tóm tắt luận án nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (taxus wallichiana zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý hiếm phân bố chủ
yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại
cao nguyên Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng với số lượng cá thể nhỏ. Trong thông
đỏ có chứa hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel
(Taxol), cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc
điều trị ung thư như
baccatin III, 10 deacetyl baccatin III Tuy nhiên,
thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong
cây thấp. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đủ đáp ứng nhu
cầu điều trị ngày càng tăng. Để khắc phục nhược điểm này bên cạnh việc
nghiên cứu nhân giống, gieo trồng tự nhiên, sinh khối tế bào (SKTB) thực
vật là hướng đi mới có triển vọng để sản xuất các hoạt chất từ dượ
c liệu nói
chung và thông đỏ nói riêng. Công nghệ SKTB thực vật là công nghệ nuôi
cấy các tế bào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình
nuôi cấy lớn, nhằm mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng
để tách chiết các hoạt chất. Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên
liệu sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo
hướng ứng dụng công nghệ SKTB thực vật, đề tài “Nghiên cứu quy trình
tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất
điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau:
1. Xây dựng qui trình tạo SKTB thông đỏ qui mô phòng thí nghiệm.
2. Xác định thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất chính
và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu SKTB thông đỏ tạo ra.
Ý nghĩa của lu

ận án
Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra được quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.). Đã khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phát
triển và hàm lượng hoạt chất trong SKTB thông đỏ góp phần tạo nguồn
nguyên liệu ổn định, bền vững và hiệu quả.
Lần đầu tiên tại Việt Nam thành phần hóa học sinh khối thông đỏ được
nghiên cứu. Xây dựng được quy trình chiế
t xuất paclitaxel từ sinh khối cũng


2


như TCCS của nguyên liệu sinh khối góp phần tạo ra nguồn hoạt chất để sản
xuất thuốc điều trị ung thư.
Những đóng góp mới của luận án
Đã nghiên cứu xây dựng được quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.) quy mô phòng thí nghiệm. Khảo sát lựa chọn được
thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy tế bào để tế bào phát triển tốt
nhất, hàm lượng paclitaxel cao nhấ
t. Đồng thời cũng xây dựng được quy
trình thu hoạch SKTB thông đỏ dùng để chiết xuất hoạt chất chống ung thư.
Xác định được các nhóm hoạt chất trong SKTB thông đỏ. Chiết xuất,
phân lập và nhận dạng được 09 hợp chất chính, trong đó có các dẫn chất
khung taxan. Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng đồng thời
paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ.
Từ SKTB thông đỏ, đã xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh chế
paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ. Sản phẩm paclitaxel có hàm lượng
98,07% đạt tiêu chuẩn USP 30.
Đã xây dựng được TCCS của SKTB thông đỏ theo USP 30 và DĐVN IV

gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ ẩm, tạp chất, định tính, định lượng.
Cấu trúc luận án: Gồm 4 chương, có 137 trang được bố cục bao gồm các
phần sau: phần đặt vấn đề (2 trang), tổng quan tài liệu (28 trang), đối tượng và
phương pháp nghiên cứu (11 trang), kết quả (62 trang), bàn luận (31 trang) và
kế
t luận (2 trang), kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (với 148 tài liệu: 15
tài liệu tiếng Việt, 133 tài liệu tiếng Anh) và phần phụ lục.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan đề cập tới 3 nội dung chính:
- Tổng quan về cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.): đặc điểm thực
vật, phân bố, thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
- Tổng quan về công nghệ SKTB thực vật: khái niệm, quy trình SKTB
và các yếu tố ảnh hưở
ng. - Tổng quan về kỹ thuật SKTB thông đỏ sản xuất


3


paclitaxel, biện pháp làm tăng hàm lượng hoạt chất, định lượng và chiết
xuất paclitaxel từ SKTB thông đỏ.

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT
Mẫu cành non cây thông đỏ 10 tuổi (Taxus wallichiana Zucc.) thu thập
tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 4 năm 2008, được Viện Sinh thái tài
nguyên sinh vật -Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam thẩm định. Các hóa
chất chuyên dụng đạt tiêu chuẩn cho nuôi cấy tế bào thực vật. Các thiết bị
nghiên cứu chuyên dụng trong nuôi cấy tế bào, phân tích.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh kh
ối thông đỏ
Quy trình tạo SKTB thông đỏ được tiến hành theo các nguyên tắc của R.
M. Enaksha, G. Parc, R.M. Cusido. Cành non thông đỏ được tiệt khuẩn, cắt
thành lát nhỏ, cấy vào môi trường thạch để tạo callus. Duy trì callus trong
môi trường thạch để tế bào không có khả năng biệt hoá trở lại. Sau đó, cấy
chuyển tế bào sang môi trường lỏng có sử dụng máy lắc. Ở giai đoạn này,
cần xác định thời gian, pH, nhiệt độ, thành phần môi trường phù hợ
p cho
sinh khối thông đỏ phát triển. Đồng thời khảo sát lựa chọn chất kích thích
sinh tổng hợp hoạt chất phù hợp. Nâng qui mô nuôi cấy lên hệ thống bình
nuôi cấy 5 lít với các điều kiện đã khảo sát. Thu hoạch sinh khối, nghiên
cứu thành phần hóa học, chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hoạt chất,
xây dựng TCCS của nguyên liệu và hoạt chất.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập m
ột số
chất chính, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu sinh khối tế bào
thông đỏ
2.2.2.1. Nghiên cứu định tính và định lượng hoạt chất trong SKTB thông đỏ
- Định tính các nhóm hợp chất trong sinh khối bằng các phản ứng hóa
học đặc trưng và định tính paclitaxel và baccatin III bằng HPLC.
- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paclitaxel và baccatin III
trong sinh khối bằng HPLC.


4


2.2.2.2. Nghiên cứu chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính
trong sinh khối

Chiết xuất các hợp chất trong SKTB bằng phương pháp chiêt siêu âm,
tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo và pha thuận. Xác định cấu trúc hóa học
các chất phân lập được dựa trên các số liệu phổ UV, IR, ESI-MS, NMR:
1
H,
13
C-NMR, DEPT 90, DEPT 135, HSQC, HMBC, COSY và NOESY.
2.2.2.3. Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ
Chiết xuất paclitaxel trong SKTB thông đỏ được tiến hành theo phương
pháp chiết bằng siêu âm. Tinh chế sản phẩm bằng kết tủa, kết tinh phân
đoạn và sắc ký cột pha đảo. Trong quá trình đó khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng tới hiệu suất và hàm lượng paclitaxel trong từng giai đoạn.
2.2.2.4. Xây dựng TCCS của Thông đỏ sinh khối
Xây dựng TCCS của SKTB thông đỏ theo phương pháp c
ủa DĐVN IV
và Dược điển Mỹ 30.
2.2.2.5. Kiểm nghiệm chất lượng paclitaxel
Tiến hành định lượng paclitaxel theo phương pháp trong chuyên luận
paclitaxel trong USP 30.
2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.1. Tạo callus thông đỏ
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy tạo callus
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy
STT Môi trường Số mẫu cấy
Khối lượng
callus (mg)
p

1 MS 50 14,3 ± 1,5
p
3-1
<0,05
2 SH 50 20,1 ± 2,1
p
3-2
<0,05
3 B5 50 24,5 ± 2,2
*
4 White 50 12,9 ± 1,5
p
3-4
<0,05


5


Khi sử dụng môi trường B5 nuôi cấy tạo callus, tốc độ phát triển của tế
bào cũng cao hơn so với các môi trường còn lại (với p< 0,05 ).
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tạo callus thông đỏ
cho thấy: khối lượng callus đạt cao nhất ngày thứ 35. Sau thời gian này
khối lượng callus giảm dần.
3.1.1.3. Ảnh hưởng của các ch
ất kích thích sinh trưởng
* Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát
triển của callus (n=50)

STT Lô nghiên cứu Khối lượng callus (mg)
1 2,4-D + kinetin 17,8 ± 1,4
2 2,4-D + BAP 19,8 ± 2,7
3 NAA + kinetin 24,8 ± 2,5
4 NAA + BAP 21,2 ± 1,8

p
3-1
<0,05 p
3-2
<0,05 p
3-4
<0,05
Ở cặp phối hợp giữa NAA (1,0 mg/l) và kinetin (0,1 mg/l) cho tốc độ
phát triển của tế bào cao hơn so với 3 cặp còn lại (p<0,05).
* Ảnh hưởng của nồng độ NAA
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus(n=50)
STT Nồng độ NAA (mg/l) Khối lượng callus (mg)
1 0,5 23,6 ± 2,1
2 1,0 24,1 ± 2.3
3 1,5 25,0 ± 1,8
4 2,0 26,8 ± 1,9
5 2,5 25,6 ± 1,7

p
4-1
< 0,05; P
4-2
< 0,05 p
4-3

< 0,05; p
4-5
> 0,05
Khi tăng nồng độ kinetin sử dụng thì khối lượng tế bào càng tăng và đạt
cao nhất ở nồng độ NAA là 2,0 mg/l (p<0,05). Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng
nồng độ kinetin sử dụng thì khối lượng tế bào lại giảm.
* Ảnh hưởng của nồng độ kinetin
(ngày)


6


Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus(n=50)
STT
Nồng độ kinetin
(mg/l)
Khối lượng callus (mg)
1 0,1 24,5 ± 1,8
2 0,2 27,9 ± 2,3
3 0,3 26,1 ± 1,9
4 0,4 25,9 ± 2,4
5 0,5 26,2 ± 2,2
p p
1-2
<0,05; p
2-3
>0,05 ; p
2-4
>0,05; p

2-5
>0,05
Nồng độ kinetin là 0,2 mg/l phù hợp nhất cho nuôi cấy tạo callus thông
đỏ. Khi tăng nồng độ kinetin lớn hơn 0,2 mg/l thì khối lượng callus giảm.
3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch
3.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường và số lần cấy chuyển
Kết quả khảo sát duy trì nuôi cấy trên 2 môi SH và B5 cho thấy: ở môi
trường B5 callus phát triển chậm, và bị biệt hóa nhiều thành mầm và chồi.
Trong khi, ở môi trường SH callus thông đỏ phát triển nhanh hơn. Vì vậy
l
ựa chọn môi trường SH để nghiên cứu duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ.
Bảng 3.9 : Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH
Lần cấy
chuyển
Hình thái tế bào Khả năng biệt hóa
Tỷ lệ tăng
trưởng
(lần)
Lần 1
Tế bào cứng Biệt hóa thành mầm 1,87
Lần 2
Tế bào cứng, có một số
đã mềm mại
Biệt hóa thành các
mô sẹo
2,25
Lần 3
Tế bào mềm mại Không còn biệt hóa 2,78
Lần 4
Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,51

Lần 5
Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,72
Sau 5 lần cấy chuyển trên môi trường thạch SH, tốc độ phát triển ổn
định (đạt 3,72 lần) và không bị biệt hoá thành các mô, cơ quan.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển
của callus thong đỏ được thể hiện ở bảng 3.10.


7


Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus(n=10)
STT
Nồng độ saccharose
(g/l)
Khối lượng (g)

Tỷ lệ tăng trưởng
(lần)
1 10 1,16 ± 0,15 2,48
2 15 1,25 ± 0,13 2,65
3 20 1,75 ± 0,16 3,72
4 25 1,54 ± 0,13 3,29
5 30 1,26 ± 0,11 2,68
5 35 1,22 ± 0,14 2,60
7 40 1,12 ± 0,13 2,38
Ở nồng độ saccharose 20 g/l, tốc độ phát triển của callus tốt nhất
(p<0,05), tốc độ tăng trưởng đạt 3,72 lần.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển
của callus thông đỏ cho thấy: ở nhiệt độ từ 22-24
0
C khối lượng callus thông
đỏ đạt cao hơn các nhóm khác (p<0,05), tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,72 lần.
3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy tới tốc độ phát
triển của callus thông đỏ cho thấy: ở môi trường có pH 5,6 tế bào phát triển
tốt nhất (p < 0,05), tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần.
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng
3.1.3.1.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Thigiannuôicy(ng à y)
Khố i lượng tế bào tươi (g)
KL khô

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy
Tế bào thông đỏ phát triển tăng dần theo thời gian và đạt cao nhất ở
ngày thứ 14. Các ngày tiếp theo, khối lượng tế bào giảm dần.

8


3.1.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy tới tốc độ phát triển của tế bào

STT
Tỷ lệ mẫu
(%)
Khối lượng
tế bào (g) (n=10)
Tỷ lệ sinh trưởng
(lần)
1 10 17, 25 ± 0,57 1,73 ± 0,06
2 15 24,59 ± 0,89 2,48 ± 0,08
3 20 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,07
4 25 28,78 ± 2,81 2,89 ± 0,09
5 30 25,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11

p
3-1, 3-2, 3-5
< 0,05, p
3-4
>0,05
Sử dụng tỷ lệ mẫu cấy 20% là thích hợp nhất cho nuôi cấy tế bào thông đỏ.
Khi tỷ lệ mẫu 25% thì tỷ lệ tăng trưởng tế bào thay đổi không đáng kể (p
3-
4
>0,05) gây lẵng phí mẫu.
3.1.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy cho thấy: ở
pH=5,6 tế bào phát triển tốt nhất, tỷ lệ sinh trưởng đạt 2,83 lần (p< 0,05).
3.1.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển
của tế bào cho thấy : ở nhiệt độ 24
0
C tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ
tốt nhất, tỷ lệ tăng trưởng đạt 2,83 lần (p<0,05).
3.1.3.5. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng
* Ảnh hưởng của nồng độ BAP
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế
bào(n=10)

STT
Nồng độ BAP
(mg/l)
Khối lượng tế bào
(g)
Tỷ lệ sinh trưở
ng
(lần)
1 0,5 20,62 ± 1,41 2,06 ± 0,07
2 1,0 28,29 ± 1,36 2,82 ± 0,11
3 1,5 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,10
4 2,0 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06
5 2,5 32,98 ± 1,33 3,28 ± 0,08
6 3,0 33,24 ± 1,63 3,30 ± 0,09
7 3,5 33,61 ± 1,27 3,34 ± 0,08

p

4-1
,
4-2
,
4-3
< 0,05, p
4-5
,
4-6
,
4-7
> 0,05


9


Ở nồng độ BAP 2,0 mg/l tỷ lệ tăng trưởng của tế bào đạt 3,27 lần (p<
0,05). Nếu tăng nồng độ BAP > 2,0 mg/l thì tỷ lệ phát tế bào ít thay đổi.
* Ảnh hưởng của nồng độ NAA
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào

STT
Nồng độ NAA
(mg/l)
Khối lượng
tế bào (g) (n=10)
Tỷ lệ sinh trưởng
(lần)
1 1,0 25,35 ± 1,51 2,53 ± 0,07

2 2,0 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06
3
3,0 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10
4 4,0 40,68 ± 1,46 4,05 ± 0,08
5 5,0 40,90 ± 1,79 4,07 ± 0,06
6 6,0 41,11 ± 1,71 4,09 ± 0,09

p
3-1
< 0,05 p
3-2
< 0,05 p
3-4
> 0,05 p
3-5
> 0,05 p
3-6
> 0,05
Sử dụng NAA 3,0 mg/l là phù hợp nhất cho nuôi cấy tế bào thông đỏ
(tỷ lệ sinh trưởng đạt 4,01 lần). Nếu tăng nồng độ lên > 3 mg/l tỷ lệ phát tế
bào ít thay đổi.
3.1.3.6. Ảnh hưởng của nồng độ đường.
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào

STT
Nồng độ
saccharose (g/l)
Khối lượng
tế bào (g) (n=10)
Tỷ l

ệ sinh trưởng
(lần)
1 15 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,08
2 20 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10
3 25 44,33 ± 2,22 4,41 ± 0,11
4 30 51,61 ± 2,16 5,14 ± 0,09
5 35 46,75 ± 1,29 4,65 ± 0,12

p
4-1
< 0,05 p
4-2
< 0,05 p
4-3
< 0,05 p
4-5
>0,05
Sử dụng saccharose ở nồng độ 30 g/l, tốc độ phát triển tế bào cao nhất,
khối lượng tế bào đạt 51,61 g/l và tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,14 lần (p<0,05).
3.1.3.7. Khảo sát lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất
a. Lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)
Bổ sung các elicitor gồm MJ, JA, acid caffeic, acid ferulic nồng độ 150
µM và dịch chiết nấm men nồng độ 100 µg/g vào ngày thứ 12 của chu kỳ
nuôi c
ấy. Sau 3 ngày nuôi cấy kết quả thể hiện trong bảng 3.21



10

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel trong tế bào (n=10)
STT Loại elicitor KL tế bào khô (g) Paclitaxel (mg/l)
1 Mẫu chứng 52,41±2,43 6,48±0,17
p
3-1
< 0,05
2 JA 36,83±2,10 8,84±0,21
p
3-2
< 0,05
3 MJ 38,98±1,98 9,39±0,20
*
4 Acid ferulic 45,22±2,21 7,53±0,14
p
3-4
< 0,05
5 Acid caffeic 46,39±1,86 7,64±0,18
p
3-5
< 0,05
6 Elicitor nấm 43,83±2,27 7,34±0,16
p
3-6
< 0,05
7 Acid salicylic 44,78±1,53 7,62±0,17
p
3-7
< 0,05

Trong số các elicitor, sử dụng methyl jasmonat (MJ) có hiệu quả nhất,
lúc đó hàm lượng paclitaxel đạt 9,39 mg/l. Tuy nhiên, việc sử dụng elicitor
dẫn đến làm giảm sự phát triển của tế bào so với nhóm không dùng.
* Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ methyl jasmonat
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển cũng
như hàm lượng paclitaxel trong tế bào thông đỏ cho thấy: sử dụng MJ
ở
nồng độ 100 µM, hàm lượng paclitaxel trong SKTB đạt cao nhất là 10,39
mg/l (p<0,05) và khối lượng tế bào giảm ít nhất (41,45 g).
b. Khảo sát điều kiện sử dụng elicitor
* Khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào(n=10)

STT
Thời gian tiếp xúc
với elicitor (ngày)
Khối lượng tế
bào khô (g)
Paclitaxel (mg/l)
1 mẫu chứng 48,31±2,34 6,49±0,31
p
6-1
< 0,05
2 1 44,37±2,12 7,21±0,26
p
6-2
< 0,05
3 2 44,23±1,97 8,75±0,21
p

6-3
< 0,05
4 3 41,45±2,04 10,39±0,37
p
6-4
< 0,05
5 4 42,98±2,02 11,06±0,28
p
6-5
< 0,05
6
5 42,37±2,17 12,32±0,12 *
7 6 39,65±1,98 9,93±0,27
p
6-7
< 0,05
Sau thời gian tiếp xúc 5 ngày giữa MJ và tế bào thì hàm lượng
paclitaxel tăng cao nhất đạt 12,32 mg/l (với p<0,05).


11


* Khảo sát lựa chọn thời điểm tiếp xúc của elicitor
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào (n=10)

STT
Thời điểm tiếp
xúc (ngày thứ)

Khối lượng tế
bào khô (g)
Paclitaxel (mg/l)
1 4 17,43±2,21 4,72±0,09
P
5-1
< 0,05
2 6 17,42±1,38 5,61±0,11
P
5-2
< 0,05
3 8 24,84±2,05 6,06±0,17
P
5-3
< 0,05
4 10 32,55±1,29 9,83±0,22
P
5-4
< 0,05
5
12 42,28±1,57 12,45±0,19 *
6 14 42,83±1,43 10,52±0,24
P
5-6
< 0,05
7 16 46,35±2,37 9,92±0,15
P
5-7
< 0,05
Khi cho MJ tiếp xúc với tế bào ở ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy, hàm

lượng paclitaxel cao nhất đạt 12,45 mg/l, khối lượng tế bào đạt 42,28 g.
3.1.3.8. Khảo sát phối hợp giữa sử dụng elicitor và bổ sung saccharose
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose(n=10)

STT
Thời điểm bổ
sung saccharose
(ngày thứ)
Khối lượng tế
bào khô (g)
Paclitaxel
(mg/l)
1 Mẫu chứng 48,23±2,11 6,51±0,09
p
5-1
<0,05
2 Không bổ sung 42,28±1,57 12,45±0,19
p
5-2
<0,05
3 2 38,25±2,09 9,72±0,29
p
5-3
<0,05
4 6 42,41±1,89 11,26±0,36
p
5-4
<0,05
5
10 42,57±1,54 15,10±0,42 *

6 14 44,06±2,08 12,47±0,33
p
5-6
<0,05
Khi bổ sung saccharose vào môi trường nuôi cấy vào ngày thứ 10, hàm
lượng paclitaxel cao nhất đạt 15,1 mg/l (với p<0,05).
3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít
Khi chuyển sang nuôi cấy trong hệ thống bioreactor 5 lít ở các điều kiện
như đã khảo sát được gồm: môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l),
BAP (2,0 mg/l), saccharose (30g/l), pH = 5,6; điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ
24
0
C, đến ngày thứ 10 thêm saccharose (20g/l), ngày thứ 12 bổ sung
methyl jasmonat (100 µM), tiếp tục nuôi đến ngày thứ 17 ngày. Kết quả


12


cho thy: tc phỏt trin t bo t 3,60 ln, hm lng paclitaxel trong t
bo t 12,92 mg/l. Lng paclitaxel ly gii ra mụi trng l 1,23 mg/l.
3.1.5. Kt qu nghiờn cu thu hoch SKTB thụng

Callus
SKTB/MT lỏng
- Môi trờng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/), saccharose (20g/l),
pH=5,6.
- Nuôi trong điều kiện: t
0
= 22-24
0
C; thời 35 ngày; không có ánh
sáng. Cấy chuyển 4 lần
Duy trì nuôi cấy trong

môi trờng thạch
Thôn
g
đỏ tự nhiên
- Tiệt khuẩn mẫu cây bằng HgCl + Tween 80
- Cấy vào MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l), saccharose
(20g/l), pH=5,6.
- Điều kiện nuôi cấy: 35 ngày, nhiệt độ24
0
C, không có ánh sáng
Tạo callus
Nuôi cấy trên môi
trờng lỏng
- Môi trờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose
(30g/l).
-
K nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t
0
=24
0
C; pH=5,6; tốc độ
cánh khuấy 130 v/phút, thời gian:14 ngày
Callus/MT thạch
Sinh khối/ Bioreactor
- Lọc lấy tế bào
- Rửa 3 lần với nớc cất
- Sấy khô 40 -60
0
C/10giờ
Thu sinh khố

i

SKTB khô
- Môi trờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose
(30g/l+20g/l ở ngày thứ 10), thêm MJ (100àM) ngày thứ 12
- K nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t
0
=24
0
C; pH=5,6; tốc độ
cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời
gian:17 ngày
Nuôi cấy trong hệ
thống bioreactor 5 lít
KNSP
Hỡnh 3.9. Quy trỡnh sinh khi t bo thụng


13


Kết quả xây dựng quy trình thu hoạch SKTB thông đỏ như sau:
Rút hỗn dịch SKTB thông đỏ ra khỏi bình nuôi cấy và để lắng tự nhiên
1 giờ. Sau đó, lọc bằng máy hút chân không thu lấy khối tế bào. Rửa 3 lần
bằng nước cất ( với tỷ lệ 5 phần nước: 1 phần SKTB). Lọc lấy phần bột
SKTB. Sấy trong tủ sấy có quạt gió ở nhiệt độ 60
0
C cho tới khối lượng
không đổi. Đóng túi PE 02 lần, bảo quản nơi khô mát.
Kết quả phân tích hàm lượng paclitaxel trong SKTB thông đỏ khô là

0,0361%. Tồn dư các chất kích thích sinh trưởng NAA và BAP lần lượt là
1,73 và 0,61 ppm. Kết quả xây dựng quy trình tạo SKTB thông đỏ được
trình bày trong hình 3.9.

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT
XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH
KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối t
ế bào thông đỏ
3.2.1.1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất
trong SKTB thông đỏ bằng HPLC
Kết quả khảo sát xây dựng phương pháp định lượng paclitaxel và
baccatin III đã đưa ra được các điều kiện sắc ký sau: cột Luna L43 (250 ×
4,6 mm ; 5 µm), pha động: ACN-H
2
O chạy theo chương trình gradient với
hệ pha động III (bảng 3.30), bước sóng: 228 nm, tốc độ dòng: 1 ml/phút,
thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Phương pháp định lượng có độ đặc hiệu, độ tuyến
tính, độ đúng cao, độ ổn định.
Bảng 3.30. Chương trình chạy sắc ký
Thời gian (phút) ACN (%) H
2
O (%)
0 - 45 25 – 63 75 – 37
45 - 55 63 – 25 37 – 75
55 - 65 25 75

14


3.2.1.2. Xác định sơ bộ các nhóm hợp chất trong SKTB thông đỏ
Kết quả định tính các nhóm hoạt chất trong SKTB thông đỏ bằng các
phản hóa học đặc trung cho thấy: trong SKTB thông đỏ có chứa các nhóm
hợp chất alcaloid, tanin, anthranoid, sterol, acid hữu cơ.
3.2.1.4. Định lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ
Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối thông đỏ
bằng HPLC cho thấy hàm lượng paclitaxel và baccatin III lần lượt là
0,0360% và 0,0061%. So với cành và lá non thông đỏ tự nhiên thu hái
được, hàm lượng paclitaxel cao hơn khoảng 3,5 lần. Tuy nhiên, hàm lượng
baccatin III lại thấp hơn (p<0,05).
3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh
khối tế bào thông đỏ
Đã chiết xuất, phân lập được 9 chất trong SKTB thông đỏ gồm:
Taxuyunnanine C (1); 2α,5α,10β- triacetoxy - 14β - propionyloxy-
4(20),11-taxadiene (2); 2α,5α,10β-triacetoxy - 14β- (2-methyl) -
butyryloxy-4(20),11- taxadiene (3); 2α,5α,10β-triacetoxy-14β-(3-hydroxy-
2-methyl)-butyryloxy-4(20),11-taxadiene (4) và β-sitosterol (9) và 04 chất
từ phân đoạn ethyl acetat gồm 13-dehydroxy baccatin III (5), paclitaxel (6),
(+)-catechin (7) và (-)-epícatechin (8)


1 2 3
b
c


15

O
H
3
C
CH
3
OH
O
CH
3
HO
O
H
O
H
O
CH
3
O
19
20
18
17
16
15
14
13

12 11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
O
CH
3
O CH
3
3'
2'
1'
O
HO
NH
O

4 5 6
CH
3
HO
H
3

C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
4
5
10
6
7
8
9
11
12
13
14
17
16
15
18
19
20
21

22
23
24
28
25
26
27
29

7 8 9
Hình 3.16. Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9
3.2.3. Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ
3.2.3.1. Chiết xuất paclitaxel trong sinh khối thông đỏ
*Giai đoạn 1 ( chiết lỏng rắn):khảo sát lựa chọn dung môi chiết
Bảng 3.42. Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau
ST
T
Dung môi
chiết
Sản phẩm thô
(g)
Hàm lượng
paclitaxel (%)
Hiệu suất (%)
1 Metanol 23,34 ± 0,95 0,50 ± 0,02 97,30 ± 0,56
2 Aceton 26,41 ± 1,13 0,35 ± 0,01 74,71 ± 2,01
3 Cloroform 18,99 ± 1,25 0,34 ± 0,02 53,58 ± 2,52
4 Diethylether 20,92 ± 1,42 0,40 ± 0,02 67,28 ± 3,89
p p
1-2, 1-3, 1-4

<0,05
Sử dụng MeOH để chiết xuất paclitaxel từ SKTB thông đỏ hiệu suất cao
nhất đạt 97,30% và hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm đạt 0,5%
* Chiết xuất giai đoạn 2 (chiết lỏng – lỏng)
Sử dụng DCM để chiết palitaxel trong dịch chiết MeOH, hiệu suất chiết
của quá trình đạt 91,94%, đồng thời hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm
chiết đã tăng từ 0,5% lên 5,93%.



16


3.2.3.2. Tinh chế paclitaxel
* Kết quả loại tạp chất bằng than hoạt
Kết quả khảo sát sử dụng than hoạt để loại tạp chất trong SKTB thông
đỏ cho thấy: khi sử dụng than hoạt ở tỷ lệ 3:1 thì hàm lượng paclitaxel cao
nhất đạt 7,81% và hiệu suất đạt 88,68%.
* Kết quả tinh chế bằng thay đổi dung môi n-hexan
Bảng 3.45. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử d
ụng để tinh
chế paclitaxel(n=6)

STT
Tỷ lệ n-
hexan:
DCM
Khối
lượng sản
phẩm (g)

Hàm lượng
paclitaxel
(%)
KL
paclitaxel
(mg)
Hiệu suất
(%)
1 4 : 1 0,16 ± 0,02 27,10 ± 1,76 40,7±2,4 55,97 ± 4,19
2 6 : 1 0,19 ± 0,01 26,51 ± 0,93 49,9±3,8 63,89 ± 2,43
3 8 : 1 0,22 ± 0,02 25,88 ± 0,99 57,12±2,6 73,14± 1,66
4 10 : 1 0,25 ± 0,01 25,37 ± 1,12
64,37±3,2
82,43 ± 2,76
5 12 : 1 0,31 ± 0,02 20,53 ± 0,84 63,36±2,3 81,61 ± 1,02
p p
4-5
<0,05 p
4-1, 4-2, 4-3
<0,05
Với tỷ lệ n-hexan thêm vào dịch chiết DCM là 10:1 là tốt nhất cho tinh
chế paclitaxel, khi đó hàm lượng paclitaxel 25,37%, hiệu suất đạt 82,43%.
* Kết quả tinh chế paclitaxel bằng kết tinh phân đoạn sử dụng hỗn hợp
dung môi
Bảng 3.46. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng
và hiệu suất tinh chế paclitaxel(n=6)

STT
Tỷ lệ
H

2
O :
MeOH
Khối
lượng sản
phẩm
(mg)
Hàm lượng
paclitaxel
(%)
KL
paclitaxel
(mg)
Hiệu suất
(%)
1 2:8 89,4 ± 8,2 62,20 ±1,22 55,8±3,1 44,60 ±2,00
2 3:7 109,1 ± 6,9 60,03 ± 1,98 65,5±3,9 52,43 ±1,91
3 4:6 147,7 ± 9,4 60,46 ± 1,05 89,3±4,2 71,41 ± 1,45
4 5:5 179,2±10,7 50,78 ± 2,97 91,2±3,5 73,07± 1,25
5 6:4 231,7 ± 4,3 40,05 ± 2,05 92,8±2,9 74,22 ± 1,65
p p
3-4
<0,05 p
3-1, 3-2,3-4
<0,05


17

Ở tỷ lệ nước thêm vào dung dịch paclitaxel trong MeOH 4 : 6 thì hiệu
quả quá trình tinh chế tốt nhất, hiệu suất đạt 71,41%, hàm lượng paclitaxel
đạt 60,46%.
* Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột
Bảng 3.47. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột
Tinh chế lần 1 Tinh chế lần 2
Mẫu
Hàm lượng
Paclitaxel(%)
Hiệu suất
(%)
Hàm lượng
Paclitaxel(%)
Hiệu suất
(%)
1 92,39 89,59 98,39 90,74
2 91,24 90,78 99,04 95,98
3 94,82 95,23 96,82 94,12
4 95,65 94,24 98,65 93,93
5 92,75 88,19 97,71 87,47
6 91,81 92,76 97,81 94,18
TB 93,11 ± 1,74 91,97 ± 2,61 98,07 ± 0,79 92,74 ± 3,09
Sau 2 lần tinh chế bằng sắc ký cột hàm lượng paclitxel trong sản phẩm
thu được đã tăng từ 60,46% (sản phẩm trước tinh chế) lên 98,07%.
Tổng hợp cả qúa trình chiết xuất tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ:
Bảng 3.49. Hiệu suất, hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn chiết xuất,
tinh chế

Giai đoạn chiết xuất tinh chế
Hàm lượng

paclitaxel (%)
Hiệu suất từng giai
đoạn (%)
Chiết xuất MeOH 0,50 ± 0,02 97,30 ± 0,56
Chiết xuất DCM 5,93 ± 0,25 91.94 ± 1,45
Loại tạp bằng than hoạt 7,81 ± 0,18 88,68 ± 2,58
Kết tủa trong n-hexan 25,37 ± 1,12 82,43 ± 1,76
Kết tủa trong MeOH: H
2
O 60,46 ± 1,05 71,41 ± 1,45
Tinh chế bằng sắc ký cột lần 1 93,11 ± 1,74 91,97 ± 2,61
Tinh chế bằng sắc ký cột lần 2 98,07 ± 0,97 92,74 ± 3,09
Cả quá trình 98,07 39,83
Hiệu suất của cả quá trình chiết xuất và tinh chế paclitaxel từ SKTB
thông đỏ đạt 39,83%, hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm đạt 98,07%.


18


3.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu
SKTB thông đỏ và hoạt chất
3.2.4.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của nguyên liệu
TCCS SKTB thông đỏ gồm các chỉ tiêu sau
* Hình thức: Khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc.
* Độ ẩm: không quá 12 %.
* Tro toàn phần: không quá 8%.
* Tro không tan trong acid: không quá 2%.
* Định tính: Thể hiện phép thử định tính của paclitaxel và baccatin III.
* Định lượng:

+ Hàm lượng paclitaxel trong SKTB thông đỏ không ít hơn 0,03%.
+ Hàm lượng baccatin III trong SKTB thông
đỏ không ít hơn 0,005%.
Tiêu chuẩn cơ sở Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương thẩm định.
3.2.4.2. Kết quả kiểm nghiệm paclitaxel theo USP 30
Sản phẩm paclitaxel đã được kiểm nghiệm chỉ tiêu định lượng theo USP
30 tại Trung tâm kiểm nghiệm Dược Hà Nội. Kết quả hàm lượng paclitaxel
đạt 98,1% (Đạt yêu cầu của USP 30) với phiếu kiểm nghiệm số 1290/11
ngày 16/11/2011.
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG
ĐỎ
4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ
* Về lựa chọn môi trường tạo callus thông đỏ
Kết quả khảo sát cho thấy môi trường B5 cho tỷ lệ tạo callus cao nhất
73%. Tốc độ phát triển của tế bào trên môi trường B5 cũng cao hơn trên
các môi trường khác (p<0,05). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu
của E.R.M Wickremesinhe về tạo callus các loài thông đỏ khác .
* Về thời gian chu kỳ nuôi cấy callus thông đỏ
Kết quả nghiên cứ
u cho thấy: thời gian 1 chu kỳ nuôi cấy callus thông
đỏ là 35 ngày. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của R.M.


19


Enaksha và cs về thời điểm cấy chuyển callus của loài T.media và T.
baccata.
* Về ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng đến callus thông đỏ

Ở môi trường có sử dụng NAA (2mg/l) và kinetin (0,2mg/l), tốc độ phát
triển của callus thông đỏ tốt hơn so với các nồng độ khác (p < 0,05). Kết
quả này cũng phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác trong nuôi
cấy các loài thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia) củ
a R.M. Enaksha
4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch
Với môi trường SH có bổ sung NAA (2,0mg/l) và kinetin (0,2mg/l),
saccharose 20g/l, pH môi trường = 5,6, nuôi cấy ở nhiệt độ 24
0
C, sau 5 lần
cấy chuyển tế bào phát triển nhanh và mềm xốp và không còn khả năng biệt
hoá thành các mô cơ quan. Tốc độ phát triển của tế bào đạt 3,81 lần. Điều
này cho thấy các tế bào mới dần thích nghi với môi trường mới.
4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng
4.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Về ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy thông đỏ
trong môi trường lỏng
Thời gian thích hợp cho 1 chu kì nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi
trường lỏng là 14 ngày. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của H. K.
Choi về nuôi cấy loài T. chinensis.
* Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy trong môi trường
Khi sử dụng tỷ lệ mẫu cấy là 20% thì tốc độ phát triển tế bào đạt 2,83 lần
cao hơn so với nhóm sử dụng tỷ lệ mẫu cấy thấp. Nh
ư vậy với nuôi cấy tế
bào thông đỏ T.wallichiana sử dụng tỷ lệ mẫu cấy 20% là phù hợp. So với
các kết quả nghiên cứu khác thì tỷ lệ mẫu cấy sử dụng cao hơn. Tuy nhiên,
tốc độ phát triển tế bào nhanh hơn.
* Về ảnh hưởng của pH của môi trường và nhiệt độ nuôi cấy
Với loài thông đỏ T.wallichiana thì pH môi trường nuôi cấy 5,6, ở nhiệt
độ 24

0
C thì tốc độ phát triển tế bào tốt nhất, tỷ lệ tăng trưởng đạt khoảng
2,83 lần.


20


4.1.3.2. Về ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
* Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA cho thấy: khi tăng nồng
độ BAP và NAA thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ lần lượt là 2,0
mg/l và 3,0mg/l. Khi đó tỷ lệ tăng trưởng 4,01 lần (p<0,05). So với các
nghiên cứu về nuôi cấy các loài thông đỏ khác trên thế giới thì nồng độ
BAP và NAA sử dụng với nuôi cấy tế
bào thông đỏ (T. wallichiana)
trong nghiên cứu này cao hơn. Điều này một phần là do tỷ lệ mẫu cấy
trong nuôi cấy tế bào cao hơn so với các loài thông đỏ khác.
* Ảnh hưởng của nồng độ đường tới tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ trong môi trường lỏng
Khi sử dụng đường ở nồng độ 30 g/l thì tốc độ phát triển tế bào thông đỏ
cao nhất (p<0,05) đạt 5,14 lần. Kết qu
ả này cũng phù hợp với nghiên cứu
của J. Luo, E.Moyano khi nuôi cấy tế bào T.chinensis và T . baccata.
4.1.3.3. Về sử dụng chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất trong sinh
khối tế bào thông đỏ
* Về sử dụng chất kích thích tổng hợp hoạt chất
Khi sử khi sử dụng các chất kích thích tổng hợp hoạt chất (elicitor) trong
nuôi cấy tế bào thông đỏ, hàm lượng paclitaxel đều tăng hơn so với nhóm
chứng. Trong đó methyl jasmonat (MJ) cho hiệu su

ất tốt nhất (đạt 9,39 mg/l)
so với các chất còn lại. Tuy nhiên, khi sử dụng các elicitor trong nuôi cấy tế
bào thì khối lượng tế bào thu được giảm so với nhóm không dùng (p<0,05).
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung MJ ở nồng độ 100 µM vào
ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy (bắt đầu pha ổn định), thời gian tiếp xúc
với tế bào 5 ngày thì hàm lượng paclitaxel đạt cao nhất 12,45 mg/l. Kết quả
này cũng phù hợp với nghiên cứu của D.W. Yan và cs khi thông đỏ
Châu Âu
(T.baccata) và thông đỏ Trung Quốc (T.chinensis) thường bổ sung khi bắt đầu
chuyển sang pha ổn định.


21


* Ảnh hưởng việc sử dụng kết hợp bổ sung saccharose và MJ
Khi thêm đường vào ngày thứ 10 (gần pha ổn định) của chu kỳ nuôi cấy
thì hàm lượng paclitaxxel tăng cao nhất đạt 15,1 mg/l (tăng khoảng 2,5 lần
so với nhóm chứng). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của H.Q.
Wang trong nuôi cấy tế bào T. chinensis, khi bổ sung đường vào ngày thứ 7
(gần pha ổn định) thì cả khối lượng tế bào và hàm lượng paclitaxel tăng.
4.1.4. V
ề nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít
Kết quả sau 8 mẻ nuôi cấy, tỷ lệ sinh trưởng của tế bào đạt 3,6 lần và
hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 12,92 mg/l, ngoài môi trường 1,23
mg/l. So với nghiên cứu khác về nuôi cấy các loài thông đỏ thì tốc độ phát
triển của tế bào thông đỏ trong nghiên cứu này cao hơn.
4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ
Kết quả xây dựng quy trình thu hoạch SKTB thông đỏ trên bioreactor cho
thấy sử dụng ph

ương pháp lọc thông thường để lấy tế bào, đồng thời rửa
bằng nước sạch 3-4 lần thì hàm lượng paclitaxel trong tế bào thu được không
thay đổi, trong khi đó dư lượng BAP và NAA đều giảm và nằm trong giới
hạn quy định tồn dư trong hoa quả của Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ.
4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN
LẬP, XÂY DỰNG TCCS CỦA NGUYÊN LIỆU SKTB THÔNG ĐỎ
4.2.1. Về nghiên cứu thành phầ
n hóa học
4.2.1.1. Về định tính, định lượng các thành phần hóa học
* Về định tính các nhóm hoạt chất trong sinh khối tế bào thông đỏ
Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong SKTB thông đỏ cho thấy:
trong SKTB có các nhóm hợp chất alcaloid, anthranoid, sterol, tanin và acid
hữu cơ. So với thông đỏ tự nhiên thì trong sinh khối hầu như chứa đầy đủ các
nhóm, tuy nhiên, không chứa nhóm flavonoid.
* Về định tính và định lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ
Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ cho
hàm l
ượng paclitaxel đạt 0,0360% ; baccatin III đạt 0,0061%. So với mẫu tự


22


nhiên thì hàm lượng paclitaxel trong sinh khối cao hơn khoảng 2,5 - 5,5 lần
tùy theo bộ phận thu hái. Trong khi đó hàm lượng baccatin III lại thấp hơn.
4.2.1.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh
khối tế bào thông thông đỏ
Từ SKTB thông đỏ, bằng phương pháp chiết phân đoạn với dung môi và
phương pháp sắc ký cột, đã phân lập được 09 chất. Trong 9 chất phân lập
này, các chất 7, 8 và 9 là những chất có phổ biến trong th

ực vật. 6 chất
thuộc dẫn chất taxan diterpenoid có bộ khung 6/8/6 trong đó các chất 1, 2, 3
và 4 thuộc nhóm có chứa nhóm thế exomethylen ở vị trí C4-C20, còn
paclitaxel (6) và 13-dehydroxy baccatin III (5) thuộc nhóm đóng vòng
epoxid ở C5-C20. Đây là những chất đặc trưng của chi Taxus.
4.2.2. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ
4.2.2.1. Về chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ
Kết quả nghiên cứu cho th
ấy khi sử dụng dung môi MeOH để chiết xuất
bằng phương pháp chiết siêu âm thì cho hiệu suất cao nhất đạt 97,30%
(p<0,05). Sản phẩm sau khi loại tạp bằng chiết lỏng lỏng với DCM hàm
lượng paclitaxel đạt 5,93%. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nghiên
cứu của S. H. Pyo, H. L. Da.
4.2.2.2. Về tinh chế paclitaxel
Khi loại tạp chất bằng phụ than hoạt, kết tủa do thay đổi dung môi và kết
tinh phân đoạn với h
ỗn hợp dung môi MeOH :H
2
O (6:4) thì sản phẩm thu
được có hàm lượng paclitaxel 60,46%. Sử dụng sắc ký cột pha đảo tinh chế
2 lần thì sản phẩm paclitaxel thu được có hàm lượng đạt 98,07%. Kết quả
này cũng phù hợp với công bố của S. H. Pyo. Sản phẩm tinh chế ra đạt tiêu
chuẩn USP 30 về chỉ tiêu định lượng.
4.2.3. Về kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở sinh khối tế bào thông đỏ
Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của SKTB thông đỏ
cho thấy sản
phẩm tạo ra đều đạt các các chỉ tiêu về hình thức cảm quan, độ ẩm, tạp chất
tro theo yêu cầu chung của DĐVN IV (áp dụng với dược liệu). Ngoài ra,

23


chỉ tiêu định tính và định lượng paclitaxel và baccatin III (những chất quan
trọng trong sinh khối) là chỉ tiêu quan trọng quyết định chất lượng của sinh
khối và hiệu quả của sản phẩm cũng được đưa vào TCCS. Đây là lần đầu
tiên tại Việt Nam công bố TCCS của nguyên liệu SKTB thông đỏ.
KẾT LUẬN
1. Xây dựng quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ quy mô phòng
thí nghiệm.
- Lựa chọn được môi trường B5 bổ
sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2
mg/l), saccharose (20g/l), thời gian 35 ngày cho nuôi cấy tạo callus, tỷ lệ tạo
callus đạt 73%.
- Xác định được môi trường thạch SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l),
kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20g/l), pH = 5,6, nhiệt độ 22-24
0
C, thời gian
35 ngày cho duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ. Sau 4 lần cấy chuyển, hình
thái tế bào mềm, xốp, khó biệt hóa. Tốc độ phát triển của tế bào ổn định với
tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần.
- Lựa chọn được môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0
mg/l), saccharose (30g/l), pH = 5,6; điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 24
0
C, tốc
độ máy lắc 130 vòng/phút, thời gian 14 ngày, không có ánh sáng cho nuôi
cấy tế bào thông đỏ trên môi trường lỏng. Khi đó, tỷ lệ tăng trưởng của tế
bào đạt 5,14 lần.
- Lựa chọn được methyl jasmonat (100 µM) sử dụng làm chất kích thích
tăng sinh hoạt chất, với các điều kiện sử dụng: bổ sung thêm saccharose (20

g/l) vào ngày thứ 10, bổ sung MJ vào ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy.
Tiếp tục duy trì nuôi cấy đến ngày thứ 15. Khi sử dụng MJ
ở điều kiện này
thì hàm lượng paclitaxel đạt 15,18 mg/l tăng 2,5 lần so với nhóm không sử
dụng.
- Nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít. Với các
điều kiện đã khảo sát, sau 17 ngày tế bào phát triển tốt, tỷ lệ tăng trưởng 3,6
lần, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 0,0361% (kl/kl).


24


- Xây dựng được qui trình thu hoạch khối tế bào thông đỏ, trong đó hàm
lượng tồn NAA, BAP tồn dư trong tế bào lần lượt là 1,73 ppm và 0,61 ppm,
nằm trong giới hạn cho phép của Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ.
2. Xác định thành phần hóa học, chiết xuất phân lập một số chất
chính, xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế paclitaxel trong SKTB,
xây dựng TCCS của nguyên liệu SKTB thông đỏ
- Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng
đồng thời
paclitaxel và baccatin III trong sinh khối dùng trong nghiên cứu.
- Xác định được thành phần hóa học của SKTB thông đỏ chứa các nhóm
chất: alcaloid, sterol, tannin, acid hữu cơ và anthranoid. Định tính và định
lượng được paclitaxel và baccatin III, trong đó hàm lượng paclitaxel và
baccatin III lần lượt đạt 0,0360% và 0,0061%.
- Phân lập, nhận dạng được 09 chất chính trong sinh khối, trong đó có 06
chất thuộc khung taxan vòng 6/8/6 điển hình của chi Taxus đại diện có
paclitaxel.
- Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh chế paclitaxel trong SKTB

thông đỏ, sản ph
ẩm paclitaxel thu được có hàm lượng đạt 98,07% đạt tiêu
chuẩn về chỉ tiêu định lượng theo USP 30.
- Xây dựng được TCCS của SKTB thông đỏ trên cơ sở USP 30 và DĐVN
IV bao gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ ẩm, tạp chất, định tính, định lượng.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để nâng quy mô nuôi cấy trên
các bioreactor lớn hơn, nhằm tạo ra khối lượng sản phẩm sinh khối nhiề
u hơn
- Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học để làm cơ sở cho việc chiết
xuất các dẫn chất taxan khác có thể sử dụng được như baccatin III, 10-
DAB. Nghiên cứu phương pháp chiết xuất, tinh chế paclitaxel và một số
hoạt chất khác trong sinh khối quy mô lớn nhằm mục định tạo được nguyên
liệu đủ tiêu chuẩn bào chế thuốc tiêm.