở nhiều giống
Lilium (Gamborg, 2002; Nhut, 1998; Pelkonen, 2005). Các củ lily in vitro có
thể đợc sản xuất thông qua hai con đờng: phát sinh cơ quan (củ) và phát
sinh phôi.
1.2.1. Nuụi cy mụ phõn sinh
Hin ti thỡ cú n 9 loi virus nh hng n cõy hoa Lily, trong s ú thỡ
LSV l loi virus thng thy nht. Nhng c gng to cỏc cõy sch bnh
LSV c bt u vo nhng nm 1970 M v sau ú l ti H Lan. K
thut c s dng l nuụi cy mụ phõn sinh. Mụ phõn sinh
c dựng
nuụi cy cú kớch thc thay i t 0,2-0,4 mm (Nishizawa v Nishi, 1996)
n 0,5-2,0 mm (Asjes et al., 1974). Cỏc cõy con phỏt sinh t nuụi cy mụ
phõn sinh sng tt sau khi chuyn sang t trng. Tuy nhiờn, bng cỏc
phng phỏp kim tra min dch hc, huyt thanh hc hoc bng cỏch soi cỏc
t bo di kớnh hin vi in t, ngi ta cng phỏt hin rng cỏc cõy t con
ng nuụi cy mụ phõn sinh vn cú th mang virus (Walkey, 1978).
1.2.2. Tạo củ in vitro thông qua con đờng tái sinh trực tiếp

9


Củ lily có thể đợc tái sinh in vitro trực tiếp từ vảy củ hoặc đốt thân.
Đặc điểm chung của các phơng pháp này là tạo củ bên từ những cơ quan vốn
đợc xem là trung tâm phát sinh củ (đĩa gốc, đốt thân) và củ hình thành
thờng không có hiện tợng biến dị (Nhut, 1998).
Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật nuôi cấy lát cắt của các cơ quan, bộ phận
mà thông thờng không tạo củ cũng rất đợc chú trọng trong nhân giống
Lilium nh nuôi cấy lát cắt vảy củ không chứa đĩa gốc, lá và các thành phần
của hoa với hệ số nhân rất cao gấp 5-7 lần so với phơng pháp tách vảy
thông thờng (Teixeira da Silva, 2003). Kỹ thuật này đã đợc tác giả Trần

Thanh Vân gọi là nuôi cấy lớp mỏng tế bào, công bố lần đầu tiên trên tạp chí
Nature năm 1973 (Nhut et.al., 2001a). Đây là kỹ thuật tạo cơ quan bất định,
liên quan đến việc điều khiển kích thớc mẫu ban đầu để cảm ứng và tối u
hóa quy trình tái sinh ở thực vật (Phillips, 2004). Đến nay, nuôi cấy lớp mỏng
tế bào đã trở thành một công nghệ đầy hứa hẹn trong nhân nhanh thơng mại
Lilium spp. cũng nh nhiều giống cây trồng khác do có hệ số nhân cao và ổn
định về mặt di truyền (Nhut et.al., 2001a).
1.2.1.1. Những yếu tố ảnh hởng đến tái sinh củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ
in vitro
a) ảnh hởng của vật liệu khởi đầu nuôi cấy
Vật liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo củ, bao
gồm giống, loài, tuổi mẫu, vị trí, kích thớc mẫu và hớng đặt mẫu trong môi
trờng (Nhut et. al., 2003) .
Theo Zaidi và cộng sự (2000), các cơ quan ở cây một lá mầm có củ và
căn hành đợc chia làm hai vùng: vùng trên mặt đất và vùng ngầm; cơ quan
thuộc vùng ngầm có khả năng tái sinh củ mạnh hơn nhiều so với vùng trên
mặt đất, trong đó tần số tạo củ từ lát cắt vảy củ là 29% nhng từ đỉnh chồi và
chồi hoa chỉ có 10%. Củ lily đã đợc tạo ra từ tất cả các loại cơ quan (trừ rễ)
nh lát cắt từ củ mẹ (Varshney, 2000), củ in vitro
(Nguyễn Thị Lý Anh và
cộng sự, 2005; Nguyễn Thái Hà và cộng sự, 2003; Chang et. al., 2000; Lian et.

10


al., 2003; Nhut D.T., 1998), lá (Bacchetta, 2003), đốt thân (Nhut, 1998), mô
phân sinh (Mei-Lan et. al., 2003), hoa (bầu nhụy , đế hoa) (Nhut et. al., 2001c)
ở nhiều giống Lilium: L. longiflorum Thunb. và một số giống lai Lilium
Oriental. Trong số các cơ quan này, mẫu lát cắt vảy từ củ in vitro đợc sử
dụng nhiều nhất trong nhân nhanh các giống lily do hiệu suất tạo củ cao. Các

lát cắt tế bào sử dụng cho mục đích này thờng có kích thớc từ vài micromét
đến một vài milimét, ví dụ ở L. longiflorum Thunb., lát cắt ngang vảy củ in
vitro có độ dày từ 1- 3 milimét đều cho phản ứng tạo củ tốt (Nhut et. al.,
2003).
b) ảnh hởng của CĐHST
Chúng ta biết rằng ngủ nghỉ ảnh hởng mạnh mẽ đến phát sinh hình
thái của các cây dạng củ. Thông thờng cây ở giai đoạn ngủ nghỉ chỉ hình
thành những vảy củ và không ra lá (Vũ Văn Vụ, 1997). Với mục đích tạo củ
từ lát cắt tế bào, việc cảm ứng ngủ nghỉ đóng vai trò rất quan trọng. Nhiều
nghiên cứu cho thấy các CĐHST là nhân tố thiết yếu trong cảm ứng ngủ nghỉ.
Takayama và Misawa (1979) đã chỉ ra mối tơng tác giữa auxin (NAA) và
cytokinin (kinetin) đối với sự hình thành củ và rễ, tỷ lệ auxin/ cytokinin cao
làm tăng sự hình thành rễ, ngợc lại tỷ lệ này thấp làm tăng sự hình thành củ
(Pelkonen, 2005). Dơng Tấn Nhựt và cộng sự (2000) lại đề cập đến vai trò
độc lập của IBA trong tái sinh củ và cây con ở L. longiflorum do IBA có tác
dụng tích cực đối với phản ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ in vitro.
Nh vậy, CĐHST là yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hởng mạnh tới cân
bằng giữa CĐHST ngoại sinh và nội sinh, qua đó gây cảm ứng ngủ nghỉ làm
phát sinh củ in vitro.
c) ảnh hởng của đờng
Ngoài việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các CĐHST, đờng cũng có vai trò
quan trọng trong quá trình này do nó ảnh hởng đến tính thẩm thấu của môi
trờng tức là tác động vào áp lực nớc đối với mô tế bào đang biệt hoá và kích

11


thích chúng phát triển (Kumar et. al., 2005). Nồng độ đờng dao động từ 2-
6%, tuỳ thuộc loài và loại mô nuôi cấy (Pelkonen, 2005).
Tuy nhiên theo nhiều báo cáo, nồng độ đờng thích hợp cho phản ứng

tạo củ có thể cao hơn, khoảng 9- 12%. Đặc biệt, sucrose có vai trò nh một
loại đờng vận chuyển quan trọng nhất ở các cây có củ: Lilium, Narcissus; và
hàm lợng đờng cao có ảnh hởng tích cực đến sự hình thành củ và sinh
trởng phát triển của củ (Mei-Lan, 2003; Staikidou et. al., 2005). Hàm lợng
đờng 90 g/l tỏ ra thích hợp nhất trong giai đoạn tạo củ và tăng trọng lợng
củ, chủ yếu do làm tăng tích luỹ chất khô (Nhut et. al., 2001b). Nghiên cứu
của Staikidou và cộng sự (2005) ở Narcissus cũng cho thấy vai trò quan trọng
của đờng sucrose trong phản ứng tạo củ, việc bổ sung các loại đờng rợu:
manitol, sorbitol hay các monosaccharide: glucose, fructose vào môi trờng
nuôi cấy có 30 g/l sucrose đều không cho hiệu quả tốt bằng việc sử dụng mức
sucrose 90 g/l.
d) ảnh hởng của than hoạt tính và môi trờng khoáng
Than hoạt tính đã đợc báo cáo về khả năng hấp thụ các chất ức chế
trong môi trờng nuôi cấy, vì vậy có tác dụng kích thích sự phát triển của củ
in vitro. Hàm lợng than hoạt tính thích hợp thờng từ 0,5- 2 g/l (Nhut et. al.,
2001b).
Bên cạnh đó, môi trờng khoáng cung cấp các điều kiện dinh dỡng cần
thiết cho sự sinh trởng của củ. Trong các môi trờng này, môi trờng MS
đợc sử dụng phổ biến nhất ở các cây một lá mầm với tỷ lệ 68,4%, còn các
môi trờng khoáng khác kém phổ biến hơn nh môi trờng B5 10,5%, LS,
Nitsch và Nel với tỷ lệ 5,2% (Zaidiet. al., 2000).
e) ảnh hởng của yếu tố vật lý
Điều kiện chiếu sáng là yếu tố vật lý quan trọng nhất kích thích sự hình
thành củ in vitro. Nói chung, để tạo củ, điều kiện tối tỏ ra thích hợp hơn trong
khi củ ra lá cần ánh sáng hơn. Nhiều báo cáo cho thấy trong điều kiện tối, số
củ hình thành trên một mẫu nhiều hơn, kích thớc củ lớn hơn so với khi trồng

12

trong điều kiện chiếu sáng liên tục (Kumar et. al., 2005). Ngoài ra, vai trò của
chất lợng ánh sáng đối với sự biệt hoá in vitro cũng đã đợc nghiên cứu ở
một số cây có củ. Tuy nhiên cha có báo cáo nào đề cập đến vấn đề này trong
nuôi cấy mô lily (Pelkonen, 2005).
Tóm lại, con đờng tạo củ trực tiếp từ lát cắt tế bào chịu ảnh hởng của
nhiều yếu tố nh nguồn mẫu, CĐHST, đờng, ánh sáng Nhng điều quan
trọng là lựa chọn vật liệu ban đầu và môi trờng nuôi cấy thích hợp nhằm xây
dựng các quy trình nhân giống cho hệ số sản xuất củ cao nhất.
1.2.1.2. Những thành tựu nổi bật trong nghiên cứu tạo củ in vitro trực tiếp
từ lát mỏng tế bào ở Lilium spp.
Cũng giống nh hầu hết các cây dạng củ (bulbous) và căn hành
(cormous) khác, Lilium là cây một lá mầm tơng đối khó nuôi cấy in vitro hơn
so với cây hai lá mầm do những trở ngại chính trong việc điều khiển ngủ nghỉ
của củ (Nhut et. al., 2001a). Nuôi cấy in vitro ở lily đã đợc Robb báo cáo lần
đầu tiên vào năm 1957 sử dụng mẫu vảy củ Lilium speciosum Thunb. Năm
1966, Kohl và Nelson đã nuôi cấy thành công mô phân sinh đỉnh chồi ở
Lilium spp (Pelkonen, 2005; Van Tuyl, 1997). Cho đến nay, sau gần 50 năm
phát triển, các kỹ thuật nuôi cấy mô ở Lilium đã không ngừng đợc cải tiến
nhằm mục đích xây dựng và tối u hoá các quy trình nhân nhanh, cung cấp
nguồn vật liệu khởi đầu chất lợng cao cho sản xuất hoa trên quy mô thơng
mại (Pelkonen, 2005). Trong đó, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào, hạt
nhân tạo và công nghệ bioreactor (hệ thống phản ứng sinh học) đã và đang trở
thành những công nghệ mũi nhọn trong ngành công nghiệp củ giống lily. Đây
cũng chính là những thành tựu nổi bật, có tính chất đột phá trong nhân giống
lily cũng nh nhiều loài cây khác (Teixeira da Silva, 2003).
* Tạo củ trực tiếp từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở quy mô nhỏ
Trong các nghiên cứu về lớp mỏng tế bào ở Lilium, nổi bật là các công
trình của nhóm tác giả Dơng Tấn Nhựt và cộng sự trên đối tợng mô hình
Lilium longiflorum Thunb. Năm 2001, nhóm này đã sử dụng những lát cắt