MỘT số CÁCH lấy mẫu mới và ẢNH HƯỞNG của CHÚNG lên sự tái SINH của một số LOÀI cây có GIÁ TRỊ KINH tế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG






ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC









MỘT SỐ CÁCH LẤY MẪU MỚI VÀ ẢNH
HƯỞNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ TÁI SINH CỦA
MỘT SỐ LOÀI CÂY CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ

Giáo viên hướng dẫn: TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
CN. NGUYỄN BÁ NAM
Sinh viên thực hiện: HOÀNG VĂN THƯỞNG
Lớp : 47 CNSH



NHA TRANG, 2009
Click to buy NOW!

P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a

c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d

o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
1

1




Phần 1

Tổng quan
tài liệu

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
2

2

1.1. Tái sinh cơ quan
1.1.1. Sự tái sinh bất ñịnh
Những cơ quan như chồi hay rễ có thể ñược hình thành từ bất cứ loại mô
nào của cây, những cơ quan ñược khởi tạo như vậy ñược gọi là cơ quan bất ñịnh.
Quá trình tái sinh các cơ quan bất ñịnh gọi là sự phát sinh cơ quan bất ñịnh. Ở
ñây, chồi hay rễ có thể hình thành từ một tế bào ñơn, hay một nhóm tế bào. Các
tế bào này ñược kích thích bởi ñiều kiện môi trường ñể trở thành trung tâm của
sự phân chia tích cực các tế bào (mô phân sinh bất ñịnh).
Sự tái sinh ñã ñược nghiên cứu in vitro trên số lượng lớn cây trồng của
nhiều loài khác nhau, nhưng không phải khả năng tái sinh của cây nào cũng như
nhau. Thậm chí trong cùng một giống cây trồng vẫn có sự khác nhau, ñó có thể là
do tính ñáp ứng in vitro kém (recalcitrant) hay không có khả năng tái tạo cơ quan
từ mẫu cấy ban ñầu. Hơn nữa, ở một số loài khả năng tái sinh có thể bị mất sau
quá trình chuyển gene.
Khả năng tái sinh của tế bào thông qua các biến ñổi phát sinh hình thái là
kết quả của sự phản phân hóa ñể trở nên tiềm năng trước các hướng kích thích
khác nhau. Theo sau quá trình này là sự hình thành các chương trình phát triển
của tế bào và cuối cùng là sự phát triển thành cơ quan bất ñịnh (Nhựt và cộng sự,
2003).
Người ta vẫn còn chưa biết rõ tại sao một số cây trải qua quá trình phát sinh
cơ quan và một số khác lại không. Một số giả thuyết ñược ñề nghị bởi
Christianson và Warnick (1984) giải thích một chuỗi các quá trình của sự phát
sinh cơ quan theo thời gian.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
3

3


Hình 1. Giả thuyết về các giai ñoạn phát sinh cơ quan bất ñịnh.
Theo ñó thì sự phát sinh cơ quan phải trải qua hai giai ñoạn cơ bản sau:
• Giai ñoạn một: ñể cho các mô hình thành cơ quan, tế bào của mô ñó phải
có tiềm năng bao gồm khả năng cảm ứng ñược với môi trường và có
những phản ứng biến ñổi trong bản thân nó.
• Giai ñoạn hai: là quá trình xác ñịnh hướng phát triển của tế bào tiềm năng
ñể sau ñó tế bào bước vào giai ñoạn biệt hóa.
Các giai ñoạn này ñều cần ñến sự tác ñộng của hormone. Chỉ có khi bước
vào giai ñoạn biệt hóa thì tế bào không cần ñến tác ñộng của hormone nữa.
1.1.1.1. Tính khả biến
Tế bào thực vật nào cũng mang tính toàn năng nghĩa là khả năng trẻ hóa và
hình thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào thông qua quá trình nuôi cấy in
vitro. Tuy nhiên, khả năng phản phân hóa (bao gồm sự trẻ hóa và tái xác ñịnh con
ñường phát triển mới của mô) không phải lúc nào cũng như nhau trên mọi tế bào.

Có những tế bào dường như không thể tái tạo cơ quan, chúng ñược cho rằng ñã
mất khả năng tái sinh. Nếu tế bào thuộc mô cấy nào chưa sẵn sàng cho quá trình
cảm ứng ngay tại thời ñiểm cắt mẫu thì chúng cũng có thể vẫn không cảm ứng
suốt quá trình nuôi cấy in vitro. ðây gọi là tính khó ñáp ứng in vitro. Trái lại, có
những tế bào tỏ ra thích ứng với sự phân chia và duy trì ñược khả năng phát sinh
hình thái trước các kích thích tố thích hợp. Khả năng này ñược gọi là tiềm năng
tế bào, chúng chỉ ra rằng mỗi tế bào có tất cả các thông tin cần thiết ñể tái sinh
Tế bào có tiềm
năng thích ứng
G
iai ñoạn khởi ñầu
Giai ñoạn cảm ứng
Giai ñoạn xác ñịnh
Giai ñoạn phản phân hóa
Hormone
Hormone


K
hông cần
hormone tác
ñộng
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h

a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!

P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a

c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
4

4

thành một cây mới. Giai ñoạn các tế bào tiềm năng tiếp xúc với môi trường nuôi
cấy ñược gọi là giai ñoạn cảm ứng của tế bào.
Có rất nhiều giả thuyết ñã ñược các nhà khoa học ñề cập liên quan ñến chức
năng của mô phân sinh trong quá trình cảm ứng của tế bào. Nhiều người cho rằng
chỉ các mô trong vùng phân sinh mới chứa các tế bào tiềm năng. Trong khi một
giả thuyết khác ñược ñặt ra bởi Street (1977) thì cho rằng mặc dù tế bào nào cũng
có tính tiềm năng nhưng các tế bào mới ñược tạo ra ở mô phân sinh lại có ưu thế
hơn các tế bào xung quanh khi bước vào các cơ chế phân chia. Thêm một nhận
ñịnh khác của Cassells (1979) cho rằng các mô phân sinh mới thường bị ức chế
phát triển bởi một loại chất tiết ra từ các mô phân sinh ñã tạo trước nó. Vậy rõ
ràng các tế bào cấu thành nên các mô phân sinh có tiềm năng cảm ứng cao hơn
các loại tế bào khác bởi vì chúng ñã ñược kích thích chuyển sang giai ñoạn biệt
hoá mức ñộ thấp trước khi ñi vào con ñường biệt hoá.
1.1.1.2. Tính xác ñịnh
Các tế bào tiềm năng dưới tác ñộng tích cực của hormone, bắt ñầu ñược lập
trình theo các hướng xác ñịnh ñể trở thành các tế bào chuyên hóa. Tuy nhiên, có
một số tế bào ñã ñược tiền xác ñịnh phát sinh kiểu hình thái cho nên chúng chỉ

cần những kích thích nhỏ trong môi trường ñể hình thành các mô phân sinh thay
vì trải qua quá trình phân hoá tế bào.
Hướng phát triển ñịnh trước của tế bào tiềm năng cũng như tế bào mới
ñược sinh ra ñều có thể biến ñổi và phát sinh theo mục ñích nuôi cấy, ví dụ các tế
bào trong vùng mô phân sinh rễ có thể biến ñổi khi thêm cytokinin ñể thành mô
phân sinh chồi. Tuy nhiên, khi tế bào ñã có tính xác ñịnh thì chúng bước vào con
ñường ñã ñược lập trình của hệ gene và khi ñó chúng ta không thể ñảo ngược tiến
trình này nữa.
Có thể nói, tính tiềm năng cũng như tính xác ñịnh của tế bào trong các môi
trường in vitro ñặc biệt chịu ảnh hưởng bởi chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
ngoại sinh (loại và nồng ñộ), và cả lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh có
trong mẫu.
1.1.2. Các hình thức tái sinh
1.1.2.1. Tái sinh trực tiếp
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng

Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
5

5

Mô phân sinh chồi hình thành trực tiếp từ mẫu cấy thường ñược khởi tạo
bằng sự phân bào sơ cấp sau 48 giờ nuôi cấy. Kế tiếp mỗi quá trình phân bào sơ
cấp là một quá trình phân bào dài và phức tạp hơn, kết quả hình thành nên các
mầm chồi bất ñịnh, mỗi mầm chồi bao gồm nhiều tế bào. Sự hình thành trực tiếp
này thường bắt nguồn từ một hay một nhóm các tế bào sinh dưỡng chưa phân
hoá.
Broertjes và cộng sự (1976), cho rằng trong suốt quá trình phát sinh cơ
quan trực tiếp, các mầm chồi bất ñịnh không phải lúc nào cũng ñược hình thành
từ nhiều tế bào của mô. Một tế bào biểu bì ñôi khi lại khởi ñiểm cho quá trình
phát triển của vùng phân sinh trung tâm là nguồn gốc của 1 cho tới 22 chồi giống
nhau. Các nghiên cứu khác trên một số cây trồng khác cũng khẳng ñịnh giả
thuyết vùng mô phân sinh có nguồn gốc từ một tế bào.
Bảng 1. Các cây trồng phát sinh chồi bất ñịnh từ một tế bào biểu bì
Loài Tham khảo
Achimenes Broertjes (1972)
Begonia Mikkelsen và Sink (1978)
Chrysanthemum Roest (1977)
Kalanchoe Broertjes và Leffring (1972)
Lilium Broertjes và cộng sự (1976)
Sự phát sinh chồi bất ñịnh trực tiếp thường bắt ñầu từ các tế bào nhu mô
nằm ở trong biểu bì (Broertjes và Van Harte, 1978). Từ một nghiên cứu tái sinh
chồi từ thể khảm của lá cây Saintpaulia. Norris và Smith (1981) kết luận rằng sự
khởi tạo vùng mô phân sinh trên ñỉnh liên quan tới sự kết hợp của các tế bào dưới
lớp biểu bì. Chồi trên môi trường nuôi cấy lá Nicotiana tabacum phát sinh trực
tiếp từ các tế bào mô giậu thịt lá quanh rìa lá (Attfield và Evans, 1991). Thể

khảm cũng thấy ở nhiều ñối tượng cây trồng tái sinh khác (Broertjes và Van
Harte, 1978) càng chứng tỏ nguồn gốc ña bào của sự phát sinh chồi.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-

t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
6

6

Attfield và Evans (1991) trong các nghiên cứu từ lá cây Nicotiana tabacum
thấy rằng rễ bất ñịnh hình thành trực tiếp từ ba bó mạch và các mạch của nhu mô.
Sự hình thành rễ bất ñịnh này tương tự như sự khởi tạo rễ có nguồn gốc ña bào từ
các mẫu cấy chồi cây Pisum sativum, rễ ñược phát sinh từ các tế bào nhu mô và
các mô mạch ñã có trước ñó (Gahan và Doré, 1984). Có những biểu hiện tác
ñộng trực tiếp từ trên những tế bào xuất phát từ mô mạch và có thể là IAA hay
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật khác ñã khuếch tán vào các tế bào và khởi

ñộng cho quá trình phân bố mạch và tạo rễ.
1.1.2.2. Tái sinh gián tiếp
Sự hình thành các khối mô sẹo từ mẫu cấy ban ñầu sau khoảng thời gian
nuôi cấy nhất ñịnh ñể hình thành các chồi bất ñịnh. Các chồi này phát triển từ
ngoại vi mô sẹo và không có quan hệ ban ñầu với các mô có mạch dẫn của mẫu
cấy. Sự hình thành cơ quan như thế ñược gọi là quá trình tái sinh gián tiếp.
Sự phát sinh gián tiếp các cơ quan bất ñịnh cũng tương tự như sự phát sinh
trực tiếp, bắt ñầu bằng sự phân chia nhanh các tế bào ñể dẫn tới sự hình thành
vùng phân sinh. Tiếp theo là sự xuất hiện các mầm chồi và cuối cùng là chồi
(Torrey, 1966). Vì vậy, rất khó phân biệt hai hình thức phát sinh cơ quan này.
Thường ñể sự phát sinh cơ quan gián tiếp xảy ra, các mô sẹo hình thành từ mẫu
cấy phải ñược cấy chuyền sang môi trường chứa chất ñiều hòa sinh trưởng thực
vật thích hợp cho quá trình biệt hóa mô sẹo.
ðối với mục ñích nhân giống in vitro, nếu cây tái sinh trực tiếp từ mẫu cấy
ban ñầu thì không những nhanh chóng thu ñược cây, mà các cây này cũng khá
ñồng nhất về mặt di truyền. Tế bào mô sẹo sau khi cấy chuyền nhiều lần sẽ
không ổn ñịnh về mặt di truyền. ðể tránh tình trạng ñó nhất thiết phải sử dụng
loại mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp ñể tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu
ñược cây tái sinh ñồng nhất.
1.1.3. Vết thương
Quá trình tạo vết thương bằng các tác ñộng cơ học vào mẫu cấy như cắt, tỉa
thường kích thích sự tái sinh. Tất cả các mẫu cấy khi ñược nuôi cấy in vitro ñều
phải qua quá trình xử lý với kéo, dao cấy hoặc các dụng cụ khác vì thế mẫu luôn
bị tổn thương. Mẫu cấy càng nhỏ thì tỷ lệ bề mặt vết cắt càng lớn. Trong nhiều
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t

r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
7

7

trường hợp, vết thương có thể tiết ra các chất cản trở sự phát triển của mẫu cấy
nhưng cũng có khi nó giải phóng ethylene, loại hormone này thường kích thích
sự hình thành mô sẹo hay các cơ quan bất ñịnh (chồi hoặc rễ).
1.1.3.1. Vết thương tạo thành khi xử lý mẫu
Sự tái sinh thường diễn ra ở bề mặt của vết cắt do ñó việc tạo vết thương
cho mẫu cấy sẽ kích thích quá trình tái sinh diễn ra nhanh và ñạt hiệu quả hơn. Lá
mầm của cây Pyrus malus ñược cắt ñôi, tạo ra nhiều chồi bất ñịnh từ các mô sẹo
có kích thước nhỏ ở gần vết cắt (Browning và cộng sự, 1987). Mặc dù rìa vết cắt
của lá cây Ipomoea batatas không hình thành những khối mô sẹo tiền phôi,
nhưng quá trình tạo phôi lại diễn ra ngay trên vết cắt thân và những mẫu cấy lá
cắt nhỏ (Liu và Cantcliffe, 1984). Cắt nhỏ lá non cây Malus thành 14 mảnh sẽ
kích thích khả năng mô lá hình thành các chồi bất ñịnh và các cấu trúc tiền phôi
(Welander, 1988). Nếu nuôi cấy nguyên vẹn thể phôi của giống táo ‘Delicious’
và giống ‘Winesap’ thì chỉ hình thành mô sẹo lần lượt là với các tỷ lệ là 100% và
55%, nhưng khi cắt thành 3 phần bằng nhau thì tỷ lệ tạo chồi bất ñịnh của các

ñoạn cắt lá mầm và chồi mầm khá cao. Tỷ lệ tạo chồi từ các mẫu cấy rễ mầm của
‘Delicious’ và ‘Winesap’ lần lượt là 0% và 11%. Korban và Skirvin (1985) cho
rằng các tác ñộng trong quá trình phân chia mẫu cấy phôi làm loại bỏ tác nhân tái
sinh ñã từng tồn tại trước ñó ở vùng rễ mầm hoặc tăng hoạt tính của một số chất
ức chế ở vùng này.
Trong một số trường hợp, mẫu cấy không cảm ứng ñược kích thích của các
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật nếu chúng không ñược tạo vết thương, ñiển
hình như mầm chồi của cây xương rồng Opuntia polycantha, nó không phản ứng
với auxin hay cytokinin trong môi trường nếu như không bị tổn thương. Các mẫu
cấy này sau ñó hình thành rễ bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l NAA và chồi
bất ñịnh trên môi trường có 10 mg/l IBA (Mauseth và Halperin, 1975).
1.1.3.2. Vết thương phụ
Ngoài những vết thương bắt buộc phải có khi tách mẫu ra khỏi cây ban ñầu
ñem vào nuôi cấy, những vết thương tạo thêm nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc
của mẫu cấy và khả năng tái sinh mẫu ñược gọi là vết thương phụ.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h

a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp

Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
8

8

Sự tái sinh thường xảy ra ngay tại ñiểm tạo vết thương. Park và Son (1988)
cho rằng sự tái sinh các cơ quan bất ñịnh chỉ xảy ra ở vùng ngoại vi hay rìa vết
thương của các lá cây Populus nigra và P. maximowiczii. Tuy nhiên, khi các mẫu
lá bị ñâm thủng trên bề mặt (khoảng 5 lỗ) thì sự tái sinh có thể quan sát ñược
ngay trên cả mép các vết thương mới tạo. Các nhà khoa học cho rằng sự làm tổn
thương mẫu cấy ñã kích thích sự di chuyển của hormone nội sinh tới vết thương,
hoặc làm hàm lượng hormone ở chính các vị trí ñó dồi dào hơn hoặc tiết bớt một
phần hormone ra môi trường nuôi cấy, tạo nên tỷ lệ cân bằng chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật trong mẫu cấy do ñó làm thúc ñẩy quá trình tái sinh. Giả thuyết
này trùng hợp với kết quả mà Norizaku và cộng sự (1985) ñã nghiên cứu trên
Torenia fournieri, sự hấp thụ của BA qua các vết thương của mẫu cấy không hề
tăng nhưng lượng chồi bất ñịnh hình thành lại tăng ñáng kể.
1.1.4. Tác ñộng của kiểu di truyền tới sự tái sinh cơ quan
Sự phát triển của các mô hay cơ quan trong nuôi cấy và sự tái sinh in vitro
bị tác ñộng rất nhiều bởi kiểu di truyền. Có nhiều kết quả thu ñược trong quá
trình nuôi cấy mô chứng tỏ sự tái sinh khác nhau giữa các giống cùng loài. Các
gene trong nhân ñược coi là liên quan trực tiếp tới quá trình tái sinh thể hiện ở
khả năng tương tác của chúng (Keyes và Bingham, 1974), trạng thái lặn
(Frankenberger và cộng sự, 1981) miên trạng, miên trạng một phần (Reisch và
Bingham, 1980) hay tính cộng hợp (Buiatti và cộng sự, 1974).
Nhiều công bố cho rằng có sự tương tác giữa kiểu gene của cây trồng và
môi trường nuôi cấy. Thứ A có thể trải qua sự tái sinh và cảm ứng với môi trường
chứa loại chất ñiều hòa nào ñó trong khi thứ B thì không có biểu hiện nào trong
môi trường nuôi cấy cho ñến khi cấy chuyền nó sang môi trường chứa chất ñiều

hòa khác. Nhiều biến ñổi hình thái của cây trồng chỉ phát sinh trong những ñiều
kiện môi trường ñặc hiệu. Chính vì tính ñặc trưng của hệ gene mà môi trường
nuôi cấy thường khác nhau từ các chi hay loài thậm chí các thứ trong cùng một
họ. Không có môi trường nào chuyên biệt cho cây trồng nào mà phải qua hàng
loạt các nghiên cứu thử nghiệm ñể xác ñịnh môi trường tốt nhất cho cây trồng ñó.
Nếu như sự tương tác giữa môi trường – kiểu gene là tính ñặc hiệu duy nhất
của hệ gene, thì chúng ta có thể nuôi cấy tất cả các cây trong cùng khu sản xuất,
có ñặc ñiểm y như nhau với kết quả thu ñược là như nhau. Tuy nhiên, sự biểu
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w

.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
9

9

hiện khác nhau của cây trồng thông qua quá trình nuôi cấy in vitro như sự hình

thành và phát triển của mô sẹo, sự tái sinh cơ quan ñều chịu sự ñiều khiển của hệ
gene, kèm theo những tác nhân thứ yếu khác ngoài môi trường nuôi cấy. Ví dụ
như ở cây Medicago, các cây mới thu ñược từ nuôi cấy phôi soma nhiều hơn là từ
quá trình tái sinh chồi, bất kể thành phần của môi trường nuôi cấy (Brown và
Atanassov, 1985). Tương tự ở cây Lúa mì, chỉ có một số giống cho kết quả khi
nuôi cấy trên các môi trường khác nhau trong khi thu ñược kết quả không ñáng
kể khi nuôi cấy các giống khác trên môi trường tương tự (Lazar và cộng sự,
1983).
1.1.2. Các ảnh hưởng tới sự tái sinh cơ quan
1.1.2.1. Tuổi của mẫu cấy
Nhìn chung, các mẫu cấy lấy từ các cơ quan mới ñược hình thành (mẫu cấy
non) có khả năng phát triển và phát sinh cơ quan in vitro tốt hơn mẫu cấy già.
Trong các thí nghiệm của Takayama và Misawa (1982), hầu hết các mẫu
cấy có nguồn gốc từ các cây trưởng thành ñều chết. Pierick (1969) nhận ra rằng
khuynh hướng tạo rễ của mẫu cấy thân cây Rhododendron giảm với tuổi của
chồi, cảm ứng rễ qua cấy chuyền và quá trình tạo rễ là chắc chắn với các mẫu cấy
thân non.
Tuy nhiên, các mô non không phải lúc nào cũng tái sinh cao. Mô sẹo hình
thành trên tất cả các dạng mẫu cấy từ cây trưởng thành Parthenium
hysterophorus hơn là các hạt và các lá mầm (Wickham và cộng sự, 1980). Tương
tự, sự hình thành và phát triển của mô sẹo diễn ra nhanh trên các mẫu cấy của
Solanum laciniatum trưởng thành khi lá của nó ñã mở rộng hoàn toàn.
1.2.2. 2. Loại mẫu cấy
Chọn ñúng mẫu cấy là công ñoạn rất quan trọng khi nhân giống dựa trên
nền tảng tái sinh cơ quan (trực tiếp hay gián tiếp). Trong vài trường hợp, ñể sử
dụng tái sinh ñạt ñược hiệu quả cao, phải tiến hành chọn loại mẫu cấy có khả
năng tái sinh cao nhất, như ở Brassica carinata, 86% mẫu cấy lá mầm tạo chồi,
74% mẫu từ thân mầm tạo chồi, và chỉ có 26% tạo ở rễ (Jaiswal và cộng sự,
1987). Rõ ràng mẫu cấy lá thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi bất ñịnh.
1.2.2.3. Kích thước và vị trí mẫu cấy

Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r

a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
10

10

Kích thước của mẫu cấy có ảnh hưởng trực tiếp ñến phản ứng của mô với
môi trường nuôi cấy. Các kích thước nhỏ khó tái sinh hơn mẫu có kích thước lớn
do mẫu lớn có nguồn dinh dưỡng dự trữ dồi dào hơn và kích thích tố ñể duy trì sự
nuôi cấy. Tuy nhiên, kích thước mẫu cấy cũng có tương tác với nhiều nhân tố
khác như tuổi mẫu cấy. Trong quá trình nuôi cấy mô Cumcumis melo thì tỷ lệ
chồi bất ñịnh thu ñược cao khi nuôi cấy những lá nhỏ (0,3 – 0,5 mm) và non (14
ngày) hơn các lá có cùng kích thước nhưng già (21, 28, 35 ngày), hay từ các lá có
kích thước lớn (0,6 – 0,9 mm hay 1,0 – 1,2 mm) ở bất cứ ñộ tuổi nào (Kahal và
cộng sự, 1988).

Theo nguyên tắc, các mẫu cấy thu ñược trên cùng một cơ quan thực vật thì
có khả năng tái sinh như nhau. Tuy nhiên, các cơ quan này lại ñược cấu tạo bởi
nhiều mô khác nhau và có ñộ tuổi khác nhau nên sẽ dẫn tới mức ñộ tái sinh khác
nhau của mẫu cấy. Mặt khác các mẫu có cùng tuổi, cùng vị trí nhưng nhận ñược
ánh sáng ở các mức ñộ khác nhau cũng cảm ứng khác nhau với cùng một tác
nhân cảm ứng tái sinh.
1.2.2.4. Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn ñến quá trình tái sinh. ðối với nuôi
cấy mô sẹo, khoảng thời gian ñược nuôi trong môi trường ảnh hưởng tới khuynh
hướng phát sinh hình thái của chúng. Thường có một khoảng thời gian ngắn mà
trong suốt thời gian ñó, sự tái sinh là mạnh nhất (Reinert và Backs, 1968).
Vài mô sẹo vẫn còn giữ khả năng tái sinh chồi trong khoảng thời gian dài.
Stimart và cộng sự (1980) thu nhận chồi tái sinh từ mô sẹo của Lilium nuôi cấy
trên môi trường trong vòng 3 năm. Mô sẹo của Solanum nigrum (Mandal và
Gadgil, 1979) và Lavendula angustifolia (Webb và cộng sự, 1984) vẫn còn khả
năng phát sinh hình thái trong ít nhất là 2 năm, mô sẹo của Ngô và Yến mạch có
thể lưu trữ ñược tính năng này trong vòng 18 tháng (Rice và cộng sự, 1979). Tuy
nhiên, thời gian nuôi cấy quá lâu hay là cấy chuyền quá thường xuyên thì khả
năng tái sinh thường giảm. Lý do cho khả năng mất tính tái sinh này vẫn còn
chưa ñược xác ñịnh rõ và khác nhau tùy trường hợp.
1.2.2.5. Mật ñộ nuôi cấy
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a

n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
11

11

Mật ñộ nuôi cấy tối thiểu ñể tạo ra các tế bào hay mô phát triển in vitro ñã
từng ñược ñề cập trước ñây. Bên cạnh sự ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, mật
ñộ nuôi cấy cũng ñược cho rằng ảnh hưởng ñặc biệt tới sự phân hóa tế bào, sự tái
sinh hay sự nhân chồi.
Khi nuôi cấy huyền phù tế bào Cà rốt, cả số lượng phôi soma hình thành và
cả trạng thái phát triển tế bào khi ở giai ñoạn phôi ñược coi là phụ thuộc vào số
lượng tế bào khi bắt ñầu nuôi cấy. Khi tiến hành làm loãng dịch nuôi cấy thì kết
quả là sự gia tăng các tế bào vô ñịnh hình. Không chỉ thể hiện ở số lượng phôi
hình thành ít hơn mà những phôi hình thành có kích thước nhỏ hơn và sinh
trưởng chậm hơn (Halperin, 1967). Hari (1980) chỉ ra rằng những tế bào không
thể hình thành dạng phôi hoàn chỉnh ở tại mật ñộ nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp.
ðiều này càng khẳng ñịnh bằng nhiều nghiên cứu khác ở Cà rốt, khi mật ñộ nuôi
cấy các tế bào quá thấp (nhỏ hơn 10
4
tế bào/ml môi trường) dẫn tới sự chết của tế
bào mặc dù ñiều kiện môi trường hoàn toàn tối ưu cho quá trình phát triển
(McCabe và cộng sự, 1997).
Ảnh hưởng của mật ñộ mẫu cấy ñược công bố bởi Pierik và Steegmans

(1972). Khi gieo 10 hạt giống của cây Lan Cattleya vào trong bình tam giác chứa
môi trường lỏng, hình thành protocorm và cây con, nhưng không có protocorm
nào ñược sinh ra khi chỉ gieo hai mẫu vào trong một bình. Tương tự, các chồi bên
của cây Măng tây trên môi trường MS tạo nhiều chồi và rễ hơn khi số lượng chồi
ban ñầu ñưa vào binh nuôi nhiều. Ảnh hưởng này ñược cho là một loại chất nào
ñó khuếch tán vào trong môi trường từ mẫu cấy, bởi quá trình sinh trưởng có thể
ñược kích thích theo cùng một kiểu ở mật ñộ nuôi cấy thấp hơn bằng cách bổ
sung auxin và cytokinin (Matsubara và Clore, 1974).
1.2.2.6. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
 Auxin
Auxin ñược tổng hợp chủ yếu ở ñỉnh sinh trưởng ngọn, từ ñó vận chuyển
ñến các cơ quan khác nhau theo hướng gốc. Ngoài ñỉnh sinh trưởng ngọn, auxin
còn ñược tổng hợp một phần ở các cơ quan còn non như lá non, chồi non, quả
non.
Trong cây auxin tồn tại ở hai dạng là: dạng tự do và dạng liên kết.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i

e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h

a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp

Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
12

12

• Auxin ở dạng tự do: là dạng có hoạt tính sinh học. Chúng tồn tại ở ñỉnh
sinh trưởng ngọn, sau ñó rồi ñến chồi bên, ñầu rễ và cơ quan non. Càng xa ñỉnh
sinh trưởng nồng ñộ auxin tự do càng giảm dần. Dạng auxin tự do chủ yếu trong
cây là IAA. Auxin tự do trong cây chiếm một tỷ lệ rất thấp. Nhiều tài liệu ñã
công bố hàm lượng auxin tự do trong cây chiếm khoảng 5% auxin tổng số.
• Auxin dạng liên kết: là dạng auxin chủ yếu trong cây. Hàm lượng của
dạng liên kết này có thể chiếm trên 90% lượng auxin có trong cây. IAA có thể
liên kết với rất nhiều các hợp chất khác nhau nên chúng không có hoạt tính sinh
học hoặc có hoạt tính sinh học rất thấp. Tuy nhiên, chức năng của auxin liên kết
trong cây hết sức quan trọng. Chúng là nguồn dự trữ auxin trong cây và cũng là
dạng auxin vận chuyển chủ yếu trong cây. Vì vậy, sự biến ñổi thuận nghịch của
IAA tự do và IAA liên kết dưới tác nhân kích thích của môi trường góp phần ñiều
chỉnh sự cân bằng auxin trong cây và do ñó ñiều chỉnh quá trình sinh trưởng của
cây.
Auxin ñược tổng hợp trong ñỉnh ngọn và từ ñó vận chuyển xuống các cơ
quan phía dưới. Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính phân cực rõ rệt, theo
hướng gốc, tức là từ ngọn xuống rễ mà không vận chuyển ngược lại.
Trong cây nguyên vẹn, auxin liên quan ñến sự phân chia tế bào, sự hình
thành mô sẹo (trong suốt quá trình mẫu bị tổn thương và cảm ứng vết thương), và
sự hình thành rễ bất ñịnh. Ngoài IAA là auxin tự nhiên phổ biến nhất, những
auxin tổng hợp cũng ñược sử dụng phổ biến như IBA, NAA, 2,4-D.
IAA là loại auxin không ổn ñịnh nhất trong các auxin, nó dễ dàng bị phân
hủy bởi ánh sáng và bị oxy hóa. Tính không ổn ñịnh này làm IAA không ñược sử
dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. 2,4-D là auxin có hoạt tính khá mạnh và

nồng ñộ cao có thể gây ñộc.
Bất cứ auxin nào cũng có thể ñược dùng nhưng cũng thường gặp các ñột
biến phát sinh, ví dụ 2,4-D thường liên quan tới các ñột biến kiểu gene và mất
khả năng tái tạo rễ.
 Cytokinin
Rễ là cơ quan tổng hợp cytokinin. Từ rễ cytokinin ñược vận chuyển lên các
bộ phận trên mặt ñất. Cytokinin ñược tổng hợp mạnh nhất ở giai ñoạn cây con.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.

d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e

w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
13

13

Cytokinin phân bố nhiều ở những nơi có hoạt ñộng trao ñổi chất và sinh trưởng
mạnh, chồi non càng nhiều thì hàm lượng cytokinin càng cao.

Cytokinin tồn tại ở trong cây dưới dạng tự do có hoạt tính sinh học và dạng
liên kết không có hoạt tính sinh học hoặc hoạt tính yếu.
Hiệu quả sinh lý của cytokinin: giãn nở của tế bào, sự phân hóa chồi, sự
hóa trẻ.
Trong cơ thể thực vật thì cytokinin liên quan ñến sự phát triển các búp chồi
và sự phát triển, trưởng thành của lục lạp. Các cytokinin tự nhiên dùng trong nuôi
cấy mô có thể kể ñến là Zeatin, 2-iP. TDZ là một cytokinin tổng hợp ñược dùng
xuyên suốt trong quá trình nuôi cấy mô.
Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin thường ảnh hưởng trực tiếp ñến quá trình
phát sinh cơ quan:
 Auxin : cytokinin > 1 kích thích tạo rễ
 Auxin : cytokinin < 1 kích thích tạo chồi
 Auxin : cytokinin = 1 kích thích tạo mô sẹo
1.2.2.7. Sự phân cực
Tính phân cực phụ thuộc vào khả năng trao ñổi ion H
+
và K
+
của tế bào tại
màng plasma. Auxin tạo ra dòng chảy của H
+
từ trong tế bào ra bên ngoài tế bào
và ñồng thời duy trì một ñiện thế trong các mô (dương ở phía ngọn, âm ở phía
gốc lá), duy trì và củng cố dòng vận chuyển auxin (Raven, 1979). Khi tách các
mô chồi và rễ thì tính có cực này bị khử, nhưng trong quá trình nuôi cấy thì tính
có cực của tế bào ñược khôi phục lại, thường là khoảng 4 – 6 giờ ở rễ và 12 – 16
giờ ở trụ trên lá mầm cây ñậu (Hanson và Trewavas, 1982).
 Gradient tái sinh
Thường thấy khi cắt một cơ quan hoàn chỉnh thành nhiều phần thì các ñoạn
cắt này thể hiện khả năng tái sinh theo chiều hướng khác nhau. Tùy theo sự hình

thành nhiều ít các bộ phận bất ñịnh mới mà ta có thể xác ñịnh ñược gradient tái
sinh của mẫu. Liu và Burger (1986) quan sát sự tái sinh chồi của hoa Lilium
longiflorum thì thấy sự hình thành của một gradient tái sinh. Mẫu cấy thu từ phần
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
14

14

gần nhất của ñế hoa tạo chồi với số lượng lớn nhất (gấp 5 lần so với các ñoạn cắt
gần nó), ñặc biệt nếu nó ñược ñặt úp trên môi trường nuôi cấy.
 Tính có cực của mẫu cấy
Cách ñặt mẫu ñóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình tái sinh. ðoạn
cắt mẫu lá của Gastaria và Haworthia tạo nhiều phôi soma hơn khi ñặt thẳng
ñứng (vuông góc) với môi trường nuôi cấy (Beyl và Sharma, 1983). Trong khi

mẫu lá non từ giống Dâu tây ‘Redcoat’ lại có khả năng sinh ra nhiều chồi bất
ñịnh hơn khi mặt bụng (so với mặt lưng) của mẫu cấy lá tiếp xúc với môi trường
nuôi cấy (Nerha và cộng sự, 1988), những kết quả tương tự thu ñược với mẫu cấy
lá của Malus domestica và Malus pumila. Welander (1988) lý giải ñiều này, bên
cạnh tính có cực, trong các nghiên cứu này thì dường như bề mặt trên của lá phản
ứng tốt nhất với môi trường dinh dưỡng khi chứa những tế bào không ngừng lớn
lên và phân chia.
 Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và sự vận chuyển có cực
Sự phân cực tái sinh một phần cũng do sự di chuyển của các chất ñiều hòa
sinh trưởng có trong mẫu cấy, ñặc biệt là sự di chuyển hữu cực (ví dụ như từ ñỉnh
chồi ñi xuống các phần dưới) của IAA. Kiểu di chuyển có cực này không rõ ràng
ở những mẫu cấy nhỏ, ñiều này phần nào giải thích ñược tạo sao các mẫu cấy có
kích thước nhỏ thì sự tái sinh phân cực không ñược quan sát (Thakur và
Ganapathi, 1978). Sự bổ sung auxin và cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể
tăng cường tính phân cực của mẫu cấy, kích thích tái sinh hoặc dẫn tới sự biến
mất hay ñảo ngược xu hướng phân cực.
Sự ñảo ngược và biến mất của quá trình phân cực khi có mặt các chất ñiều
hòa sinh trưởng thực vật ñược ñưa ra bởi nghiên cứu của Margara (1969) trên cây
Súp lơ, Nho và Thu Hải ðường. Trên môi trường không có chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật, cuống lá cây Súp lơ tạo ra chồi và rễ ở vùng gần ñiểm cắt, nhưng
tính có cực này bị phân hủy khi bổ sung 1,9 mg/l NAA vào môi trường, khi ñó
trên bề mặt mẫu cấy ñều hình thành các rễ bất ñịnh. Trái lại, khi thêm vào môi
trường nuôi cấy 2,3 mg/l BA thì tất cả các mẫu cấy ñều phát sinh chồi. Sự hình
thành chồi ở cuống hoa Nho cũng ñược quan sát khi nuôi cấy trên môi trường có
nồng ñộ thấp auxin và cytokinin, nhưng hiện tượng này không ñược rõ ràng khi
nồng ñộ các chất ñiều hòa sinh trưởng tăng (Margara và Leydecker, 1969). Nuôi
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
15

15

cấy không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, mẫu lá Begonia rex tái sinh rễ
bất ñịnh ngay ở cuối ñường gân lá dài nhất, nhưng khi có mặt 5 mg/l Kinetin thì
quá trình tái sinh cơ quan không diễn ra (Schraudolf và Reinert, 1959).
Sự tương tác giữa chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và tính có cực tự nhiên
của mẫu cấy rất phức tạp. Trong các nghiên cứu của Bigot và cộng sự (1977), các
mẫu cấy từ trụ dưới lá mầm cây Cà chua có xu hướng tạo thành lượng lớn chồi
hơn khi chúng ñược lấy càng gần phần rễ. Vùng trụ dưới lá mầm thể hiện khả
năng tái sinh cao nhất, khác nhau tùy thuộc giống cây và loại chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật có trong môi trường nuôi cấy.
Trong nhân giống in vitro thực vật phương pháp lớp mỏng tế bào là một
trong những phương pháp quan trọng góp phần nâng cao năng suất, chất lượng
mùa màng, khi ñược sử dụng kết hợp với các kỹ thuật khác. Bởi vì kĩ thuật này
cho phép nhân giống một số lượng lớn một số loài hoa bằng cách tác ñộng lên

một số mô hay tế bào chuyên biệt, hoặc tạo ra một cơ quan ñặc biệt trong nuôi
cấy in vitro.
2.1. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (THIN CELL LAYER)
2.1.1. ðịnh nghĩa của hệ thống thin cell layer (TCL)
Thực vật có những ñặc ñiểm nổi bật là có thể tái chương trình biệt hóa sự
phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới
(mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trường
hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành
mà không cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính sự phát triển bên trong
thực vật ñược kiểm soát về không gian và thời gian trong một mạng lưới các ñơn
vị khác nhau: cơ quan, mô, tế bào. Nếu như có sự thay ñổi trong mạng lưới này
thì sự ức chế ở mức cá thể có thể xảy ra. Khái niệm về phương pháp TLC là cô
lập tế bào từ mạng lưới ức chế và tái chương trình chúng bằng nuôi cấy in vitro
(Nhựt và cộng sự, 2003).
Hệ thống TLC bao gồm các mẫu mô có kích thước nhỏ ñược thu nhận từ
các cơ quan khác nhau của thực vật (thân, rễ, lá, cụm hoa, chồi hoa, các cơ quan
của hoa, lá, mầm, mô phân sinh, ñỉnh sinh trưởng hoặc phôi).
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X

C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o

m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
16

16

Khi thu nhận theo chiều dọc của mẫu là lTCL (longitudial TCL), khi thu
nhận theo chiều ngang mẫu gọi là tTCL (transverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm
x 0,5 mm hay 10 mm) bao gồm chỉ một dạng mô như một lớp ñơn các tế bào biểu
bì (có thể ñược bóc khỏi cơ quan) hoặc là vài lớp (3 – 6) tế bào biểu bì, trong khi
các mẫu tTCL (0,2 – 0,5 mm hay dày vài mm) bao gồm một số lượng nhỏ các tế
bào thuộc các dạng mô khác nhau như: biểu bì, vùng thượng tầng, bó gỗ, bó mộc
và các tế bào nhu mô (Tran Thanh Van và Gendy, 1996). Ngoài ra, còn có hệ
thống TCL chỉ dày vài micromete phải dùng máy vi phẫu ñể cắt (Lee-
Stedlemamn và cộng sự, 1989) nhưng với kích thước này mẫu dễ bị nhiễm khuẩn
hoặc chết.
2.1.2. ðặc trưng của hệ thống
ðặc trưng của lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩa là một mẫu cấy có
càng ít tế bào càng tốt. ðặc ñiểm mỏng này là một trong những ñiều quan trọng
các phân tử ñánh dấu (mazrkers) của quá trình biệt hóa có thể ñịnh vị in situ
trong các tế bào mục tiêu hay trong tế bào cảm ứng. Quá trình ñịnh vị này cho
phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Tran Thanh Van, 2003).
Trong quá trình cắt mẫu làm mô thực vật bị thương, nhiều enzyme hay
polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển
của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaffschiew, 1990). Lý do cơ bản ứng dụng
một vài tế bào trong hệ thống TCL là vì chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế
bào bị thương (nơi xảy ra sinh tổng hợp cấu tạo vách tế bào và là nơi phóng thích
oligosaccharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác của môi trường

“kiểm soát” sự phát sinh hình thái.
Một hệ thống ña bào như hệ thống TCL mang sự tổ chức không gian/thời
gian của cơ thể ban ñầu. Khác với khi sử dụng một tế bào ñơn hay thậm chí tế
bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào với
tổ chức không gian/thời gian khác biệt với tổ chức trước khi tiến hành quá trình
tách ra từ mô hay cơ quan cho (Tran Thanh Van, 1973).
Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa
rất quan trọng ñến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ
quan. Các chương trình biệt hóa có thể thay ñổi từ việc biến ñổi mối tương quan
giữa cơ quan/mô nuôi cấy với kích thước khác nhau khi nuôi cấy trên môi trường
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w

w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
17

17

có cùng tính chất. Lớp cắt dọc 0,5 x 1 x 10 mm ñược dùng phổ biến và các dạng
phát sinh hình thái mong muốn có thể tạo ñược qua việc ñiều khiển mức ñộ tác
ñộng của các nhân tố ngoại sinh.
Bên cạnh ñó, khoảng thời gian của quá trình phát sinh hình thái xuất hiện
tương ñối ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy), với tần số cao (gần
100% mẫu có phản ứng). Tỷ số giữa số lượng tế bào ñáp ứng với tổng số tế bào
hiện diện trên mẫu TCL cao. Ví dụ như trêm một mẫu lTCL của Nicotiana
tobacum (1 mm x 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì, thu nhận từ cánh
hoa), các cơ quan sau ñược biệt hóa trực tiếp trên bề mặt của TCL (mà không trải
qua quá trình mô sẹo trung gian):
− 50 hoa trong chương trình tạo hoa.
− 500 – 700 chồi trong chương trình tạo chồi.
− 15 – 20 rễ trong chương trình tạo rễ.
2.1.3. Ưu ñiểm và những triển vọng của phương pháp TCL
− Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thụ
các chất dinh dưỡng từ môi trường.
− Dễ ñịnh vị vùng cho phản ứng do chỉ có một lớp mỏng tế bào.
− Lượng phytohormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất ñiều hòa
sinh trưởng thực vật dễ tác ñộng lên mẫu.
− Mẫu nuôi cấy ñồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng.
− Tần số phát sinh các cơ quan, việc hình thành phôi thấp.
− Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến ñổi.
− Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan với toàn bộ cơ thể thực vật.
− Nhanh chóng ñạt kết quả trong thời gian ngắn.
Các tính chất khác mong muốn có ñược trong phương pháp nuôi cấy lớp
mỏng tế bào: sự ñồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương pháp
lớp mỏng tế bào cho mọi thực vật.
Click to buy NOW!
P

D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c

k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o

c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
18

18

TCL cho phép tái sinh thành một cơ quan chuyên biệt dưới một số ñiều
kiện như:
− Môi trường ñược kiểm soát chặt.
− Chất ñiều hòa tăng trưởng ngoại sinh ñược ñưa vào trong môi trường
nuôi cấy.
− Bổ sung các chất khác vào môi trường.
Hệ thống TCL là một hệ thống ñơn giản, một mô hình tốt ñể nghiên cứu
lãnh vực cơ bản hay nghiên cứu vào chuyển gene và tái sinh. TCL ñược sử dụng
ñển nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo phôi, tạo cơ quan ở một số lượng lớn các
loài thực vật. TCL còn là một phương pháp hiệu quả ñể nhân giống một số lượng
lớn thực vật hoặc cơ quan với những tính trạng mong muốn, quy mô rộng, hiệu

quả kinh tế cao. ðây còn là hệ thống có thể làm thay ñổi ñặc tính khó tái sinh in
vitro ñối với cây rừng, cây thân gỗ, cây một lá mầm.
Tuy nhiên, ñiều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu
TCL phụ thuộc vào loài và ñòi hỏi phải thử nghiệm lại tất cả các ñiều kiện, hệ
thống nuôi cấy in vitro gồm các chất ñiều hòa sinh trưởng, chất dinh dưỡng, ánh
sáng, sự thẩm thấu, nhiệt ñộ (Tran Thanh Van, 1980).
2.1.4. Các hệ thống TCL mẫu
Phương pháp TCL ñã ñược ứng dụng ñầu tiên trong nghiên cứu về sự phát
sinh hình thái sự biệt hóa cơ quan và sự phát triển một cách rất sâu sắc trên ba ñối
tượng: Thuốc lá (Nicotiana tobacum), Lily (Lilium longiflorum), Cúc
(Dendrathema grandiflora). ðây cũng là ba loài thực vật ñược xem như là thực
vật mô hình cho hệ thống TCL.
 Cây thuốc lá
Từ khi xuất hiện các thuật ngữ và khái niệm hệ thống TCL thì tất cả các
nghiên cứu chủ yếu ñược thực hiện trên ñối tượng mẫu này (Tran Thanh Van,
1973). Bốn chương trình phát sinh hình thái: thành lập hoa trực tiếp, thành lập
chồi trực tiếp, thành lập rễ trực tiếp và mô sẹo không phát sinh cơ quan ñược cảm
ứng từ mẫu lTCL thu ở nhánh hoa cây thuốc lá, sau ñó nuôi cấy trên môi trường
rắn MS có bổ sung các nồng ñộ glucose, sucrose và chất ñiều hòa sinh trưởng
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
19

19

khác nhau trong ñiều kiện chiếu sáng liên tục ở 3240 lux, 24 – 27
0
C, ñộ ẩm 50%
(Tran Thanh Van, 1980, 1981, Tran Thanh Van và Trinh, 1996). Trạng thái hoa
có thể thay ñổi sang trạng thái sinh dưỡng bằng cách bổ sung vào môi trường
oligosaccharide (thành phần của vách tế bào), oligosaccharide phóng thích các
chất ñiều sinh trưởng trong nghiên cứu hệ thống TCL (Tran Thanh Van và cộng
sự, 1985) hoặc từ sự thay ñổi pH có thể hoạt hóa như dấu hiệu phân tử.
Như vậy, ngoài việc tất cả các cơ quan và mô sẹo phát sinh từ lớp biểu bì
còn có yếu tố khác kiểm soát sự phát sinh hình thái từ hệ thống TCL có thể thực
hiện là ñiều khiển ánh sáng, nồng ñộ ñường, oligosaccharide, thành phần ion
trong môi trường nuôi cấy và ñộ pH (Cousson và Tran Thanh Van, 1992).
 Cây hoa Lily
Lily là một trong những loài hoa cắt cành ñẹp có giá trị và ñang nhanh
chóng trở thành loài hoa xuất khẩu quan trọng. Tuy nhiên phương pháp nhân
giống vô tính Lily bằng vảy củ, cũng như hệ thống vi nhân giống không mang lại
hiệu quả cao. ðiều này ñã thúc ñẩy mạnh các nghiên cứu sau về hệ thống TCL
trên cây hoa Lily như một công cụ và giải pháp nhằm khắc phục các nhược ñiểm.
Chính tính sâu sắc của nghiên cứu này cùng với sự thành công trong tất cả các
chương trình phát sinh hình thái trên cây hoa Lily, chúng ñã ñược sử dụng như

một hệ thống mẫu.
 Cây hoa Cúc
Hệ thống TCL cũng ñược sử dụng trong các nghiên cứu về ảnh hưởng của
nhiều thành phần bổ sung vào môi trường như nguồn carbon, chất kháng sinh,
chất ñiều hòa sinh trưởng, các ñiều kiện ảnh hưởng ñến khả năng tái sinh và phát
sinh hình thái trên cây hoa Cúc. Sự tái sinh rễ, chồi và phôi soma ñã ñạt ñược khi
nuôi cấy các tTCL của ñốt thân cây hoa Cúc trên các môi trường khác nhau
(Teixeira da Silva và Fukai, 2003).



3.1. Tổng quan về ñối tượng nghiên cứu
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e

r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
20

20

3.1.1. Cây hoa Thu Hải ðường
Nhóm Begonia là một trong các nhóm lớn nhất trong các loại cây cảnh. Có
rất nhiều loài ñược phát hiện, có vô số các loài cây lai khác nhau. Cây Thu Hải
ðường ñầu tiên ñược ñưa vào nước Anh năm 1777. Từ ñó ñến nay, ñã có rất
nhiều giống Thu Hải ðường mới ñược tạo ra với vô số màu sắc rực rỡ ở hoa và
lá.
Sự phân bố của cây Thu Hải ðường có tính chất khu vực. Thu Hải ðường
ñược phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới như ở vùng Trung và
Nam Mĩ, Châu Á và Châu Phi. Nó ñược trồng trong vườn, trong chậu trong giỏ
treo có dáng lá và hoa ñẹp.
Trong tự nhiên, cây Thu Hải ðường thích hợp với loại ñất có tính acid nhẹ
ẩm, có bóng râm, ở sườn ñồi, nói chung là nơi có khả năng thoát nước cao và có
ñộ ẩm lớn. ðộ pH của ñất từ 5,5 – 6,5.
Hiện nay người ta tạm chia Begonia thành các nhóm nhỏ sau: Rex begonia,
Cane begonia, Semperfloens bengonia, Tuberous begonia, Trailing begonia và
Thick-stemmed begonia.
3.1.1.1. Vị trí phân loại
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Bộ : Cucurbitaless
Họ : Begoniaceace
Chi : Begonia
Loài : Begonia spp.
3.1.1.2. ðặc ñiểm hình dạng của cây Thu Hải ðường
Cây hoa Thu Hải ðường thuộc cây thảo mọng nước. Thường màu hồng, lá
có phiến lá lệch rất rõ ở gốc, cụm hoa sim hai ngả, cuống dài.

Hoa ñơn tính, không ñều, cùng gốc. Hoa ñực có 2 – 5 lá ñài bé và hai tràng
lớn xếp chéo chữ thập; nhị nhiều, rời hoặc hơi hợp thành ống. Bộ nhụy thường
gồm ba lá, noãn hợp thành bầu hạ một ô; vòi rời, ñỉnh vòi thường chẻ ñôi. Quả
nang có ba cánh thường phát triển lệch.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c

u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r

w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
21

21

3.1.1.3. Giá trị kinh tế của cây hoa Thu Hải ðường
Rất nhiều loài Thu Hải ðường ñược trồng làm cảnh vì có lá và hoa rất ñẹp
với nhiều màu sắc sặc sỡ như: ñỏ, trắng, vàng, cam, hồng… Ở nước ta có 45 loài
cây mọc tự nhiên và nhập nội ñược phân bố cả ba miền.
Ngoài ra, loài hoa này còn là nguồn thực phẩm và dược phẩm: trong loài

cây này có hàm lượng fructose cao nên ñược sử dụng như nguồn gia vị ở
Philippines và Brazil. Ở Trung Quốc, Indônêxia, Brazil, lá Thu Hải ðường ñược
dùng như rau ăn tươi. Một số giống Thu Hải ðường có tác dụng như là một
nguồn dược liệu tự nhiên dùng thanh nhiệt, giải ñộc, trị ho ra máu, giảm ñau,
chữa tê bại, di chứng sau bệnh viêm màng não, thuốc xổ, thuốc mê, chống ung
thư.
3.1.1.4. Một số nghiên cứu in vitro trên cây hoa Thu Hải ðường
Các phần khác nhau của cây như lá, cuống lá, thân hay cụm hoa ñược sử
dụng trong vi nhân giống trong ñó các phiến lá ñược xem là nguồn mẫu thích hợp
nhất bởi vì chúng có thể tái sinh ñược nhiều chồi giúp nhân giống số lượng lớn.
Môi trường MS ñược chọn là môi trường thích hợp nhất và phổ biến ñể nuôi cấy
mô Begonia. Welander (1977) ñã nhân giống từ mẫu cấy là chồi ñỉnh trên môi
trường Welander (1974) có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA.
Hakkaart và Versluijs (1984) ñã giới thiệu việc nuôi cấy chồi ñỉnh của
giống Elatior begonia giúp hạn chế sự nhiễm khuẩn, Elatior begonia có giai ñoạn
ngủ ngắn vào mùa xuân và mùa hè hơn so với giai ñoạn mùa ñông. Mặc dù
những cây mẹ ñã nhiễm bệnh nặng nhưng khi nuôi cấy chồi ñỉnh với kích thước
0,15 mm thì có thể tạo ñược các cây con in vitro sạch bệnh trên môi trường nuôi
cấy trong 6 – 12 tháng.
Reuter (1980) ñã thu ñược cây con từ mẫu lá có kích thước 5 x 5 mm trên
môi trường MS có bổ sung cytokinin và IBA.
Bigot (1981) ñã thu ñược kết quả tốt khi nuôi cấy mẫu lá (7 mm) trên môi
trường khoáng MS có bổ sung vitamin, 0,54 – 2,2 mg/l NAA, 4,9 – 14,7 mg/l 2-
iP, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar.
Takayama và Misawa (1981) ñã thu ñược cây con khi nuôi cấy mẫu lá trên
môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose. Peck và Cumming (1984) ñã nhận thấy
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u

-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
22

22

thời gian cần thiết ñể chuyển mẫu từ nuôi cấy in vitro sang môi trường ex vitro là
5 tháng.
Iida và cộng sự (1986) ñã tạo ra các chồi từ mẫu cấy lá trong vòng 70 ngày
trong môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l NAA các chồi này ñều ra
rễ tốt khi chuyển sang môi trường ra rễ 1/2MS có bổ sung 1 mg/l NAA và sau 30
ngày có thể chuyển chúng ra môi trường ñất.
Nakano và cộng sự (1999) ñã thu ñược chồi bất ñịnh dài khoảng 10 mm,
với tỷ lệ là 8 – 9 chồi trên một mẫu cấy từ mẫu cấy lá của Begonia tuberous nuôi
cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. Có thể nhân
nhanh chồi một cách hiệu quả bằng phương pháp nuôi cấy lắc trên môi trường
tạo chồi có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. Các chồi ra rễ trên môi trường
1/2MS có 0,1 mg/l NAA và 8 g/l agar có thể tạo cây hoàn chỉnh.
Mẫu cấy có nguồn gốc từ cuống lá cũng ñược xem là nguồn vật liệu tốt

tương ñương với mẫu có nguồn gốc từ lá (Bigot, 1981).
Mikkelsen và Sink (1978) ñã nuôi cấy cuống lá (5 mm) trên môi trường MS
có bổ sung 0,05 mg/l NAA, 1,8 mg/l BA, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar ñể tái sinh
số lượng lớn các cây trong vòng 16 tuần.
Bigot (1981) ñã nuôi cấy lá (7 mm), cuống lá (10 mm), ñoạn thân (10 mm),
cụm hoa trên môi trường MS có bổ sung từ 0,54 – 2,2 mg/l NAA, 4,9 – 14,7 mg/l
2-iP, 90 g/l sucrose và 8 g/l agar cho thấy rằng mẫu lá và cuống lá có sự tái sinh
tốt nhất.
Imelda (1983) ñã ñạt ñược sự tái sinh chồi tối ưu trên môi trường MS có bổ
sung 0,1 mg/l NAA và 0,2 – 0,4 mg/l 2-iP. Sự kích thích của GA
3
ñối với cây con
ở nồng ñộ 0,1 mg/l mà không cần sự tham gia của cytokinin (BAP và 2-iP) ñược
xem là tốt nhất, sự tạo chồi bất ñình nhiều nhất ở các mẫu cuống lá trên môi
trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA nhưng hạn chế sự sinh trưởng
của chồi. Nếu dùng nồng ñộ BA thấp hơn (0,1 mg/l) thì cho chồi ít hơn nhưng
kích thích sự tăng trưởng của chồi (Simmonds, 1984). ðối với môi trường bán
rắn có nồng ñộ BA thấp (0,1 mg/l) thì cho chồi có kích thước dài hơn so với nồng
ñộ BA cao (0,5 mg/l). Tanimoto và Kagi (1984) ñã nuôi cấy chồi và mẫu cuống
lá của giống Schwabenland Red in vitro trên môi trường MS lỏng có chứa các giá
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n

g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D

F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k

.
c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
23

23

thể khác nhau, các cây con ñược nuôi cấy trên các giá thể vermiculite, sợi
polyester, cát và phenol resin.
Khoder và cộng sự (1981) ñã nuôi cấy ñỉnh thân (stem apices), thân và
cuống nhỏ trên môi trường MS biến ñổi: giảm nồng ñộ NH
4
NO
3
xuống còn 330
mg/l, 0,1 mg/l NAA, 2 mg/l BA và 90 g/l sucrose và ñã thu ñược một số lượng
lớn cây con trong 7 tháng.
Takayama và Misawa (1982) ñã ñề nghị một mô hình nhân sinh khối bằng
kỹ thuật nuôi cấy lắc và bình nuôi cấy. ðể ñạt ñược mục ñích tái sinh chồi một
cách hiệu quả, mẫu cấy ñược cắt từ lá non có ñường kính 3 – 4 cm và cắt thành
từng mẫu có kích thước 7 x 7 mm và sau ñó cấy vào môi trường MS có bổ sung 1
mg/l NAA, 3 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. Có khoảng 150 – 200 chồi
trên một mẫu cây sau 30 ngày nuôi cấy nhưng kích thước của chúng tương ñối
nhỏ vì vậy người ta ñề xuất sử dụng hệ thống nuôi cấy lắc bằng cách ñặt các bình
tam giác có thể tích 300 ml chứa khoảng 30 – 50 ml dung dịch môi trường có bổ
sung 0,1 mg/l NAA và 90 g/l sucrose tiến hành lắc với tốc ñộ 180 vòng/phút dưới

ñiều kiện chiếu sáng liên tục. Bằng phương pháp này, cấy chuyền lặp lại thì có
thể thu ñược từ 10 – 14 chồi hoặc nhiều hơn trên một mẫu lá non có kích thước 7
x 7 mm.
Simmonds và Werry (1987) khi nuôi cấy mẫu cuống lá ñã thu ñược lượng
lớn chồi bất ñịnh nhưng sau 9 tuần nuôi cấy trên môi trường ñặc, thì chỉ có một
số ít chồi có kích thước ñủ lớn ñể dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô. Chu kỳ
nuôi cấy lỏng lắc kích thích sự tăng trưởng của chồi. Thời gian tối ưu ñể bắt ñầu
nuôi cấy lỏng là sau khi nuôi cấy trên môi trường rắn (agar) ñược 6 tuần. Phương
pháp này ñã làm tăng một cách ñáng kể số lượng cây con. GA
3
khi ñược dùng
trong nuôi cấy lỏng sẽ kích thích sự phát triển của chồi nhưng khả năng ra rễ của
những chồi này lại không tốt, do ñó khả năng tạo ra các cây con hoàn chỉnh ña
phần bị giảm ñi.
Khi nuôi cấy mẫu lá và mẫu cuống lá của giống Begonia tuberous lai trên
môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA, Nakano và cộng sự
(1999) ñã thu ñược những chồi bất ñịnh có kích thước trên 10 mm (8 – 9
chồi/mẫu). Chồi ñược nhân lên một cách hiệu quả bằng nuôi cấy lắc các chồi (tạo
từ lá) trong môi trường lỏng bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. Trong khi ñó
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g

e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F

-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.

c
o
m
ðồ án tốt nghiệp
Hoàng Văn Thưởng
Lớp 47 Công Nghệ Sinh Học – ðai học Nha Trang
24

24

sự tăng trưởng của chồi thì ñược kích thích khi nuôi cấy lắc không có bổ sung
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật. ðể thu ñược cây con, ta cấy các chồi vào môi
trường tạo rễ (1/2MS, 0,1 mg/l NAA và 8 g/l agar). Các cây con thu ñược có khả
năng ra hoa bình thường không có sự biến ñổi nào về hình thái.
Năm 2003, Jaime A, Teixeira da Silva và cộng sự ñã tiến hành nghiên cứu
hệ thống TCL trong công nghệ vi nhân giống loài Begonia rex trên môi trường
chứa 1% sucrose, 10 g/l agar, 0,1 mg/l BA và 0,05 m/l NAA trong chương trình
tạo rễ.
Mendi và cộng sự (2009) ñã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi trực tiếp của
loài Begonia tuberus trên môi trường MS cơ bản có bổ sung các loại chất ñiều
hòa sinh trưởng khác nhau. Kết quả tốt nhất ñạt ñược trên môi trường MS bổ
sung 0,5 BA và 0,5 NAA với tỷ lệ tái sinh 70%.
Khi 1 – 6 lớp tế bào biểu bì và những tế bào nhu mô dày ở dưới thu nhận từ
gân lá chính của các lá ñược nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1% sucrose
và 10 g/l agar sẽ cho:
− Sự tái sinh chồi khi cho thêm 0,2 mg/l BA
− Sự tái sinh rễ khi thêm 0,09 mg/l NAA
− Sự thành lập nhiều tế bào lông khi thêm 0,02 mg/l NAA.
Chương trình phát sinh hình thái mới này diễn ra sau 6 ngày nuôi cấy, tiêu
biểu cho một trong những loại biệt hóa ñơn giản nhất (Chlyah và Tran Thanh

Van, 1975).
3.1.2. Cây hoa Torenia
Torenia, Wisihsbone Flower và Bluewings là các tên thường gọi của các
loài hoa Torenia (T. fourwieri, T. concolor, T. xhybrida và T. asiatica). Torenia là
loại cây hai lá mầm, thân thảo lâu năm. Torenia còn ñược gọi là mắt biếc hay mắt
nai, có nguồn gốc từ châu Á và châu Phi, ñược ưa chuộng bởi cánh hoa mềm
mại, xinh xắn, dễ trồng, dễ chăm sóc.
3.1.2.1. Vị trí phân loại
Giới : Plantae
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V
i
e
w
e
r
w
w

w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e

V

i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m