khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn sphingomonas paucimobilis bk16

KILOBOOKS.COM
1

LI M U


Sa l mt thc phm cú giỏ tr dinh dng cao, giỳp cho s hp th
phospho v canxi cao, cú tớnh khỏng th mnh, do vy rt tt cho tr em v
ngi gi. Lactoza l disccarit chim ch yu trong thnh phn sa. S cú mt
ca lactoza trong quỏ trỡnh ch bin thc phm ủụi khi khụng cú li, gõy sm
mu v to ra mựi khụng mong mun ủi vi sn phm khi gia nhit, lm nh
hng ti cht lng cm quan do s tỏi kt tinh ca chỳng. Sau khi dựng sa,
lactoza ủc enzym -galactosidaza trong rut non ca ngi phõn gii thnh
glucoza v galactoza. Tuy nhiờn nng lc tng hp enzym trờn ngi b mt
dn khi qua tui cai sa. Kt qu l ủi ủa s ngi trng thnh v ngi gi
trờn th gii ủu mc bnh thiu nng chuyn húa lactoza. Ngha l, nhng
ngi ny khi s dng nhiu sa s cú cỏc triu chng nh ủy hi, chng
bng, ủau bng, tiờu chy, bun nụn. Vỡ vy cỏc hng gii quyt ủc ủt
ủõy l:
Phỏt trin cỏc sn phm sa cú hm lng lactoza gim ủ nhng ngi
mc bnh thiu nng chuyn húa lactoza cú th s dng ủc.
Dựng trc tip cỏc ch phm enzym di dng thc phm nhm tng hot
ủ enzym -galactosidaza trong rut non.
thu phõn chuyn húa lactoza thnh glucoza v galactoza cú th dựng
axit hoc enzym -galactosidaza. Vic thu phõn bng axit dn ủn mt s bt
li nh hao mũn thit b, ụ nhim mụi trng, gõy khú khn cho vic ủm bo
an ton thc phm m phng phỏp enzym hon ton cú th khc phc ủc.
Ngoi ng dng trong cụng nghip thc phm, tim nng ng dng ca
enzym -galactosidaza trong cỏc lnh vc nghiờn cu c bn, trong sinh hc
phõn t v k ngh protein (lm cỏc gen thụng bỏo, ch th, cỏc phõn t cm
bin ), trong sn xut dc phm v trong y hc l rt ln.

Chớnh vỡ vy, vic nghiờn cu nhm sn xut ra cỏc ch phm enzym
-galactosidaza l ht sc cn thit, nht l trong cụng nghip ch bin sa.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
2

Đề tài “Khảo sát ñặc tính và khả năng thu nhận enzym
β
-galactosidaza từ vi
khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16” nhằm những mục ñích sau:
• Khảo sát ñặc tính sinh enzym của chủng S. paucimobilis BK16.
• Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzym β-galactosidaza chủng S. paucimobilis BK16.
• Xác ñịnh một số ñặc tính của enzym β-galactosidaza thu ñược từ chủng S.
paucimobilis BK16.
• Nghiên cứu khả năng thu enzym kỹ thuật.

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM
3

PHẦN I
TỔNG QUAN

I.1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYM β-GALACTOSIDAZA:
Enzym β-galactosidaza là enzym xúc tác cho q trình thuỷ phân và
chuyển hóa các gốc β-D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành
glucoza và galactoza [6].
Enym β-galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực
vật và động vật. Các enzym này đã được ứng dụng trong nhiều q trình cơng
nghệ sinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật được sử dụng để thủy phân
lactoza nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức
năng của các sản phẩm từ sữa. Phản ứng chuyển hố galactozyl cũng thường
được sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng
và cấu trúc của ngun liệu thực phẩm, dược phẩm và các hợp chất có hoạt tính
sinh học khác [6].
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về enzym β-
galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phương pháp
tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong
cơng nghiệp thực phẩm, trong y học và dược phẩm cũng như cả trong lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản. Mặc dù vậy, ở nước ta, việc nghiên cứu về enzym này mới
chỉ là bước đầu và ứng dụng của chúng rất ít được đề cập đến.
I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp β-galactosidaza :
Hiện nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được nhiều chủng loại vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza với hoạt lực cao. Enzym khi được
tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngồi mơi trường) hoặc nội bào (tích tụ
trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc

lyzosome của tế bào…) [6].

Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym β-galactosidaza:

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
4


NM
MEN
Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces
lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis
NM
MC
Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae,
Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum
canescens, Rhizopus acidus, R.niveus,
VI
KHUN
Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie,
A.formicans, Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae,
Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris,
Vi khuẩn gram d-ơng: Bacillus acidocaldarius, B.circulans,
B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum,
Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira,

I.2 c tớnh ca enzym -galactosidaza t vi sinh vt:

Khi lng phõn t ca enzym dao ủng t 19.000 ủn 630.000 Dalton.

Cu trỳc di phõn t ca cỏc enzym ny bao gm nhiu loi khỏc nhau t
monomer (enzym t Kluyveromces lactic) ủn octamer (enzym t E.coli) [4].
Tu thuc vo ngun thu enzym m tớnh ủc hiu phõn t ca tng loi
enzym l khỏc nhau. Cỏc enzym -galactosidaza cú ngun gc t vi khun cú pH
ti u thuc vựng trung tớnh, trong khi ủú hu ht cỏc enzym -galactosidaza t
nm mc cú pH thuc vựng axit, cú mt s chng ủt ti pH ti u l pH=2 [15].
Mt s enzym -galactosidaza t vi khun ủ cú hot tớnh cn phi cú mt
cỏc ion hoỏ tr 1 v cỏc ion hoỏ tr 2, vớ d nh enzym -galactosidaza t S.
rectivirgula cn phi cú mt nhiu ion kim loi hoỏ tr 2 ủ ủt ủn ủ bn nhit v
hot tớnh ti ủa. Tuy nhiờn mt s enzym -galactosidaza khỏc li khụng cn s cú
mt ca cỏc ion kim loi nh enzym t Rhizobium melioti [15].
Nhng ủim trờn cho ta thy tớnh ủa dng ca enzym -galactosidaza vi
sinh vt.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
5


I.2. CC NGUN ENZYM -GALACTOSIDAZA:

Mc dự rt nhiu enzym -galactosidaza t vi sinh vt ủc bit ủn
nhng ch cú mt s ớt cỏc vi sinh vt ủc la chn lm ngun sinh enzym
trong cụng nghip. Hu ht cỏc vi sinh vt ny cú ngun gc t nm mc nh l
Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger v A.oryzae hoc t vi
khun nh E.coli. Nhng loi vi sinh vt ủú ủc la chn chớnh vỡ chỳng cú th
to ra enzym -galactosidaza vi giỏ r v an ton khi cho thờm vo thc phm
[5].
Enzym t vi sinh vt, thc vt ủc ng dng rt rng rói trong cỏc quỏ
trỡnh cụng ngh sinh hc.

I.2.1. Enzym t vi khun:
Vi khun E.coli l ủi tng ủc nghiờn cu ủu tiờn. Cu trỳc bc ba
ca enzym t E.coli cng nh c ch ủiu ho phiờn mó ca gen lacZ ủó ủc
khng ủnh to ủiu kin cho vic nghiờn cu k hn v c ch xỳc tỏc ca
enzym ny. Mc dự vy, vic s dng enzym ny vo cỏc quỏ trỡnh sinh hc ch
ủc kim nghim quy mụ phũng thớ nghim do vi khun ny khụng ủc
phộp cú mt trong cỏc sn phm thc phm. Lnh vc ch yu ca enzym t vi
khun E.coli ny l trong nghiờn cu sinh hc phõn t, trong k ngh v trong
húa min dch.
Enzym -galactosidaza t Steptcoccus thermophilus mt trong nhng vi
khun ủc s dng cụng ngh ch bin cỏc sn phm lờn men t sa cng ủó
ủc s dng ủ thy phõn lactoza trong sa quy mụ cụng nghip do tớnh bn
nhit v ủ an ton khi ủc s dng di dng ph gia sn phm. Nú cng
ủc dựng lm cht xỳc tỏc cho quỏ trỡnh sn xut cỏc galacto-oligosaccarit t
lactoza do hot tớnh chuyn húa galactozyl ca nú cao. i vi vi khun chỳng
cú th phỏt trin ti u trong di pH t 6,5 ủn 7,5. Chỳng kộm phỏt trin pH
di 4 hoc trờn 8,5 [5].
I.2.2. Ezym t nm mc:

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
6

Enzym t nm mc nh Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger
v A.oryae ủó ủc s dng trong cụng nghip ch bin sa v cỏc sn phm t sa.
c bit enzym t A.orytococcuss laurentii v Sterigmatomyces elviae cú hot
tớnh chuyn húa galactozyl cao do vy ủc dựng ủ sn xut cỏc galato-
oligosaccarit t lactoza.
Nm mc phỏt trin ti u trong phm vi pH t 5 ủn 7, chỳng cú th
phỏt trin di pH t 3 ủn 8,5 [6].

I.2.3. Enzym t thc vt lỏ bina:
Cỏc nh khoa hc ủó tỏch chit v tinh ch ủc enzym -galactosidaza
t lỏ cõy bina. Enzym -galactosidaza tỏch t ngun thc vt ny cú kh nng
thy phõn cỏc loi c cht khỏc nhau cỏc tc ủ khỏc nhau. C th l thy
phõn lactoza vi tc ủ bng 2% so vi thy phõn p-nitrophenyl--galactozit.
Monogalactozyldiglyxerit ủc hp th vo trong celit b thy phõn bi -
galactosidaza ti tc ủ nh hn 250 ln so vi thy phõn p-nitrophenyl--
galactozit [8].

I.3. MT S C CH CA CC PHN NG C XC TC BI
ENZYM -GALACTOSIDAZA :
I.3.1. C ch ủng hc ca phn ng vi ONPG:
C ch ủng hc ca phn ng vi s xỳc tỏc ca enzym -galactosidaza
t Escerichia coli cú th ủc th hin ủn gin nht bng phn ng vi 2-
nitrophenyl--D-galatopyranozit (ONPG). ONPG l c cht tng hp trong
ủú aglycon ủúng vai trũ l nhúm chuyn di. ONPG (ủc ký hiu l S) gn vi
enzym ủ hỡnh thnh phc cht Michaelis ES (bc a). 2-nitrophenolat nhanh
chúng ủc gii phúng ủ to thnh hp cht trung gian enzym-galatozyl (bc b),
mt phn hp cht ny ủc thu phõn tip theo (bc c) v phn cũn li ủc
chuyn hoỏ galatozyl (g,h). i vi phn ng thu phõn phõn t H
2
O phn ng
vi hp cht trung gian enzym galatozyl ủ to ra galatoza v enzym dng t
do (bc c). i vi phn ng chuyn hoỏ galatozyl, cht nhn galatozil (kớ hiu

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
7

l Nu) cú mt trong hn hp phn ng gn vo v trớ glucoza ca enzym ủ to

thnh phc cht gm 3 cu t (bc g), sau ủú to thnh sn phm ph Gal-Nu
(bc h). Trong phn ng chuyn hoỏ galatozil, khi nng ủ cht nhn tng thỡ t
l 2-nitrophenol gii phúng ra cng tng, gim hoc khụng ủi tựy thuc vo bn
cht ca cht nhn v cỏc hng s Michaelis (k2, k3 v k6).

Kớ hiu:
E: enzym
S: c cht
NP: 2-nitrophenol
Gal: galactoza
Glu: glucoza
Nu: cht nhn galactozyl











I.3.2. C ch ủng hc ca phn ng vi lactoza:
C ch ủng hc ca phn ng vi lactoza (mt c cht t nhiờn) khỏc so
vi phn ng vi ONPG trờn (hỡnh 1). Bc (b) ủc thay th bng cỏc bc
(d, e) v (f) do glucoza (sn phm ca quỏ trỡnh thu phõn lactoza) cú ỏi lc ủi
vi v trớ glucozyl trờn enzym ny, vỡ vy glucoza ủc gii phúng ra cú th kt
hp ngc li ủ hỡnh thnh mt phc cht gm 3 cu t v sau ủú phn ng vi
galactoza ủ to allolactoza. Trong sut quỏ trỡnh thy phõn lactoza, allactoza ch

ủc hỡnh thnh tm thi do nú cng l mt c cht trong enzym ny.


THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
8

Khi nng ủ lactoza tham gia phn ng cao, lactoza cng ủúng vai trũ
cht nhn lactozyl (Nu) v sn phm chuyn hoỏ l lactozyllactoza. Ngc li,
galactozyllactoza cú th ủúng vai trũ lm cht nhn galactozyl ủ to ra cỏc
tetrasaccarit. Bng cỏch ny, hn hp cỏc oligosaccarid bao gm cỏc di-, tri- v
cỏc saccarit cao hn s ủc hỡnh thnh t lactoza.
I.3.3 C ch thu phõn lactoza ca -galactosidaza cú pH trung tớnh:
Nhúm sulfhydryl nm v trớ hot húa ca -galactosidaza ủúng vai trũ
lm axit chung ủ proton hoỏ nguyờn t oxy ca liờn kt galactozyt, mt nhúm
imidazol ủúng vai trũ lm nhúm ỏi nhõn v tn cụng vo v trớ C-1 ca glycon
ny. Phn ng ủó dn ủn s hỡnh thnh mt phc cht trung gian enzym-
galactozyl nh liờn kt ủng húa tr. Galatoza sau ủú tỏch khi enzym nh s
hp th mt proton t nc bi anion sulfhydryl ủúng vai trũ nh mt baz v
giỳp cho nhúm OH tn cụng vo v trớ C-1 (hỡnh bờn).
Hỡnh 2: C ch thu phõn lactoza ca -galactosidaza cú pH trung tớnh

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
9

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM
10

I.4. SỰ ĐIỀU HỒ SINH TỔNG HỢP ENZYM β-GALACTOSIDAZA
CỦA VI SINH VẬT :
Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật tạo ra các sản phẩm vừa đủ mức
cần thiết cho hoạt động sống, sinh sản và phát triển của chúng. Vận tốc sinh tổng
hợp enzym được điều chỉnh một phần bằng bộ máy di truyền, còn một phần là
do các yếu tố của mơi trường bên ngồi quyết định.
Sự tổng hợp enzym trong tế bào sống có thể được tăng cường (kích thích)
hoặc có thể bị kìm chế (trấn áp). Sự tăng cường sinh tổng hợp một enzym nào

đó hoặc một nhóm enzym cùng tham gia vào việc xúc tác một trình phản ứng
dưới ảnh hưởng của hợp chất hóa học (mà thường là cơ chất phản ứng) gọi là sự
phản ứng sinh tổng hợp. Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp (gây nên sự gia
tăng enzym nào đó) gọi là chất cảm ứng (yếu tố cảm ứng), còn enzym được tạo
thành bằng cơ chế cảm ứng được gọi là enzym cảm ứng. Chất gây kìm hãm sự
sinh tổng hợp một enzym nào đó gọi là chất kìm toả phụ, các enzym bị kìm hãm
khơng được tổng hợp gọi là enzym bị kìm toả.
Sự tạo thành các enzym dị hố (enzym xúc tác sự phân giải cơ chất) được
điều chỉnh bằng cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp. Một trong những ví dụ điển hình
về cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym đã được nghiên cứu khá cặn kẽ là sự
tổng hợp enzym β-galactosidaza cần để sử dụng lactoza của tế bào E.coli. Các tế
bào E.coli ngun thuỷ có thể sinh trưởng trên nhiều cơ chất chỉ chứa một lượng
rất nhỏ β-galactosidaza. Nếu cho thêm vào mơi trường lactoza hay β-
galactosidaza khác trong trong một ít thời gian thì hoạt lực β-galactosidaza của
chúng tăng lên 1.000 lần. Trong trường hợp như vậy có đến 3% tồn bộ protein
tế bào là β-galactosidaza.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
11

I. 5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ ENZYM :
I.5.1 Tách chiết:
Để tách chiết và thu hồi enzym cần phải sử dụng nguồn ngun liệu có
khả năng tách chiết được một lượng lớn enzym bằng các quy trình thơng
thường. Đối với enzym từ một số nguồn cơ chất nhất định cần phải sử dụng
phương pháp tách chiết nhất định, khơng thay thế bằng phương pháp khác.
Ngun tắc chung của q trình tách chiết enzym là cần phải biết rõ vị trí
enzym nằm trong tế bào (enzym có mặt ở dạng tự do hoặc dạng liên kết với
màng) để xác định phương pháp tách chiết phù hợp. Đặc biệt trong trường hợp

enzym là enzym nội bào thì trước hết phải phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể
phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy
tinh hoặc đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa), bằng tác dụng của hóa chất (rượu
butylic, axeton, glixerin, clorofom, SDS… ), bằng sóng siêu âm… Sau khi đã
phá vỡ cấu trúc của các tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch
đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
I.5.2 Tinh chế:
Sau khi tách chiết, trong dịch ngồi enzym còn chứa các protein tạp và nhiều
chất khác, để loại bỏ chúng thường sử dụng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các
biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm lỗng hoặc
bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác
thường dùng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính
chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường, phương pháp kết
tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc
ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel…
Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH mơi
trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzym bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch
enzym được giữ ở 50 đến 70
0
C hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác
định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
12

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH
4

)
2
SO
4
dựa trên cơ sở sự khác
nhau về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm
nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp
của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung mơi hữu cơ.
tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các
dung mơi hữu cơ chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động,
q trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (0
0
C).
Phương pháp hấp thụ chọn lọc được dùng phổ biến trong việc tách và làm
sạch enzym. Chất hấp thụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả
phân tách đặc biệt cao. Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai
cách là chất hấp thụ protein tạp hoặc hấp thụ enzym. Q trình hấp thụ thường được
tiến hành ở 0
0
C. Enzym sau đó dược chiết bằng các dung mơi thích hợp.
Phương pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi
ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm lỗng và các tác nhân
trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc dẫn xuất este
của xelluloza. Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE –
xenlluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngồi tạp chất protein còn có
khả năng loại bỏ cả các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép khơng cần dùng
đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa
protamin hoặc streptomixinsufat thường dùng trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của
chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của

epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Khi lọc và chiết bằng dung mơi thích hợp
một hỗn hợp gồm nhièu chất trên cột sephadex, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ
khuếch tán vào bên trong cột, các phân tử có kích thước lớn khơng có khả năng
đi vào sẽ được chiết ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex
dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các chất
trong hỗn hợp. Sự chênh lệch nhiều về phân tử lượng của các enzym (12.700 –
1.000.000 Da) cho phép tách và làm sạch enzym bằng phương pháp lọc gel
sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng [1].

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
13

Cho đến nay khơng có phương pháp tách và làm sạch chung cho mọi
enzym. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết
lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch
khác nhau.
I.6. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM β-GALACTOSIDAZA:
I.6.1 Ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong cơng nghiệp chế biến sữa và các sản
phẩm từ sữa:
Enzym β-galactosidaza thuỷ phân các gốc β-galactosidaza tận cùng đều
khơng khử của các β-D-galactosit thành các oligosaccarit bao gồm cả lactoza.
Lactoza là disaccarrit bao gồm galactoza và glucoza, trong sữa bò nó chiếm
khoảng 40% trọng lượng chất khơ.
Việc tách loại lactoza khỏi các sản phẩm thực phẩm là cần thiết đối với đại
đa số người tiêu dùng - những người bị thiểu năng chuyển hố lactoza với các
triệu chứng đau bụng, khó tiêu khi dùng lactoza. Tuy nhiên, các sản phẩm thủy
phân của lactoza bao gồm glucoza và galactoza đều dễ hấp thụ qua đường tiêu
hố và dễ đồng hố.
Lactoza trong sữa cũng có thể gây ra một số khó khăn trong q trình chế

biến phomat. Q trình sản xuất phomat tạo ra một lượng lớn dịch sữa “whey”
dưới dạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên.
Dịch sữa này là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực
thực phẩm cũng như thức ăn gia súc. Vấn đề là lactoza khơng hồ tan hồn tồn
và có xu hướng kết tinh từ dung dịch này. Điều này làm cho việc vận chuyển
dich sữa là khó khăn, đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do
vậy mỗi năm người ta phải đổ đi một lượng lớn dịch sữa.
Lactoza có thể được thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ
phân bằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong q trình
chế biến.
Cách tốt hơn là sử dụng enzym β-galactosidaza. Enzym này đã được tìm
thấy trong nhiều hệ vi sinh vật. Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm
men, nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thương mại chính.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
14

Một q trình khả thi về mặt kỹ thuật và cơng nghệ khi sử dụng enzym
này để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đơng tụ sữa chua hoặc
dịch permeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về cơng nghệ như hiện tượng
“lên cát” ở kem, hoặc hiện tượng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa như dịch sau
đơng tụ phomat. Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực cơng nghệ
sinh học của enzym β-galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần
chính phụ của ngành cơng nghiệp chế biến sữa.
Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những người bệnh bị
thiểu năng chuyển hố lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ
phân này, đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh. Vì vậy, người ta mong muốn
sản xuất ra sữa có hàm lượng lactoza thấp sao cho mọi người đều có thể dụng
các sản phẩm từ nó.

Việc lựa chọn cơng nghệ cho q trình thuỷ phân tuỳ thuộc chủ yếu vào
đặc tính và các chi phí sản xuất, tàng trữ và tiếp thị sản phẩm. Quy trình cơng
nghệ khả thi bao gồm bổ sung trực tiếp enzym hồ, tan, tái tuần hồn enzym hồ
tan bằng quy trình màng hoặc sử dụng enzym cố định. Mặt khác, ở những phân
xưởng nhỏ sản xuất các sản phẩm từ sữa cũng có thể sử dụng các sản phẩm
enzym ở dưới dạng canh trường ni cấy một cách đơn giản.
Vấn đề khó nhất khi sử dụng β-galactosidaza là khó đạt được thuỷ phân
hồn tồn vì 2 lý do sau:
• Enzym này là sản phẩm bị ức chế bởi glucoza được tạo ra trong q trình
phản ứng.
• Enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hố tổng hợp các đồng phân liên kết
β 1-6 của lactoza và các chất khác ngồi lactoza.
Đối với mục đích sử dụng thuỷ phân lactoza các hướng chính hiện nay là:
• Sử dụng enzym cố định
Có rất nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về sử dụng enzym β-
galactosidaza cố định nhưng cho đến nay áp dụng nó vào quy mơ cơng nghiệp
vẫn gặp nhiều khó khăn. Enzym này được cố định trên một loạt các chất mang
vơ cơ, Shepadex, DEAE-xenllulose, thuỷ tinh xốp hoặc bẫy vào trong gel

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
15

polyacrylamit… Enzym cố định được sử dụng cả trong các thiết bị phản ứng
liên tục và gián đoạn [9].
• Sử dụng ở dạng liposom sấy khơ có chứa β-galactosidaza để thuỷ phân
lactoza trong sữa.
Liposom bao gồm một màng kép lipit giống như màng sinh học có khả
năng ứng dụng rộng rãi trong y học. Enzym β-galactosidaza được thêm vào giữa
dưới dạng các liposom sấy khơ có khả năng thuỷ phân lactoza trong sữa nhờ sự

phân giải liposom với sự có mặt của các muối hố trị 2 và được hồn ngun
gần như hồn tồn bằng cách hydrat hố lại [10].
• Sử dụng vi sinh vật chịu nhiệt để sinh tổng hợp nên enzym có tính bền
nhiệt cao có thể sử dụng trong các q trình chế biến đòi hỏi nhiệt độ cao.
Hạn chế lớn nhất của các enzym này là để vơ hoạt enzym sau q trình chế
biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao, điều này đơi khi dẫn đến chất lượng sản
phẩm thay đổi.
• Sử dụng vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp để sinh tổng
hợp enzym có khả năng ở nhiệt độ thấp.
Người ta mong muốn các enzym hoạt động ở nhiệt độ thấp này có phân tử
linh động hơn, cho phép biến đổi thuận nghịch về cấu tạo nhằm tạo điều kiện
cho hoạt động xúc tác. Tính linh động hơn về cấu trúc cũng khiến cho enzym
này nhạy đối với sự phá huỷ bởi nhiệt và hóa chất. Các enzym này cũng góp
phần đáng kể trong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và sự ổn định của
các phân tử protein. Khi sản xuất các enzym này thì cơng nghệ tách cần phải
thực hiện trong các điều kiện nhẹ nhàng và giảm thiểu số bớt tinh chế nhằm hạn
chế sự hao hụt enzym [8].
1.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hố galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza:
Oligosaccharid còn được gọi là galactoligosacchatit (GO), là sản phẩm
của chuyển hố nội phân tử.
Trong những thập kỷ qua người ta đã phát hiện ra GO có tác dụng tốt đối
với sức khoẻ con người, GO có khả năng chống lại được chất gây ung thư, giảm

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
16

lượng cholesterol và tốt cho đường ruột, GO còn được sử dụng làm chất tạo
ngọt, chất hồ tan… Vì vậy nó được dùng làm ngun liệu thực phẩm.
Để có sản phẩm GO lactoza, rất nhiều thử nghiệm được nghiên cứu trên

những vi sinh vật có khả năng sinh GO cao hoặc enzym β-galactosidaza có hoạt
tính chuyển hố galatozyl cao. Ngày nay, có rất nhiều lồi vi sinh vật được tìm
thấy có khả năng sinh enzym có thể chuyển hố galatozyl cao như là Bacillus
circulans, Steptococcus thermophuluss, Aspergillus oryzae. Những tế bào nấm
men và vi khuẩn lactic cũng có thể sinh enzym chuyển hố lactoza thành GO
[12].
Vào những năm 1950 phát hiện oligosaccharid được hình thành trong q
trình thuỷ phân nhờ enzym β-galactosidaza. Có 12 loại oligosaccharid được tạo
thành tuỳ thuộc vào nguồn enzym và cấu trúc của các oligosaccharid đó đã được
các nhà khoa học phân tích. Nakanishi đã đưa giả thiết sự tổng hợp oligosaccharid
nhờ phản ứng chuyển hố glycozyl từ enzym β-galactosidaza của vi khuẩn
Bacillus circulans, nhưng ơng vẫn chưa đưa ra được cấu trúc của các
oligosaccharid đó. Xa hơn, Usui et al. đã chỉ ra sự chuyển hố đặc hiệu mối liên kết
β-(1-4) galatozyl-disaccharit nhờ enzym β-galactosidaza từ Bacillus circulans.
Có 11 oligosaccharit tạo ra nhờ enzym β-galactosidaza của vi khuẩn
Bacillus circulans với cơ chất là lactoza đã được phát hiện và làm sáng tỏ. việc
Việc điều tra nghiên cứu cấu trúc của các galatoligosaccharit nhờ phản ứng
chuyển hố glycozyl của enzym β-galactosidaza từ vi khuẩn Bacillus circulans
sử dụng pNP-galactoza như là một chất cho galatozyl và glucoza như một chất
nhận đã được nghiên cứu.
I.6.3 Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein:
Enzym β-galactosidaza là enzym xúc tác cho q trình thuỷ phân và
chuyển hố các gốc β-D-galactozyl. Các gen β-galactosidaza đã được tạo dòng và
tách chiết từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Chúng có những cấu trúc bậc
một, cáu trúc bậc bốn, khối lượng phân tử, tính đặc hiệu cơ chất và tính đặc hiệu
xúc tác khác nhau rõ rệt. Chúng được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến do

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
17

kh nng ng dng rng rói lm cỏc gen thụng bỏo trong nhiu h thng, chỳng
thng liờn quan ủn cỏc bnh di truyn ca ngi nh bnh GMY-
gangliosidosis v bnh Morquio typ B.
K ngh Protein l mt lnh vc cc k phỏt trin nhm to ra cỏc protein
ủa chc nng, to ra cỏc dng ủt bin ca enzym vi cỏc ủc tớnh tt v s
lng ngy mt gia tng. Enzym -galactosidaza t E.coli t lõu ủó ủc ng
dng rng rói lm cỏc maker phõn t. Bng cỏch ci cho phộp xỏc ủnh rừ v trớ
dung np ủi vi s ủiu tit ca cỏc peptit chc nng l v s biu hin ca
chỳng trờn b mt tip xỳc vi dung dch ca enzym cú hot tớnh. Hn na vic
ủnh v peptit khỏng th t virut trờn vũng hot hoỏ ca -galactosidaza to ra
mt phõn t cm bin nhm phỏt hin ủnh tớnh cỏc khỏng th ủc hiu. Vic
gn kt ca enzym ny vi huyt thanh hoc khỏng th ủn dũng ủc cho l
ngn chn s ci gn peptit. Hot tớnh ủc phc hi ny cú th ủc xỏc ủnh
mt cỏch chớnh xỏc, nhanh chúng v d dng bng phng phỏp so mu quang
ph. Vỡ cỏc lý do trờn, -galactosidaza trc ủõy ủc gi l phosphataza kim
cú th tr thnh nn tng cho mt th h phõn t cm ng mi t enzym .
I.7. NGUN THU T ENZYM CễNG NGHIP TRONG TNG LAI:
Mc dự vic sn xut v ng dng -galactosidaza ngy mt phỏt trin,
ngi ta vn c gng gim chi phớ sn xut, ti thiu hoỏ lng enzym cn s dng,
nhng nõng cao tc ủ v hiu sut thu phõn. Ngun enzym trong tng lai s l
enzym ủc s dng dng vi nng, enzym ủc ci bin bng phng phỏp hoỏ
hc hoc phng phỏp di truyn ủi vi chng vi sinh vt tng hp nờn nú.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
18

I.8. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYM β-GALACTOSIDAZA TRONG
TƯƠNG LAI:

Do tầm quan trọng của enzym β-galactosidaza trong các q trình sinh
học, trong các ứng dụng trị liệu và chế biến thực phẩm nên việc đánh gia và tối
ưu hố phương pháp tổng hợp nhằm tạo ra phương pháp đơn giản, nhanh chóng
và hiệu quả là mục tiêu của các nhà sản xuất và nghiên cứu.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tổng hợp nên các oligosaccarit mới có
tiềm năng ứng dụng rất lớn. Các glicoprotein chứa duy nhất một loại gốc đường
tham gia vào việc xác định loại nhóm máu, đóng vai trò trong các bệnh truyền
nhiễm virut và nhiễm khuẩn, chịu trách nhiệm đối với các nhận biết tế bào – tế
bào, nằm trên các vị trí thụ thể tế bào. Các galactozit có thể được sử dụng làm
phụ gia thực phẩm với nhiều mục đích, chức năng khác nhau như làm chất tạo
ngọt, chất ổn định, chất hồ tan…
Trong tương lai, các ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và y học tập
trung vào các q trình chuyển hố galatozyl nhằm tổng hợp nên các hợp chất
chức năng duy nhất bằng cách thêm vào các phần tử nhận.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
19

PHẦN II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


II.1 NGUYÊN LIỆU:
II.1.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập:
II.1.1.1 Môi trường thạch dùng ñể phân lập (môi trường Lactoza-Broth):
Thành phần:
Cao thịt bò: 3g
Pepton: 5g
Lactoza: 5g

Agar: 15
÷
20g
Nước thêm ñạt 1000 ml
Thanh trùng ở 110
o
C/ 30 phút
II.1.1.2 Môi trường nuôi cấy cơ bản (môi trường Lactoza):
Lactoza: 20g
Pepton: 3g
NaCo
3
: 3g
KCl: 0.5g
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g
KH
2
PO
4
: 0.1g
FeSO
4
.7 H
2
O: 0.01g
ZnSO

4
.7H
2
O: 0.01g
CuSO
4
.5H
2
O: 0.005g
Nước thêm ñạt 1000 ml
Thanh trùng ở 110
o
C/ 30 phút
Môi trường thạch dùng ñể cấy chuyền và giữ giống còn có thêm Agar-
Agar với hàm lượng 15 ÷ 20g/lít môi trường.


THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM
20

II.2 HỐ CHẤT:
II.2.1 Nguồn Cacbon:
- Nguồn cacbon sử dụng Lactoza, Glucoza, Saccaroza.
II.2.2 Nguồn Nitơ:
- Nguồn Nitơ vơ cơ sử dụng: NaNO
3
, (NH
4
)

2
SO
4
.
- Nguồn Nitơ hữu cơ sử dụng: Pepton, cao thịt bò.
II.2.3 Các hố chất khác:
- Cơ chất ONPG (o-nitrophenil-β-D-galactopyranoside): sản phẩm của
hãng Sigma Alrich-Germany.
- Thuốc thử X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactoside): sản
phẩm của hãng USB
TM
- Italia.
- Clorofrom tinh khiết.
- Dung dịch SDS (sodium dodecyl sunfate): 0.1%.
- Dung dịch Na
2
C0
3
. 1M.
- 2-mecaptoetanol.
- Các hố chất khác.
Ghi chú: Tất cả các hố chất phân tích đều là hố chất tinh khiết.
II.3 THIẾT BỊ:
- Kính hiển vi Nikon eclipse E800, camera Fujix Digital HC-300Zi,
Japan.
- Thiết bị so màu quang phổ Ultrospec

2000, Amersham pharmacia
biotech, Germany.
- Máy ly tâm lạnh Allegra TM 64R Centrifuge-Beckman, Germany.

- Máy ly tâm thường EBA 20 – Hettich zentrifugen, Germany.
- Máy ly tâm eppendof IK15 – Sigma laborzentrifugen 1999, Germany.
- Thiết bị siêu âm phá vỡ tế bào.
- Tủ ni ổn nhiệt B12 Heracus-Kendo laboratory Products.
- Thiết bị hấp tiệt trùng Medizinische Geratefabrik, Berlin.
- Máy ni cấy ổn nhiệt Shaking incubator, Korea.
- Máy đo pH MP 220 – Mettler Toledo.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
21

II.4 CC PHNG PHP NGHIấN C:
II.4.1 Nhum gram: [2]
Vi phng phỏp nhum ny, ngi ta cú th phõn bit s khỏc nhau gia
hai loi vi sinh vt ging nhau v hỡnh thỏi v kớch thc. Nguyờn nhõn ca hin
tng ny l do cu to hoỏ hc ca nhng vi sinh vt khỏc nhau l khụng ging
nhau. Cú nhiu gi thit v c ch nhum gram (gi thuyt v ủim ủng ủin,
cu to t bo, thnh phn hoỏ hc ). Nhng cho ủn nay, gi thuyt v cu
to hoỏ hc vn ủc chp nhn tuyt ủi hn c. Thuyt ny cho rng kh nng
bt mu ca t bo vi sinh vt cú liờn quan ti mui magiờ ca axit ribonucleic.
Khi nhum mu phc tp (nhum gram) mui ny cú phn ng vi thuc
nhum loi triphenymetan (nh gential violet, kristal violet hoc metyl violet)
chu ủc tỏc dng ca cn, ngha l khụng mt mu di tỏc dng ca cn.
Nhng vi sinh vt cú tớnh cht ny gi l vi sinh vt gram dng. Ngc li
nhng vi sinh vt khụng gi mu khi x lý bng cn l vi sinh vt gram õm.
õy l mt trong nhng ủc ủim quan trng trong vic phõn loi vi sinh vt.
Da vo kh nng nhum mu gram ca vi sinh vt m ngi ta chia chỳng ra
thnh 2 nhúm:
- Vi sinh vt gram dng (G

+
): gm hu ht cỏc loi cu khun, trc
khun hiu khớ cú nha bo;
- Vi sinh vt gram õm (G
-
): gm vi khun ủng rut v vi khun axetic.
Hoỏ cht:

+ Dung dch tớm gential
+ Dung dch lugol
+ Cn 95
0

+ Dung dch fucsin
+ Du sộc
+ Toluen
Tin hnh:

+ Lm tiờu bn vi sinh vt, c ủnh vt bụi
+ Nhum bng tớm gential (gential violet): nh tớm gential lờn vt bụi, gi
trong 1-2 phỳt ri ủ ht thuc nhum ủi.
+ Nhum bng dung dch lugol: nh lugol lờn tiờu bn, ủ trong 1 phỳt ri
ủ thuc nhum ủi.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
22

+ Rửa bằng cồn 95
0

trong 30 giây.
+ Rửa lại bằng nước rồi làm khô vết bôi bưàng sứa nóng ñèn cồn.
+ Nhuộm bổ sung bằng fucsin trong 1 phúỏngồi rửa lại bằng nước, ñợi
khô sau ñó ñem quan sát.
Tế bào vi sinh vật nhuộm gram dương bắt màu tím, còn gram âm bắt
màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung [2].

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM
23

II.4.2 Xác định tính enzym β-galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal [15]:
Sự có mặt của β-galactosidaza được xác định dựa trên ngun tắc sau: β-
galactosidaza thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh Blue kiểu
indigo. Vì vậy vi khuẩn dương tính với enzym này tạo khuẩn lạc màu xanh khi
ni cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal.
X-Gal được hồ tan trong dimethylformamide ở nồng độ 20 µg/ml. Dung
dịch gốc này phải được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4
0
C.
Mơi trường thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thường được hấp vơ
trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 55
0
C, sau đó thêm chỉ thị X-Gal vào
đến nồng độ cuối là 4 µg/ml (dung dịch gốc pha lỗng 500 lần). Cần chú ý
khơng thêm chỉ thị X-Gal vào khi nhiệt độ mơi trường lớn hơn 55
0
C do tại nhiệt
độ lớn hơn 55
0

C chỉ thị này khơng bền và sẽ bị phân huỷ.
Đĩa thạch chỉ thị này được dùng để ni vi khuẩn. Sau một thời gian
ni cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi
khuẩn tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là chủng có khả năng sinh
tổng hợp enzym β-galactosidaza.
Cần chú ý là các đĩa thạch sau khi đã thêm chất chỉ thị phải được bảo
quản trong tối ở 4
o
C và chỉ dùng được trong khoảng thời gian là 1 tháng.
II.4.3 Xác định hoạt độ enzym β-galactosidaza nội bào [9]:
Hố chất:

- Dung dịch đệm Z (pha cho 1 lít, bảo quản ở 4
0
C vơ hạn định), thành
phần trong dung dịch đệm Z là như sau:
+ Na
2
HPO
4
0,06M (ở dạng ngậm 12H
2
O, phân tử lượng là 358,14)
+ NaH
2
PO
4
0,04M (ở dạng ngậm 2H
2
O, phân tử lượng là 156.01)

+ KCL 0,01M
+ MgSO
4
0.001M
Dung dịch đệm Z được pha trong nước, trước khi sử dụng thêm 2-
mercaptoetanol với hàm lượng 0,27 ml 2- mercaptoetanol/100ml dung dịch
đệm.
- Dung dịch Na
2
CO
3
1M (bảo quản vơ hạn định ở nhiệt độ phòng)

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
24

- Dung dch c cht ONPG.
- Dung dch ủm phosphat 0,1M, pH = 7,0 cú thnh phn nh sau:
Na
2
HPO
4
.7H
2
O 0,06M
NaH
2
PO
4

.H
2
O 0,04M
iu chnh ủn pH 7,0 bng NaOH hoc H
3
PO
4
. Dung dch ny n ủnh
nhit ủ phũng v khụng cn phi pha mi hng ngy.
Dung dch c cht nng ủ 4 àg/ml ủc pha trong ủm photphat 0,1M,
pH 7,0 nờu trờn, ủc lc v bo qun 4
0
C cho ủn khi bt ủu ng sang mu
vng. tt hn l dung dch c cht ny ủc pha mi hng ngy.
- Dung dch SDS 0.1%
- Dung dch clorofom tinh khit.
Thit b v dng c:

- Thit b li tõm
- Thit b so mu quang ph
- Thit b n nhit
- Cỏc dng c khỏc
Tin hnh:

- Chun b sinh khi vi sinh vt:
+ Ly tõm ớt nht 2ml dch nuụi cy vi sinh vt, quỏ trỡnh ly tõm 4
0
C vi
tc ủ 6000 vũng/phỳt.
+ Loi b phn dch trong, phn cn bó ủc tỏi to huyn phự bng cựng

mt th tớch dung dch ủm Z ủó lm lnh.
- o ủ hp th OD ti 600nm vi mu trng lỏ dung dch ủm Z.
- Pha loóng dch huyn phự cha t bo vi sinh vt bng dung dch ủm Z,
tu thuc vo hot ủ ca enzym trong mu dch nuụi cy vi sinh vt m cn
pha loóng cỏc t l nht ủnh.
- Lm tng tớnh thm ca cỏc t bo vi sinh vt ủó pha loóng ny bng
cỏch thờm 100 àl Cloroform v 50 àl dung dch SDS 0,1% vo 1ml huyn phự
ủó pha loóng trờn.
- Lc ủu v ủ n ủnh 28
0
C trong 5 phỳt.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
25

Phõn tớch:
- Bt ủu phn ng bng cỏch thờm 0,2 ml dung dch c cht ONPG
trờn vo mu thớ nghim.
- Gi mu 28
0
C cho ủn khi thy xut hin mu vng tng t nh mu
ca mu dch chit bũ thỡ dng phn ng enzym v ủc thi gian phn ng tớnh
t lỳc thờm dung dch c cht.
- Dng phn ng enzym bng cỏch thờm vo 0,5 ml dung dch Na
2
CO
3

1M.

- c mt ủ quang ti 420 nm v 550 nm vi mu trng cú thnh phn
ging nh mu phõn tớch nhng th t thờm c cht v thờm cht dng phn ng
l ngc nhau, ngha l ban ủu thờm cht dng phn ng, thờm tip c cht ri
mi 28
0
C.
Tớnh kt qu:

Tớnh toỏn s ủn v hot ủ cú trong 1 ml dch nuụi cy theo cụng thc
sau:
1000 (OD
420
1,75.OD
550
)
E =
V.T.OD
600

Trong ủú: E: Hot ủ enzym (MU/ml)
V: th tớch ca mu ủem phn ng (ml)
T: thi gian phn ng (phỳt)
OD
420
v OD
550
: giỏ tr ủo mt ủ quang ca dung dch mu mu
sau phn ng cỏc bc súng 420 nm v 550 nm so vi mu trng.
OD
600

: giỏ tr mt ủ quang ca dch mu bc súng 600 nm vi
mu trng l dung dch ủm Z.
II.4.4 Xỏc ủnh hot ủ enzym -galactosidaza ngoi bo [9 ]
Xỏc ủnh hot ủ enzym -galactosidaza ngoi bo trong mu dch lờn
men bng phng phỏp tng t nh trờn, ch khỏc nhng ủim sau:
Chun b mu:

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN