nghiên cứu quy trình tạo sinh khối chủng bacillus subtilis

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm tạ và biết ơn:
Thầy Nguyễn Văn Nguyện và Anh Giáp Văn Thắng đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành tốt luận
văn này.
Quý Thầy cô trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ đã giảng dạy và truyền đạt
những kiến thức cho tôi trong suốt khoảng thời gian học tại trường.
Quý Thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến
thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm trong cuộc sống sản xuất thực tế.
Các anh chị, cán bộ phòng thí nghiệm – cán bộ thư viện cùng tất cả các bạn sinh
viên trong và ngoài ngành Công nghệ Thực Phẩm đã trau dồi, giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu đề tài.
Một lần nữa xin chân thành cảm tạ và biết ơn.
TPHCM, ngày 22 tháng 9 năm
2008
Sinh viên
Huỳnh Thị Quỳnh Ngân
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong quá trình nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn thừa và chất thải hữu cơ thải ra môi
trường nuôi khá lớn. Các hợp chất hữu cơ này là nhân tố kích thích sự phát triển của VSV gây
ô nhiễm ao nuôi làm mất cân bằng hệ sinh thái ao. Mặt khác, trong quá trình phân hủy không
triệt để các hợp chất hữu cơ từ thức ăn thừa, chất thải và xác động vật nuôi sinh ra một số chất
độc. Một số hợp chất độc (NH
3
, H
2
S, CH
4

…) và sự phát triển quá mức của VSV không có lợi
trong môi trường nuôi làm giảm chất lượng nước dẫn đến tăng stress và tăng khả năng nhiễm
bệnh, tôm cá phát triển còi cọc và tỷ lệ chết tăng cao.
Trước đây, người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia
súc, gia cầm và tôm cá. Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu
quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường
ruột dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn là sự tồn dư kháng sinh trong thịt của các
động vật này dẫn đến việc hạ giá thành sản phẩm, gây cản trở cho việc xuất khẩu làm thiệt hại
rất lớn trong chăn nuôi. Do đó, để khắc phục được tình trạng này, biện pháp duy nhất giải
quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong nuôi trồng thủy sản là sử dụng các phương pháp bền
vững và thân thiện với môi trường. Trong đó, phương pháp sinh học là lựa chọn ưu tiên hàng
đầu hiện nay. Thông qua sử dụng các chế phẩm sinh học các chất ô nhiễm sẽ được giảm thiểu
tối đa và trả lại sự cân bằng sinh thái cho môi trường. Đặc biệt, phương pháp này sẽ không để
lại hậu quả hay tồn dư như khi sử dụng các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Với xu hướng
phát triển của khoa học kỹ thuật, trong tương lai gần các chế phẩm sinh học sẽ ngày càng
được áp dụng rộng rãi.
Phương pháp sinh học dựa vào quá trình hoạt động của các chủng vi sinh vật. Các chủng
này có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ đơn giản và phức hợp nhờ khả năng tổng hợp
enzyme phân hủy hữu cơ (protease, amylase, cellulose…), đồng thời tạo ra chất đối kháng ức
chế VSV gây bệnh. Một trong các loài vi sinh vật được chứng minh có nhiều khả năng trong
xử lý ô nhiễm ao nuôi hiệu quả là Bacillus. Trong đó, chủng Bacillus subtilis đã và đang được
sử dụng phổ biến trong thủy sản. Với nhiều hệ enzyme có tác dụng phân hủy các hợp chất hữu
cơ thải ra từ thức ăn thừa và phế thải làm giảm sự tích lũy bùn hữu cơ nên chủng Bacillus
subtilis được chúng tôi lựa chọn để thực hiện quy trình thu nhận sinh khối nhằm sản xuất ra
chế phẩm sinh học xử lý nước ao nuôi thủy sản.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Đề tài này nghiên cứu các điều kiện và nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và phát triển của chủng Bacillus subtilis nhằm rút ra các điều kiện tối ưu cho quá trình thu
nhận sinh khối. Nội dung của đề tài bao gồm:

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy tăng sinh cho chủng Bacillus subtilis.
- Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng
Bacillus subtilis như nhiệt độ, pH môi trường.
- Nghiên cứu các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ và muối khoáng.
- Nghiên cứu khả năng tạo bào tử Bacillus subtilis.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến tốc độ sinh trưởng cho chủng Bacillus
subtilis.
- Xây dựng quy trình thu nhận sinh khối Bacillus subtilis.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 3
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghề nuôi thủy sản ở khu vực ĐBSCL
Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đã đạt được những thành
tựu to lớn, đóng góp đáng kể cho sự phát triển
ngành thuỷ sản nói riêng và cho nền kinh tế quốc
dân nói chung. Trong các hoạt động hỗ trợ cho sự
phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản, chế biến
thức ăn, sản xuất giống thuỷ sản, thú y và đặc biệt
là công tác phát triển hệ thống thuỷ lợi là không thể
không nhắc đến.
Như chúng ta đã biết, hoạt động NTTS của Việt
Nam chủ yếu được tiến hành ở vùng ĐBSCL - là
vùng chiếm phần lớn cả về sản lượng và diện tích NTTS của cả nước với tổng diện tích có
khả năng phát triển NTTS toàn vùng khoảng 1.377.800 ha và diện tích hiện đã đưa vào phát
triển NTTS (2005) là 709.980 ha, tổng sản lượng NTTS (2005) đạt 1.014.590 tấn chiếm tới
72% tổng sản lượng NTTS toàn quốc. Dự tính đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi
thủy sản nước mặn-lợ là 649.430 ha, nuôi trồng thủy sản nước ngọt là 366.590 ha [13]. Với
hiện trạng phát triển như vậy hoạt động NTTS vùng ĐBSCL cũng cần có các đầu vào tương
ứng bao gồm cả con giống, thức ăn và đặc biệt là nguồn cấp và thoát nước thích hợp. Điều
này cho thấy nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế -

xã hội khu vực ĐBSCL.
1.2. Ô nhiễm môi trường và giải pháp xử lý trong ao nuôi thủy sản
1.2.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường
Vấn đề nóng bỏng hiện nay ở khu vực ĐBSCL là sự ô nhiễm môi trường nước ở các ao
nuôi thủy sản. Theo đánh giá của các nhà khoa học, hằng năm các nguồn chất thải do nuôi
trồng thủy sản ở khu vực ĐBSCL thải ra khoảng gần 500 triệu m
3
bùn và chất thải do nuôi
trồng thủy sản. Riêng chất thải nuôi cá tra, cá ba sa đã trên 2 triệu tấn/năm [7]. Nguồn chất
thải độc hại này hiện nay vẫn chưa được xử lý triệt để và được thải vào sông rạch trong khu
vực làm ảnh huởng đến sinh hoạt của người dân. Ở nhiều địa phương, người dân phải đang
đối mặt với các bệnh đường tiêu hóa, bệnh sốt xuất huyết, bệnh suy dinh dưỡng trẻ em và cả
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 4
Hình 1.1 Nuôi trồng thủy sản ở
ĐBSCL [18]
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
ngộ độc thực phẩm hay hóa chất trong quá trình sản
xuất canh tác ở các vùng đất ngập nước nuôi trồng
thủy sản. Do đó, tìm hiểu nguyên nhân dẫn đến ô
nhiễm môi trường nước từ các ao nuôi cá tra ở
ĐBSCL là cần thiết.
1.2.2. Nguyên nhân gây ô nhiễm
Tuy có rất nhiều nguyên nhân làm cho môi
trường nước ở các sông và kênh rạch bị ô nhiễm như: các chất thải từ các khu công nghiệp, từ
sản xuất lúa, từ nuôi thủy sản, các chất thải từ sinh hoạt của người dân. Trong đó, tình trạng ô
nhiễm môi trường nước tại các khu vực nuôi thủy sản đang là vấn đề bức xúc. Nguyên nhân
chủ yếu của tình trạng này là do lượng thức ăn thừa tích tụ trong ao và sự gia tăng về diện tích
ao nuôi.
Theo một số nghiên cứu cho thấy ô nhiễm tập trung chủ yếu vào dư lượng thức ăn thừa
thãi của cá, tôm thối rữa bị phân hủy trong ao nuôi. Những chất thải trong ao nuôi được thải

ra ngoài không chỉ gây dịch bệnh cho vật nuôi mà còn tác động tới sức khỏe của con người
qua nguồn nước sinh hoạt. Bên cạnh đó hệ thống thủy lợi phục vụ nuôi thủy sản chưa bảo
đảm không tuân thủ các qui định về bảo vệ môi trường như xây dựng hệ thống xử lý nước
cấp, nước thải, chất thải từ ao nuôi, không đảm bảo điều kiện vệ sinh thú y trong nuôi trồng
thủy sản, không xây dựng hệ thống ao lắng để xử lý nước trước khi cho vào ao nuôi và xử lý
nước thải trước khi xả ra sông rạch. Điển hình là ở những khu vực nuôi cá tra hầm nổi tiếng
dọc bờ sông Tiền, sông Hậu các chủ ao đầm xả nước thải ô nhiễm và bùn đáy ao ra sông rồi
lại bơm trực tiếp nguồn nước ô nhiễm đó vào lại ao nuôi cá [8].
Đứng trước những vấn đề ô nhiễm môi trường do nuôi trồng thủy sản gây ra như hiện nay,
cần phải có những biện pháp hữu hiệu để khắc phục nhằm đem lại nguồn nước sạch hơn cho
vật nuôi lẫn con người.
1.2.3. Giải pháp khắc phục
Ðể bảo đảm phát triển lợi thế ngành nuôi trồng thủy sản ở ÐBSCL nhằm đáp ứng yêu cầu
hội nhập quốc tế, cần phải thực hiện các biện pháp thích hợp để giải quyết những khó khăn về
ô nhiễm. Hiện nay, có một số biện pháp nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước nuôi thủy
sản đang được áp dụng như giải pháp về cơ học, hóa học và sinh học.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 5
Hình 1.2 Ô nhiễm môi trường ao
nuôi cá [16].
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
1.2.3.1. Giải pháp cơ học
Giải pháp thường dùng hiện nay là dùng bơm để hút hết nước trong ao hoặc rải vôi trên
khắp mặt ao hoặc dùng các hệ thống tái tuần hoàn nước. Hệ thống này được phát triển ở nhiều
nơi chủ yếu để loại bỏ các tác nhân gây bệnh do virút trong các hệ thống nuôi. Chúng mang
lại một số hiệu quả nhất định trong việc giảm lượng nước thải ra môi trường do lượng nước
thải vào các thuỷ vực lân cận giảm đi đáng kể [7]. Ngoài ra, các hệ thống khép kín này giúp
người NTTS ngăn ngừa các chất độc hại do các tác nhân gây bệnh, thuốc trừ sâu và thuốc diệt
cỏ. Hệ thống tái tuần hoàn có thể được dùng để tăng cường việc diệt vi khuẩn, giúp loại bỏ
các chất hữu cơ lơ lửng là những chất có thể chứa các tác nhân gây bệnh hay dư lượng hoá
chất. Tuy nhiên giải pháp cơ học để hút chất thải ra ngoài đòi hỏi đầu tư rất lớn về chi phí vận

hành máy móc và tốn kém trong việc xử lý chất thải. Nếu chất thải không được xử lý triệt để
sẽ dẫn tới nguy cơ phát tán nguồn ô nhiễm ra kênh, rạch. Do đó, biện pháp cơ học không phải
là giải pháp toàn diện cho vấn đề xử lý ô nhiễm môi trường nước thủy sản.
1.2.3.2. Giải pháp hóa học
Các hoá chất dùng trong nuôi trồng thuỷ sản bao gồm các chất khử trùng, các tác nhân
kháng khuẩn, các thuốc trị bệnh khác. Các loại vật tư kiến trúc công trình như chất dẻo, các
phụ gia, chất màu, chất chống ôxy hoá, chất chống cháy, diệt nấm, tẩy trùng v.v nhằm kháng
cự lại các vi khuẩn tồn tại sẵn có trong ao. Các chất xử lý đất và nước như phèn (sunfat nhôm-
kali), thạch cao, vôi, EDTA (Axit dinatri ethylendiamintetraacetic), zeolit [7]. Khi được sử
dụng, ngoài những tác dụng mong muốn, đơn giản, rẻ tiền, các hoá chất còn gây ra nhiều tác
hại ảnh hưởng xấu đến môi trường và con người. Cụ thể là chúng bị tồn lưu trong môi trường
thuỷ sinh, sự tích tụ các dư lượng thuốc kháng khuẩn trong các chất lắng đọng có tiềm năng
ức chế hoạt tính của vi khuẩn và giảm mức độ phân rã của các chất hữu cơ. Các hoá chất có
thể gây độc và để lại dư lượng cả ở trong các sinh vật không phải là đối tượng nuôi. Do đó,
giải pháp này ít được sử dụng do mang lại nguy hiểm cho thủy sản cũng như người tiêu dùng
các sản phẩm liên quan.
1.2.3.3. Giải pháp sinh học
Dùng các chế phẩm sinh học trong xử lý nguồn nước ở ao nuôi cá là biện pháp sinh học
phổ biến nhất. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cần phải tăng cường sục khí để các VSV hữu
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
hiệu phát triển. Đồng thời, phải bổ sung thường xuyên các VSV hữu hiệu vào ao nuôi để đẩy
mạnh quá trình phân hủy, các VSV có tính đối kháng với VSV gây bệnh. Và bổ sung chế
phẩm vào thức ăn để tăng cường miễn dịch cho vật nuôi. Việc sử dụng chế phẩm sinh học để
giải quyết vấn đề nước ao nuôi cá có thuận lợi là khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng
đồng thời cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng. Dùng
các chế phẩm sinh học có thể xử lý triệt để các thành phần độc hại gây ô nhiễm có trong nước
thải, chất thải thành các chất an toàn sinh thái. Các chế phẩm sinh học này là các vi khuẩn
yếm khí, hiếu khí, các xạ khuẩn, nấm men để xử lý lượng thức ăn dư thừa, các chất thải
trong ao nuôi, các nguồn bùn cặn đáy ao nuôi v.v [7].

Như vậy, để khắc phục các vấn đề trong xử lý nước ao nuôi thủy sản mà không ảnh
hưởng xấu đến chất lượng giống cũng như các giai đoạn trong quá trình nuôi thì việc chọn
giải pháp để khắc phục là cần thiết. Trong các giải pháp đang được áp dụng hiện nay, phương
pháp sinh học được quan tâm nhiều nhất, cho hiệu quả xử lý ô nhiễm cao và thân thiện với
môi trường. Do phương pháp này chiếm vai trò quan trọng về qui mô cũng như giá thành đầu
tư, chi phí cho một đơn vị khối lượng chất khử là ít nhất. Đặc biệt xử lí nước thải bằng biện
pháp sinh học sẽ không gây ô nhiễm, tái ô nhiễm môi trường.
1.3. Một số nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV
1.3.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon của vi sinh vật
Nguồn cacbon có vai trò quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV. Chúng vừa
là nguồn năng lượng vừa là nguồn dinh dưỡng cho cơ thể. Mỗi loài VSV đều thích hợp với
các nguồn cacbon khác nhau. Do đó, căn cứ vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia
vi sinh vật thành các nhóm khác nhau (bảng 1.1).
Như vậy, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
,
NaHCO
3
, CaCO
3
) hoặc chất hữu cơ.
Trong tất cả các nguồn cacbon đơn giản và tổng hợp được dùng làm nguồn dinh dưỡng
cho VSV thì một số nguồn cacbon thay thế như rỉ đường, dịch kiềm sunfit, tinh bột và
cellulose, dầu thực vật…vv được sử dụng phổ biến trong công nghệ lên men.
Bảng 1.1 Thành phần nhóm vi sinh vật [5]
Nhóm sinh Tự dưỡng Dị dưỡng Hoại sinh Ký sinh
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
lý VSV
Tự dưỡng

quang năng
Tự dưỡng
hóa năng
Dị dưỡng
quang năng
Dị dưỡng
hóa năng
Nguồn C CO
2
CO
2
Chất hữu cơ
Chất hữu cơ
Chất hữu cơ Chất hữu cơ
Nguồn
năng lượng
Ánh sáng
Một số
hợp chất
vô cơ đơn
giản.
Ánh sáng
Sự trao đổi
chất của
chất nguyên
sinh của
một cơ thể
khác.
Sự trao đổi
chất của

chất nguyên
sinh các xác
hữu cơ.
Lấy từ các tổ
chức hoặc
dịch thể của
một cơ thể
sống.
Ví dụ về
VSV
Vi khuẩn có
sắc tố màu
đỏ
Vi khuẩn
nitrate, lưu
huỳnh vô
màu, vi
khuẩn sắt.
Vi khuẩn
lưu huỳnh
màu tía.
Động vật
nguyên
sinh, nấm,
một số vi
khuẩn.
Nấm, vi
khuẩn gây
thối, lên
men.

VSV gây
bệnh cho
người, động
vật, thực vật,
virus.
1.3.1.1. Rỉ đường: gồm rỉ đường mía và rỉ đường củ cải.
Mật mía hoặc mật củ cải đường không kết tinh trong quá trình sản xuất đường thường gọi
là rỉ đường. Rỉ đường mía là phụ phẩm thu được của công nghiệp ép mía thành đường sau khi
thu được saccharose. Là một hỗn hợp khá phức tạp. Bên cạnh hàm lượng đường lên men được
khá cao, trong rỉ đường còn chứa một lượng đáng kể các hợp chất chứa nitrogen, các vitamin
và các hợp chất vô cơ. Ngoài ra còn chứa một số chất keo và vi sinh vật tạp nhiễm. Do đó
người ta thường xử lý rỉ đường trước khi dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Rỉ đường
củ cải là nước cốt sinh ra trong sản xuất đường từ củ cải đường. Dịch này được cô đặc có thể
dùng lâu dài. Trong rỉ đường ngoài thành phần kích thích sự sinh trưởng của VSV còn chứa
một số chất mà nếu dùng nó ở nồng độ cao sẽ kìm hãm sinh trưởng của vi sinh vật như SO
2
,
hydroxylmethylfurfurol…v.v.
Trong công nghiệp lên men người ta thường dùng cacbon là nguồn nguồn rỉ đường vì
chúng rẻ tiền và rất thích hợp sử dụng đối với nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Mặt khác,
trong rỉ đường có chứa hàm lượng đường cao, các chất kích thích sinh trưởng cho VSV.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Bảng 1.2. Thành phần hoá học của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải [5]
3.1.3.2 Tinh bột và cellulose
Tinh bột được sử dụng dưới dạng bột của khoai, sắn, lúa chủ yếu người ta hay dùng là
tinh bột khoai mì. Ngoài thành phần dinh dưỡng khá phù hợp cho quá trình lên men, tinh bột
khoai mì còn chứa rất nhiều chất khoáng như kali, natri, photpho, magie và sắt [3]. Mặt khác,
khoai mì dùng làm thực phẩm cho người thường là loại thiếu dinh dưỡng, do đó giá cả thường
rất rẻ và là loại dễ trồng nên tinh bột mì được sử dụng nhiều trong quá trình lên men. Dạng

nguyên liệu này trước khi sử dụng làm môi trường nuôi cấy phải qua khâu xử lý và đường
hóa. Tuy nhiên đối với các chủng vi sinh vật có hệ enzym amylase phát triển, người ta có thể
sử dụng trực tiếp tinh bột sống không qua khâu đường hóa để nuôi cấy vi sinh vật. Thành
phần của chúng được nêu ở bảng 1.3.
Đối với cellulose người ta thường sử dụng dưới dạng rơm, rạ, giấy…Cấu tạo và tính chất
của chúng rất đặc biệt và phức tạp nhằm tạo ra sự vững chắc cho cellulose. Do đó, việc phân
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 9
Thành phần Tỷ lệ
Rỉ đường củ cải
(saccharose)
Rỉ đường mía
(saccharose)
Đường tổng số % 48 - 52 48 - 56
Chất hữu cơ khác % 12 - 17 9 - 12
Protein (N x 6,25) % 6 - 10 2 - 4
Kali % 2,0 - 7,0 1,5 - 5,0
Canxi % 0,1 - 0,5 0,4 - 0,8
Magie % 0,09 0,06
Photpho % 0,02 - 0,07 0,6 - 2,0
Biotin mg/kg 0,02 - 0,15 1,0 - 3,0
Axit pantotenic mg/kg 50 - 110 15 -55
Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500 - 6000
Tiamin mg/kg 1,3 1,8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
hủy chúng trở nên rất khó khăn. Tuy vậy, cellulose cũng bị phân hủy bởi VSV trong những
điều kiện thích hợp và sự phân hủy này đòi hỏi cần có nhiều loại enzyme khác nhau.
1.3.1.3. Dịch kiềm sulfite
Là một loại phế phẩm của công nghiệp sản xuất cellulose. Chúng có đặc tính hấp thụ nhiều
oxy, cho nên khi nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so
với mức bình thường. Thành phần của chúng gồm 80% chất khô là đường hexose (glucose,

mannose, galactose), phần còn lại là đường pentose (cylose, arabinose). Ngoài ra trong dịch
kiềm sulfite có chứa acid ligninsulfuric. Acid này chưa được VSV sử dụng.
1.3.1.4. Dầu thực vật
Dầu thực vật bao gồm một số loại dầu như dầu đậu nành, dầu dừa, dầu đậu phộng, dầu hạt
bông, dầu hướng dương…v.v. Các loại dầu kể trên được dùng cho vào môi trường nuôi cấy vi
sinh vật với chức năng vừa là nguồn cacbon vừa là chất phá bọt. Nhưng các loại dầu có mặt
trong môi trường chỉ có vai trò là nguồn cacbon khi vi sinh vật được nuôi cấy sinh enzyme
lipase.
Đồng thời lượng chất béo cho vào môi trường nuôi cấy phải phù hợp với mức độ tạo bọt
của môi trường vì nếu bổ sung quá nhiều sẽ làm chậm quá trình đồng hóa nguồn cacbohydrate
của VSV do làm tăng độ nhớt của môi trường.
Bảng 1.3 Thành phần hóa học trung bình của khoai mì [3].

SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 10
STT Thành phần Đơn vị tính Số lượng
1 Protein % 1,1
2 Lipid % 0,2
3 Glucid tổng số % 36,4
4 Cellulose % 1,5
5 Tro % 0,8
6 Kali mg/100g 394
7 Canxi mg/100g 25,0
8 Photpho mg/100g 30,0
9 Sắt mg/100g 1,2
10 Vitamin B1 mg/100g 0,03
11 Vitamin B2 mg/100g 0,03
12 Vitamin PP mg/100g 0,6
13 Vitamin C mg/100g 34
14 Axit folic mg/100g 520
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện

1.3.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ của vi sinh vật
Nitơ tham gia vào thành phần của rất nhiều vật chất có trong tế bào như protein, enzyme,
axit nucleic. Đặc biệt chúng có nhiều trong protein. Chúng thường tồn tại ở dạng nitơ hữu cơ
và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ protein này thường có phân tử lượng lớn, rất khó xâm nhập vào
tế bào của VSV. Muốn sử dụng được nguồn nitơ này các VSV phải phân giải chúng thành
axitamin. Do đó, trong tế bào nitơ tham gia vào thành phần cấu trúc tạo nên tế bào của vi sinh
vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Một số nguồn nitơ hữu
cơ và vô cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy VSV được trình bày ở bảng 1.4.
Bảng 1.4 Một số nguồn nitơ trong nuôi cấy VSV [5]
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 12
Nguồn nitơ Đặc điểm
Urê Là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, bị
phân giải bởi enzim ureaza giải phóng NH
3
và CO
2
.
NH
2
- CO - NH
2
+ H
2
O → 2NH
3
+ CO
2
. Tan nhiều

trong nước, vừa là nguồn cung cấp nitơ vừa có tác
dụng điều chỉnh pH.
Pepton Là loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một
số loại protein.
Casein Là một phosphoprotein, trong thành phần của nó có
chứa gốc acid phosphoric.Trong dung dịch, casein
tạo thành các ion lưỡng tính. Trong sữa casein ở
dạng canxi caseinat và nó lại kết hợp với các
canxiphosphat tạo thành phức hợp canxi
phosphocaseinat (các mixen). Các casein liên kết với
nhau để tạo thành khi có mặt canxi và sẽ kết tủa
xuống nếu không có casein K.
Các muối
nitrate
Ví dụ như KNO
3
, NaNO
3
…Các muối này thích hợp
đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít
thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Ngoài ra, trong nuôi cấy VSV người ta còn sử dụng các nguồn phụ phẩm như bã đậu nành,
bã thải của công nghệ bia (dịch ngâm malt hoặc rễ mầm malt), bã thải rau quả…Đặc biệt,
trong lên men công nghiệp, người ta thường sử dụng nguồn nitơ dưới dạng sản phẩm thô như
dịch thủy phân nấm men, bã đậu nành, cao ngô, khô dầu đậu phộng.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 13
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
1.3.3. Nguồn muối khoáng của vi sinh vật
Muối khoáng chiếm khoảng 2 - 5% khối lượng khô của tế bào. Chúng thường tồn tại dưới

dạng các muối sunphat, photphat, cacbonat, clorua Trong tế bào chúng thường ở dạng các
ion. Dạng cation chẳng hạn như Mg
2+
, Ca
2+
, K
+
, Na
+
Dạng anion chẳng hạn như: HPO
4
2−
,
SO
4
2−
, HCO
3
−
, Cl
-

Hàm lượng các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất vi sinh vật thường thay đổi tùy
loài, tùy giai đoạn phát triển và tuỳ điều kiện nuôi cấy.
Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với tùy loài, tùy giai đoạn phát triển.
Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn
thường thay đổi trong các phạm vi được thể hiện ở bảng 1.6. Sự sinh trưởng và phát triển của
VSV sẽ không mạnh và nhanh nếu thiếu sự có mặt của một số nguồn khoáng như [3]:
phospho, canxi, kali, natri và clo. Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phospho
hơn bởi chúng không những có mặt trong nhiều thành phần quan trọng của tế bào mà phospho

còn có tác dụng tạo ra tính đệm cho môi trường.
Bên cạnh đó, các nguyên tố natri và clo cũng là nguyên tố mà nhiều VSV đòi hỏi với lượng
không nhỏ. Dựa vào đó có thể chia VSV thành 3 nhóm như sau :
+ Nhóm ưa mặn: thích hợp phát triển trên môi trường chứa 2 – 5% (khối lượng : thể
tích) NaCl.
+ Nhóm ưa mặn vừa: thích hợp phát triển trên môi trường chứa 5 - 20% NaCl.
+ Nhóm ưa mặn cao: thích hợp phát triển trên môi trường chứa đến 20 - 30% NaCl.
Bảng 1.5. Nồng độ cần thiết về muối khoáng của vi sinh vật [3].
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 14
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Khi sử dụng các môi trường thiên nhiên (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, peptone,
giá đậu ) để nuôi cấy vi sinh vật người ta thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố
khoáng vì thường có chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật. Ngược lại
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 15
Muối khoáng
Nồng độ cần thiết (g/l)
Đối với vi khuẩn Đối với nấm và xạ khuẩn
K
2
HPO
4
0,2 - 0,5 1 - 2
KH
2
PO
4
0,2 - 0,5 1 - 2
MgSO
4
. 7H

2
O 0,1 - 0,2 0,2 - 0,5
MnSO
4
. 4H
2
O 0,005 - 0,01 0,02 - 0,1
FeSO
4
. 7H
2
O 0,005 - 0,01 0,05 - 0,02
Na
2
MO
4
0,001 - 0,05 0,01 - 0,02
ZnSO
4
. 7H
2
O - 0,02 - 0,1
CoCl
2
≤ 0,03 ≤ 0,06
CaCl
2
0,01 - 0,03 0,02 - 0,1
CaSO
4

. 5H
2
O 0,001 - 0,005 0,01 - 0,05
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
khi làm các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các
nguyên tố khoáng cần thiết.
1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của VSV
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật chịu tác động của nhiều yếu tố bên
ngoài như : nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ oxy vv. Các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng
thuận lợi hay bất lợi lên vi sinh vật. Ảnh hưởng bất lợi sẽ dẫn đến tác dụng ức khuẩn hoặc diệt
khuẩn. Do tác dụng ức khuẩn của yếu tố môi trường làm tế bào ngừng phân chia, nếu loại bỏ
yếu tố này khỏi môi trường vi sinh vật lại tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến tốc độ phản ứng hoá sinh trong tế bào nên cũng ảnh hưởng
tới tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt
độ cao hơn 100
0
C. Tuỳ theo mức độ chịu nhiệt của chúng có thể phân loại VSV như ở bảng
1.7 [1].
Bảng 1.6. Phân loại vi sinh vật theo ảnh hưởng của nhiệt độ [1].
Và đôi khi nhiệt độ gây cho VSV những chiều hướng khác nhau như:
- Ở nhiệt độ cao: thường gây biến tính protit, làm hệ enzym lập tức không hoạt động được,
vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt. Sự chết của vi sinh vật ở nhiệt độ cao còn do acid nucleic bị
hoạt hóa. Nhiệt độ cao thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng. Đa số vi sinh vật bị
chết ở 60 - 80
0
C. Một số khác chết ở nhiệt độ cao hơn. Đặc biệt bào tử có khả năng tồn tại ở
nhiệt độ > 100
0
C.

SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 16
STT Nhóm vi sinh vật Nhiệt độ tối thiểu Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối đa
1 Ưa nóng 45
0
C - 40 55 - 75
0
C
60 - 70
0
C
2 Ưa ấm 15
0
C - 5
30 - 40
0
C 40 - 47
0
C
3 Ưa lạnh - - -
3.1 Ưa lạnh bắt buộc 5
0
C - (-5)
12 - 15
0
C 15 - 20
0
C
3.2 Ưa lạnh không bắt buộc 5
0
C - (-5)

25 - 30
0
C
30 - 35
0
C
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
- Ở nhiệt độ thấp: Ở nhiệt độ này có thể làm bất hoạt hóa quá trình vận chuyển chất hòa tan
qua màng tế bào do thay đổi cấu hình không gian của một số men chứa trong màng. Đa số vi
sinh vật có thể chịu được nhiệt độ dưới băng điểm (0
0
C) và có thể, sau khi được cấp đông,
chịu được nhiệt độ của không khí lỏng là -185
0
C. Thường không gây chết vi sinh vật ngay mà
nó tác động lên khả năng chuyển hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzym,
làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển
và sinh sản. Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết.
Phần lớn vi khuẩn gây bệnh phát triển tốt ở nhiệt độ 35 - 37
0
C. Một số nấm men và nấm
mốc nuôi cấy trong phòng thí nghiệm phát triển tốt ở 26 - 32
0
C.
1.4.2. Ảnh hưởng của pH
pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của mọi
loài VSV. pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật. Tùy theo nồng độ của chúng mà
làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với những ion nhất định. Mặt khác
chúng cũng tham gia vào việc ức chế các enzym có mặt trên thành tế bào. Ảnh hưởng của pH
môi trường lên hoạt động sống của VSV phần lớn là do tác động qua lại giữa ion H

+
và các
men chứa trong màng tế bào chất và tế bào.
Cũng giống như ở nhiệt độ, mỗi loài VSV cũng thích nghi với một loại pH môi trường
khác nhau (được thể hiện ở bảng 1.8). Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển
trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi
trường axit yếu. Nếu nồng độ hydro trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi
sinh vật nào đó thì sự sống bị ức chế. Thí dụ như trong quá trình làm dưa chua, độ axit dần
dần tăng lên làm tiêu diệt những vi khuẩn gây thối, sau đó là những vi khuẩn lactic. Sự thay
đổi pH môi trường có thể gây ra thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men. Trong điều kiện
phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường có pH đối với vi khuẩn 7,0 -
7,6; đối với nấm men và nấm mốc 3,0 - 6,0.
1.4.3. Ảnh hưởng của hoạt độ nước
Nước chiếm đến 70 - 90% khối luợng cơ thể sinh vật. Có vai trò khá quan trọng đối với sự
sinh trưởng và phát triển của VSV. Vì tất cả các phản ứng xảy ra và các hoạt động sống trong
tế bào vi sinh vật đều đòi hỏi có sự tồn tại của nước. Khi thiếu nước sẽ xảy ra hiện tượng loại
nước ra khỏi tế bào VSV, trao đổi chất bị giảm và tế bào chết. Đa số nước trong tế bào vi sinh
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
vật tồn tại ở dạng nước tự do, dễ hấp thụ. Ở vi khuẩn lượng nước chứa thường là 70 - 85%, ở
nấm sợi thường là 85 - 90%.
Yêu cầu của vi sinh vật đối với nước được biểu thị một cách định lượng bằng độ hoạt động
của nước (a
w
) trong môi trường. Độ hoạt động của nước còn được gọi là thế năng của nước
(p
w
):
Ở đây :
ρ là áp lực hơi của dung dịch

ρ
0
là áp lực hơi nước.
Nước nguyên chất có a
w
= 1, nước biển có a
w
= 0,980, máu người có a
w
= 0,995, cá muối
có a
w
= 0,750; kẹo, mứt có a
w
= 0,700 [4].
Mỗi sinh vật thường có một trị số a
w
tối thích và một trị số a
w
tối thiểu. Một số sinh vật có
thể phát triển được trong môi trường có trị số a
w
rất thấp, người ta gọi chúng là các vi sinh vật
chịu áp và được trình bày ở bảng 1.7. Tuy nhiên, cũng có một số VSV phát triển được trong
môi trường nước có hoạt tính càng cao – khi một tế bào được nhúng vào dung dịch có hoạt
tính nước thấp thì nước bị rút từ tế bào vào môi trường do hiện tượng thẩm thấu. Áp suất thẩm
thấu càng cao thì hoạt tính nước càng thấp và nước càng khó sử dụng đối với VSV.
Trong môi trường chứa nước có hoạt tính thấp đa số VSV không thể hút lấy nước từ môi
trường và sẽ chết hoặc chuyển sang trạng thái ngủ.
Bảng 1.7. Mức a

w
thấp nhất đối với một số vi sinh vật [3].
STT Nhóm vi sinh vật a
w
thấp nhất
1 Phần lớn vi khuẩn gram (-) 0,97
2 Phần lớn vi khuẩn gram (+) 0,90
3 Phần lớn nấm men 0,88
4 Phần lớn nấm sợi 0,80
5 Vi khuẩn ưa mặn 0,75
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 18
a
w
=ρ/ρ
0
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Bảng 1.8. Ảnh hưởng pH đối với một số vi sinh vật [3].
1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ oxy và nitơ
Nồng độ oxy và nitơ của môi trường có thể kích thích hay ức chế hoạt động sống của
VSV. Hầu hết các sinh vật hiếu khí bắt buộc phát triển ở thế oxy hóa - khử cao. Chúng có hệ
enzym hô hấp đầy đủ để tiến hành quá trình oxy hóa, dùng oxy làm chất nhận H
2
cuối cùng
được thể hiện rõ ở các phản ứng dưới đây:
O
2
+ e
-
→ O
2

-
⋅
O
2
-
⋅ + e
-
+ 2H
+
→ H
2
O
2
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 19
pH môi trường
Loài vi sinh vật Độ axit tối thiểu Tối ưu Kiềm tối thiểu
Saccharomyces cerevisiae 4 5,8 6,8
Streptococus lactic 4,0 - 5,1 - 7,9
Lactobacterinus casei 3,0 - 3,9 - 7,1
E. coli 4,4 6,5 - 7,8 7,8
Clostr.amylobacter 5,7 6,9 - 7,3
Vi khuẩn gây thối
Bac. Mesentericeus 5,8 6,8 8,5
Clostr. Putrificum 4,2 7,5 - 8,5 9,4
Vi khuẩn cố định đạm
Azotobacter chroccoccum 5,6 65 - 7,8 8,8 - 9,2
Vi khuẩn nitrat
Nitrosomonas 3,9 7,7 - 7,9 9,7
Nitrosobacter 3,9 6,8 - 7,3 13,0
Nấm mốc 1,2 1,7 - 7,7 9,2 - 11,1

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
H
2
O
2
+ e
-
+ H
+
→ H
2
O +OH ⋅
Vì vậy oxy trong môi trường làm cho hoạt động của chúng được tăng cường. Nồng độ oxy
quá cao sẽ bất lợi cho sự sinh sản của các VSV hiếu khí bắt buộc này. Còn đối với kỵ khí
không có hệ enzym hô hấp nên không sử dụng được oxy làm chất nhận H
2
. Kị khí bắt buộc
không sinh năng lượng trong suốt quá trình hô hấp và thường sử dụng quá trình lên men hoặc
hô hấp hiếu khí trong mục đích này. Do đó, nguồn oxy đôi khi quan trọng đối với chủng VSV
này nhưng không quan trọng đối với chủng VSV khác.
Những sản phẩm khử oxy là những độc tố lớn bởi vì những tác nhân oxy hóa mạnh và hủy
hoại một cách nhanh chóng những thành phần tế bào. Những thể thực bào lớn và trung tính
dùng sản phẩm khử oxy để lấn chiếm và hủy hoại mầm bệnh. Hiếu khí bắt buộc và kị khí
không bắt buộc thường chứa enzym SOD (superoxide dismutase) và enzym catalase, là
enzym phá hủy gốc superoxide và hydrogen peroxide. Peroxidase cũng có thể được dùng để
phá hủy hydrogen peroxide và các phản ứng sau chứng minh điều đó:
2O
2
-
⋅ + 2H

+
O
2
+ H
2
O
2
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
H
2
O
2
+ NADH + H
+
2H
2
O + NAD
+
1.5. Sơ lược và ứng dụng của chủng Bacillus subtilis trong nuôi trồng thủy sản
1.5.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử sống hiếu khí tùy tiện nhưng trong
điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên. Một số chủng
của loài này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật. Tất cả

các chủng Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ, như protein khá
mạnh nhờ sinh ra protein ngoại bào. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh ra amylase làm
loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan [6].
1.5.1.1 Đặc điểm hình thái
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 20
Superoxide disutase
catalase
Peroxide
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Bacillus Subtilis được tìm thấy vào năm 1835 bởi ông Christian Gottfried Ehrenberg và
được mô tả bởi con Vibrio subtilis [10].
. Bacillus subtilis phân bố khắp mọi nơi và được phân lập từ đất, cỏ khô, rơm khô, nước
và không khí. Chúng cư ngụ ở những vùng rễ và lớp bề mặt của nền đất [10].
Bacillus Subtilis là trực khuẩn Gram dương. Trực khuẩn ngắn, nhỏ kích thước thay đổi
trong khoảng chiều rộng 0,5-1,0µm và chiều dài 1,0-4,0µm [10], nhiều khi nối lại thành
sợi dài, ngắn khác nhau và có thể đứng riêng rẽ. Chúng có hình que thẳng hoặc gần thẳng,
có tiêu mao và có khả năng sinh bào tử [6]. Hình que của Bacillus subtilis có chiều dài
khoảng 2-3µm và chiều cao khoảng 0.6µm được thể hiện ở hình 1.2. Đặc trưng của họ
này là sự hình thành nội bào tử, chỉ có một bào tử trong một tế bào. Sự hình thành bào tử
không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí. Gram dương hoặc chỉ cho Gram dương ở
giai đoạn đầu phát triển.
2.
3.
4.
5.
Giống như các trực khuẩn của loài Bacillus, Bacillus subtilis phát triển ở điều kiện hiếu
khí và có khả năng hình thành nên sự dẻo chắc, bảo vệ nội bào tử [3]. Đồng thời, nhằm kháng
lại các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ và sự thiếu hụt chất dinh dưỡng [3]. Do chúng
hiếu khí nên tương đối dễ thích nghi với điều kiện nuôi cấy trong môi trường lỏng.
Chúng có khuẩn lạc khô, vô màu hay có xám nhạt, trắng, hơi nhăn, hay tạo ra lớp màng

mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường
thạch. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 – 50
0
C, tối đa là 60
0
C. Bào tử chịu được nhiệt
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 21
Hình 1.3 Hình dạng bào tử của Bacillus
subtilis [14].
Bảng 1.9: Phân loại khoa học [12]
Giới : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp : Bacilli
Bộ : Bacillales
Họ : Bacillaceae
Chi : Bacillus
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
khá cao, có hình bầu dục 0,9 – 0,6 µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào – lệch
tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (hình 1.3) [4].
1.5.1.2 Phân loại
Việc phân loại Bacillus ban đầu dựa trên hai đặc điểm là sự phát triển trong điều kiện
hiếu khí và sự hình thành nội bào tử, kết quả đã xếp nhiều vi khuẩn có những đặc điểm sinh
lý và đặc tính khác nhau. Do đó, tính không đồng nhất về sinh lý học, sinh thái học, di
truyền học làm cho việc phân loại Bacillus trở nên khó khăn.
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài ở điều kiện bất lợi,
nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn từ đất và không khí.
Một số loài tiêu biểu:
Bacillus cereus
Bacillus stearothemophilus
Bacillus subtilis

Bacillus pumilus
Bacillus megaterium
1.5.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng, có khả năng hô hấp trong khi sử dụng
nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ). Nên chúng thường làm thối
rữa hầu hết các cơ chất lấy được có nguồn gốc động vật và thực vật như cellulose, tinh bột,
pectin, agar, protein, hydrocacbon và các chất khác [3]. Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình,
khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25
0
C – 75
0
C, nhiệt độ tối ưu
là 30
0
C – 45
0
C, pH tối thiểu cho sự phát triển từ 7,5 – 8 [3]. Trong điều kiện môi trường nuôi
cấy đầy đủ chất dinh dưỡng và trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào vi sinh vật tăng
nhanh về kích thước đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
Các vi sinh vật sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn
sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi
cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc
nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào già chỉ được phát hiện trong trường hợp môi
trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật không có khả năng sinh sản nữa.
1.5.3. Cấu tạo của Bacillus
1.5.3.1. Màng S
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 22
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Màng ngoài protein hay tiểu phần glyprotein trong suốt gọi là lớp màng S, có ở các loài
Bacillus. Giống như các vi khuẩn khác chức năng của chúng vẫn chưa được biết.

1.5.3.2. Vỏ bao ngoài
Vỏ bao ngoài của nhiều loài Bacillus như B.subtilis, B.megaterium, B.anthracis và
B.licheniformis có poly-D- hay L- glutamic acid. Các loài khác như B.pumylus, B.mycoides
tạo ra các vỏ bao cacbon.
1.5.3.3. Vách tế bào
Cấu trúc vách tế bào của chủng Bacillus
không biến thiên như đa số các vi khuẩn
Gram dương khác. Vách tế bào sinh dưỡng
của đa số loài Bacillus cấu tạo từ
peptidoglycan có chứa acid
mesodiaminopimelic (DAP), ngoại trừ
B.sphaericus và các loài có quan hệ thì có
vách tế bào chứa glysine như B.pasteurii.
Ngoài peptidoglycan, tất cả các loài Bacillus
đều chứa một lượng lớn acid teichoic liên kết
với gốc muramic.
1.5.3.4. Tiêu mao
Phần lớn các loài Bacillus đều có thể chuyển động nhờ vào vành lông rung.
1.5.3.5. Nội bào tử
Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohn khi nghiên cứu về B.subtilis và sau đó là Koch
trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B.anthracis [8]. Bào tử được sinh ra bên
trong tế bào vào cuối thời kỳ sinh trưởng, phát triển, khi gặp điều kiện thức ăn hoặc có
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ sinh ra có một bào
tử nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sôi nảy nở như nấm.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 23
Hình 1.4: Cấu trúc bào tử Bacillus
subtilis [9].
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
• Cấu trúc của bào tử gồm
+ Áo bào tử

+ Vỏ bào tử
+ Lõi bào tử: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và nhân.
1.5.4. Một số ứng dụng của Bacillus subtilis trong xử lý ô nhiễm môi trường nuôi trồng
thủy sản
Trong thủy sản, Bacillus có tác dụng làm giảm hàm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay
nước và cải thiện môi trường ( tăng oxy hòa tan, giảm BOD, COD) do có chức năng phân hủy
hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và phế thải nhờ khả năng tổng hợp enzym phân hủy
hữu cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm
số lượng VSV gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio spp, Aeromonas spp…Ngoài ra, chúng
còn có tác dụng đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của ngư
trường như B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis [12].
1.6. Quy trình thu nhận sinh khối của vi khuẩn
Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn hầu như không khác nhau [hình vẽ 1.5].
Hiện nay, quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn trải qua các bước như sau:
- Về giống vi sinh vật: Sau khi được bảo quản trong tủ lạnh, chúng được hoạt hóa và cấy
chuyền qua môi trường thạch nghiêng nhằm giữ giống cho các thí nghiệm sau này.
- Cấy chuyền: Chuyển giống vào môi trường lỏng và nuôi chúng theo phương pháp nuôi
trên máy lắc (với tần số lắc là 100 – 200v/ph ở nhiệt độ 30
0
C ± 2, nuôi trong 18 – 20h) hoặc
nuôi trên môi trường rắn (môi trường sau khi trộn giống được trải ra khay với chiều dày môi
trường là 3 -5cm. Nuôi trong điều kiện vô trùng, ở nhiệt độ 28 – 32
0
C trong thời gian 24 –
36h). Môi trường lỏng nuôi cấy bao gồm nhiều môi trường. Điều chỉnh môi trường lỏng nằm
trong khoảng pH = 6.5 – 7.2. Môi trường phải được thanh trùng và làm nguội trước khi cấy
giống VSV vào.
- Lên men: Sau khi chuẩn bị giống và môi trường đầy đủ chuyển lên thiết bị lên men và
giống được nuôi trong các môi trường có thành phần dinh dưỡng tối ưu.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 24

Giống VSV
Cấy chuyền
Lên men
Một ống cho sản
xuất
Một ống dùng bảo
quản giống
Một ống để kiểm
tra
Tách sinh khối
Rửa sinh khối
Sấy sinh khối
Thành phẩm
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Hình vẽ 1.5 Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn [3]
- Tách sinh khối:
- Sấy sinh khối: Sau khi thu nhận sinh khối người ta tiến hành sấy sinh khối bằng cách
sấy chân không và thu được thành phẩm. Chất lượng sinh khối sau khi thu được phải đạt các
tiêu chí như sau:
- Kết thúc quá trình lên men phải đạt ≥10
9
(CFU/ml)
Tuy nhiên người ta thường sử dụng phương pháp nuôi trên máy lắc nhiều hơn bởi thời gian
nuôi ngắn hơn, không tốn diện tích để nuôi cấy như nuôi ở môi trường rắn.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 25