so sánh hiệu suất cộng hợp độc tố cá nóc (tetrodotoxin) với toxoid tetanus bằng hai phương pháp formaldehyde và fluorosulfonyl benzoic acid

- 1 -
MỞ ĐẦU
Nước ta nằm ở khu vực Đông Nam Á có bờ biển dài trên 3000km. Số
lượng cũng như chủng loại cá Nóc rất phong phú. Ngư dân vùng biển suốt từ
Quảng Ninh đến Kiên Giang đã đánh bắt hàng ngàn tấn cá Nóc mỗi năm. Sản
lượng cá Nóc đánh bắt được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực
phẩm hàng ngày, làm mắm, làm chả cá, làm khô cá….đưa vào tiêu thụ trên thị
trường. Người dân sử dụng loại thực phẩm này là nạn nhân của các vụ ngộ độc
thương tâm, đã có nhiều gia đình tử nạn do nhiễm độc tố cá Nóc. Tỷ lệ chết do
ngộ độc cá Nóc chiếm khoảng 45% số ca chết do ngộ độc thực phẩm hàng năm.
Đặc biệt là khô cá nóc, cá nóc đông lạnh, chả cá nóc thường xảy ra vào tháng
trước và sau tết âm lịch. Ngộ độc cá nóc tươi thường xảy ra tại các tỉnh ven biển,
vào mùa cá nóc (từ tháng 3 đến tháng 10, nhiều nhất là từ tháng 4 đến tháng 7).
Hiện nay vẫn chưa có một loại thuốc giải độc đặc hiệu nào cho các ca ngộ
độc cá Nóc. Trước tình hình ngộ độc ngày càng gia tăng, việc sản xuất ra một
loại thuốc đặc hiệu là rất cần thiết. Với lĩnh vực miễn dịch có thể tìm ra phương
án cho vấn đề này. Dựa trên đối tượng độc tố được chiết xuất từ cá Nóc là
Tetrodotoxin ( thành phần độc tố chính gây chết) có thể sản xuất kháng độc tố cá
Nóc. Mở ra một hướng điều trị mới cho bệnh nhân khi bị ngộ độc do loại độc tố
này. Kháng thể kháng độc tố cá nóc đặc hiệu sẽ trung hoà lượng độc tố trong cơ
thể bệnh nhân giúp bệnh nhân giải độc.
Viện Vacxin Nha Trang đang tiến hành nghiên cứu thử nghiệm sản xuất
huyết thanh kháng độc tố cá Nóc. Để sản xuất được kháng huyết thanh cần thiết
phải có một kháng nguyên có chất lượng sử dụng để gây miễn dịch. Do đó, để
đem lại hiệu quả cho công đoạn ban đầu của quy trình nghiên cứu sản xuất kháng
thể kháng độc tố cá Nóc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“So sánh hiệu suất cộng hợp độc tố cá Nóc (Tetrodotoxin) v ới Toxoid
Tetanus bằng hai phương pháp Formaldehyde và Fluorosulfonyl benzoic
acid”
Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu: Sản xuất kháng nguyên nhân tạo (antigen)
độc tố cá Nóc với hiệu suất cao để nghiên cứu gây miễn dịch sản xuất kháng độc

tố Tetrodotoxin.
- 2 -
Chương 1
TỔNG QUAN
- 3 -
1.1. Khái quát về kháng nguyên
1.1.1. Khái niệm [1], [6], [8]
Kháng nguyên là chất mà được hệ thống miễn dịch nhận biết một cách đặc
hiệu.
Những phân tử đơn giản, chung cho nhiều loài như nước, muối, khoáng, ure,
creatinin, đường đơn hoặc đường đôi, không phải là kháng nguyên. Thường
kháng nguyên có một cấu trúc phức tạp hơn hoặc nếu chúng là những phân tử
nhỏ như các kim khí nặng (crôm, kẽm) hay thuốc thì phải với điều kiện là chúng
có thể liên kết được với các đại phân tử như protein.
Nói một cách đầy đủ hơn, kháng nguyên là một chất gây ra đáp ứng miễn
dịch (tính sinh kháng thể hay tính gây mẫn cảm) và rồi phản ứng với các sản
phẩm của đáp ứng này (tính đặc hiệu).
Kháng nguyên không có một đặc tính hoá học riêng biệt nào và chúng là
những hoá chất tự nhiên, cũng như là các sản phẩm tổng hợp không có trong tự
nhiên. Bằng chứng độc nhất nói lên một chất thực là một kháng nguyên khi
chứng minh được có đáp ứng miễn dịch chống lại nó. Điều này có thể thực hiện
được trên súc vật bằng cách tiêm kháng nguyên, đôi lúc phải tiêm tá chất (mẫn
cảm thực nghiệm) hoặc nếu ở người thì khi có xuất hiện kháng thể sau bị nhiễm
khuẩn, uống thuốc (mẫn cảm ngẫu nhiên hay do thầy thuốc). Dẫu sao bình
thường hệ thống miễn dịch không có đáp ứng với những chất của bản thân. Nên
để có thể chứng minh là có đáp ứng thì đôi khi phải sử dụng những biện pháp đặc
biệt như ở súc vật thì mẫn cảm với tá chất, tiêm các chất của bản thân đã bị thoái
hoá nhẹ, hay qua nghiên cứu các bệnh tự miễn ở người.
1.1.2. Các loại kháng nguyên [1], [8]
Dựa vào bản chất hoá học của các chất mà phân ra các loại kháng nguyên sau:

1.1.2.1. Các glucid
Các polyosid nói chung là những kháng nguyên tuyệt hảo cũng như là phần
glucid của các glycoprotein. Ví dụ hay nói đến nhất là các kháng nguyên kinh
điển của nhiều vi sinh vật và của các nhóm máu mà tính đặc hiệu là do các nhóm
- 4 -
đường khác nhau quyết định. Đó là những polysaccharide với cấu trúc phân tử đa
dạng và do đó có tính kháng nguyên mạnh.
1.1.2.2. Lipid
Phần lớn các chất này gồm một chuỗi đơn điệu CH
2
kỵ nước nên không có
tính kháng nguyên. Những ví dụ về kháng nguyên lipid là do chúng có thêm phần
glucid hay protid. Nh ư trường hợp chất cardiolipin chiết từ ty lạp thể, mà người
ta thấy có kháng thể tương ứng trong bệnh giang mai, nó rất hay dùng để phát
hiện bệnh này vì nhạy và ít tốn tiền.
1.1.2.3. Protein
Khi có trọng lượng phân tử lớn hơn 4000 dalton thì các polypeptid hay
protein là những kháng nguyên tốt nhất. Chất vasopressin có trọng lượng phân tử
1000 với 9 acid amin là chất nhỏ nhất gây được mẫn cảm mà cho đến nay người
ta biết. Cấu trúc rất phức tạp của chúng làm cho chúng có nhiều nhóm quyết định
kháng nguyên khác nhau.
1.1.2.4. Axit nucleic
Rất khó có được kháng thể chống axit nucleic khi mẫn cảm cho con vật.
Ngược lại trong một số bệnh tự mẫn luput ban đỏ rải rác cấp, người ta thấy có
nhiều loại kháng thể chống axit nucleic.
1.1.2.5. Các chất tổng hợp
Các chất có cấu trúc tổng hợp khác nhau có thể trở thành kháng nguyên khi
chúng có trọng lượng phân tử đủ lớn hay khi chúng liên kết được với những
protein mang tải. Người ta đã chú ý nhiều đến các cấu trúc tổng hợp để xác định
tính kháng nguyên và tính đặc hiệu của chúng. Thuốc có thể là kháng nguyên gây

ra những phản ứng dị ứng thấy trong bệnh lý người.
1.1.2.6. Các siêu kháng nguyên
Đó là trường hợp đặc biệt khi các phân tử không cần kết hợp với phức hợp
chủ yếu hoà hợp mô lớp II để được trình diện như thông lệ mà lại tác dụng thẳng
với trình tự peptid của một số TRC đặc biệt có chuỗi V. Cho nên những phân tử
ấy không cần được nhận biết một cách đặc hiệu mà vẫn tác dụng lên nhiều clôn
- 5 -
tế bào T có mang cấu trúc như chuỗi  của TRC. Người ta thấy đặc tính này ở
các enterotoxin của liên cầu trùng và nucleocapsid của virus dại.
Có thể mở rộng khái niệm siêu kháng nguyên tới các phân tử có nguồn gốc vi
khuẩn, có những tính đặc hiệu khác nhau mà có thể liên kết với các globulin
miễn dịch màng để hoạt hoá tế bào lympho B.
1.1.3. Những đặc tính của kháng nguyên [1], [6], [8]
1.1.3.1. Tính đặc hiệu miễn dịch
1. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một kháng nguyên là đặc tính mà kháng nguyên ấy chỉ
được nhận biết bởi đáp ứng miễn dịch (kháng thể) do nó gây ra, chứ không phải
những đáp ứng miễn dịch do các kháng nguy ên khác. Như thế một kháng thể
chống A chỉ phản ứng với kháng nguyên A. Ngược lại một kháng nguyên A chỉ
được nhận biết bởi một kháng thể chống A. Mọi kỹ thuật miễn dịch đều dựa trên
đặc tính cơ bản này là tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch.
Tình trạng mất phản ứng sau khi có những thay đổi cực nhỏ về cấu trúc hoá
học của kháng nguyên, đã chứng minh tính đặc hiệu ấy. Đối với các polyosid chỉ
cần thay đổi một trong những thành phần sau đây cũng đủ để thay đổi tính chất
đặc hiệu: một chức đường, liên kết giữa hai chức đường. Đối với peptid và
protein thì chỉ một thay đổi nhỏ cũng làm biến tính đặc hiệu: ví dụ đổi một acid
amin bằng một acid amin khác, acid amin D th ế cho acid amin tự nhiên L.
Tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch đã được các công trình của K.
Landsteiner (1930 - 1934) chứng minh qua các kháng nguyên nhân tạo gồm một
protein gắn với những phân tử nhỏ tổng hợp mà ông ta gọi là “hapten”. Chỉ cần

biến đổi vị trí của một gốc hay thay đổi gốc đó bằng một gốc khác là đáp ứng
miễn dịch vẫn có thể phân biệt được.
2. Phản ứng chéo
Đối lại với quy luật tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch thì lại có ngoại lệ
gọi là “phản ứng chéo” khi hai kháng nguyên có nguồn gốc khác nhau nhưng lại
phản ứng với cùng một kháng thể. Ngoại lệ đó là do:
- 6 -
- Có một cấu trúc giống hệt: thực vậy ở các loài khác nhau vẫn có thể có
những nhóm quyết định kháng nguyên chung vì lý do tiến hoá hay ngẫu nhiên.
Ví dụ như những chất của nhóm máu A và B với chất của một số vi khuẩn vô hại
ở ruột, chúng có cấu trúc giống nhau đến mức chính là các vi khuẩn gây ra sản
xuất kháng thể tự nhiên chống A và chống B ở những người có nhóm máu O.
Trong trường hợp này cá thể có nhóm máu O sản xuất những kháng thể dị loại
thực ra là để chống vi khuẩn nhưng đồng thời cũng là kháng thể đồng loài nếu
đứng trên phương diện truyền máu hay khía cạnh khi không có hoà hợp mẹ -
thai.
- Có một cấu trúc tương tự: có thể lấy ví dụ nhóm B và kháng nguyên giả B
xuất phát từ kháng nguyên A
1
. Đặc trưng của nhóm máu A
1
là có một ose tận
cùng là N – acetylgalactosamin và của kháng nguyên B là galactose. Trong ung
thư đại tràng khi có nhiễm vi khuẩn thì chất N - acetylgalactosamin có thể bị mất
acetyl bởi men desacetylase của vi khuẩn mà đổi thành galatosamin. Khi ấy
kháng nguyên A
1
được nhận biết bởi một số kháng thể chống B trên nên được gọi
là “giả B”. Những kháng thể chống B ấy không phân biệt mỗi OH của galactose
và NH

2
của galactosamin.
3. Nhóm quyết định kháng nguyên hay epitop
Phần của kháng nguyên được nhận biết bởi hệ thống miễn dịch được gọi là
nhóm quyết định kháng nguyên hay là epitop. Thụ thể hay receptor đối với kháng
nguyên nằm trên tế bào lympho T được gọi là TCR (T cell receptor), và trên tế
bào B được gọi là vị trí kháng thể hay paratop. Kích thước của một nhóm quyết
định kháng nguyên là 5 đến 6 gốc -ose đối với một kháng nguyên glucid, hay 5
đến 6 acid amin đối với một kháng nguyên lẫn lộn. Trên cùng một kháng nguyên
thường có nhiều epitop vì cấu trúc ấy hoặc được nhắc đi nhắc lại nhiều lần hoặc
vì có nhiều môtýp khác nhau có thể nhận biết được.
4. Kho tư liệu miễn dịch
Tất cả số nhóm quyết định kháng nguyên mà một hệ thống miễn dịch có thể
nhận biết được, hình thành kho tư liệu miễn dịch của mỗi cá thể. Theo những
hiểu biết về các phần thay đổi trong cấu trúc của globulin miễn dịch thì bộ gen
con người có khoảng 10
7
khả năng tạo các kháng thể khác nhau. Ngoài ra khi
- 7 -
cùng một kháng thể mà lại có thể nhận biết nhiều quyết định kháng nguyên khác
nhau với mức ái tính thay đổi, thì hệ thống miễn dịch ấy được coi như là đã “bị
thoái hoá”.
1.1.3.2. Tính sinh kháng th ể
Tính sinh kháng thể là khả năng của một kháng nguyên tạo ra một đáp ứng
miễn dich. Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể, dương tính (gây mẫn cảm
tức có sinh kháng thể) hay âm tính (gây dung nạp tức không sinh kháng thể).
Tính sinh kháng thể là đặc tính đầu tiên của kháng nguyên nói ở trên. Việc định
nghĩa của cả hai từ sau đây cho phép hiểu rõ hơn khái niệm ấy.
1. Hapten
Một hapten là một “phân tử nhỏ (tự nhiên hay nhân tạo) một mình không có

khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch nhưng vẫn được nhận biết bởi các sản phẩm
của đáp ứng này”. Từ này đã được Landsteiner tạo ra năm 1930 khi ông ta chứng
minh là những chất có cỡ khổ nhỏ bản thân không gây mẫn cảm được một con
vật nhưng ngược lại nó vẫn phản ứng với huyết thanh của con vật đã được mẫn
cảm với kháng nguyên toàn bộ, nghĩa là một kháng nguyên bao gồm cả chất
mang tải lẫn hapten. Như vậy hapten có tính chất đặc hiệu nhưng không có tính
chất sinh kháng thể. Dẫu sao từ hapten không hoàn toàn đồng nghĩa với nhóm
quyết định kháng nguyên. Thực vậy hapten có thể bé hơn, bằng hay lớn hơn
epitop và như thế không tương ứng hoàn toàn về cấu trúc nhóm quyết định kháng
nguyên.
2. Chất mang tải (carrier)
Chất mang tải là một phần của kháng nguyên, nói chung là protein, liên kết
với hapten làm cho nó trở nên sinh kháng thể được.
Người ta đã giải thích sự cần thiết phải có tính chất mang tải như sau: kháng
nguyên được hấp thu và tiêu đi một phần bởi tế bào trình diện kháng nguyên,
phần này phải được biểu lộ trên bề mặt của nó, kết hợp với phức hợp hoà hợp mô
lớp II. Như vậy là phải có một sự bổ cứu giữa chất mang tải và phức hợp hoà hợp
mô.
1.1.3.3. Những đặc tính khác
- 8 -
Đó là những đặc tính phụ và không thường xuyên nhưng đã mang lại những
thay đổi về chất lượng và số lượng trong đáp ứng miễn dịch.
1. Tính gây dị ứng
Một số kháng nguyên dễ gây ra sản xuất kháng IgE hơn và do đó mà gây ra dị
ứng týp tức khắc. Cho đến ngày nay người ta chưa biết những đặc trưng của tính
trạng ấy. Các dị nguyên chính được biết là phấn hoa, nọc của một số sâu bọ có
cánh màng, súc vật…Đáp ứng miễn dịch chuyển thẳng từ IgM sang IgE. Tính
chất này phụ thuộc vào cơ địa của cá thể.
2. Tính gây dung nạp
Một số kháng nguyên lại dễ tạo ra tình trạng dung nạp hơn là một số khác.

Như vậy khó mà gây được sự mẫn cảm đối với loại kháng nguyên ấy. Nó cũng
phụ thuộc vào cơ địa.
3. Tính tá chất
Một số tá chất cho phép tăng cường độ của đáp ứng miễn dịch đối với kháng
nguyên đã kết hợp với nó. Một số kháng nguyên bản thân đã có tính kích thích
ấy.
4. Tính gây phân bào
Ngoài đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, kháng nguyên có thể kéo theo một tình
trạng tăng  - globulin huyết chung bằng kích thích sự phân chia của tế bào
lympho B. Điều này hay thấy trong quá trình nhiễm khuẩn hay khi tiêm
polysaccharid của vi khuẩn đường ruột (LPS), chất này hay được dùng trong thực
nghiệm với mục đích gây phân bào.
1.1.4. Ứng dụng của kháng nguy ên
1.1.4.1. Ứng dụng trong sản xuất vacxin.[1], [4], [6]
Vacxin là chất liệu chế từ các vi sinh vật hoặc các kháng nguyên đặc hiệu
của chúng để đưa vào cơ thể người gây miễn dịch chủ động cho cộng đồng để
phòng bệnh truyền nhiễm do các vi sinh vật tương ứng gây ra [4,tr. 44].
- 9 -
Như vậy, nguyên lý của vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ
động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại
những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ
đó làm mất khả năng này.
1.1.4.2. Ứng dụng sản xuất kháng huyết thanh
Nguyên lý của kháng huyết thanh: khi cơ thể mắc bệnh cấp mà chưa có miễn
dịch thì có thể sử dụng kháng thể có trong huyết thanh của vật khác hay của
người khác mà đưa vào tạm thời thay thế để qua khỏi lúc nguy hiểm.[1, tr.357]
Kháng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu lấy từ huyết thanh súc vật hoặc
người ở đây đã được gây miễn dịch cao độ với kháng nguyên của chính mầm
bệnh [4, tr.44].
Tính đặc hiệu rất cao của các kháng thể ri êng biệt khi liên kết với một kháng

nguyên, thậm chí một kháng thể chỉ liên kết với một quyết định kháng nguy ên
(hoặc là epitop) đã tạo cho chúng một ph ương tiện lí tưởng và có giá trị cao trong
các nghiên cứu sinh học, y học v à sinh học phân tử. Các epitop có thể tồn tại như
những phân tử riêng biệt và là những chất hóa học hữu c ơ (chẳng hạn 2,4 D,
penicillin…). Chúng cũng có mặt trong các đại phân tử nh ư protein,
glycoprotein, lipoprotein, polysaccharid, A DN, ARN. Các epitop cũng có thể là
một phần cấu trúc tế b ào của vi khuẩn, nấm mốc v à vi rút. Nói chung, các kháng
thể có thể được sản xuất dễ dàng, thậm chí chỉ cần một l ượng nhỏ kháng nguy ên
cũng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch [6, tr. 128].
Kháng nguyên còn có ứng dụng to lớn trong sản xuất kháng huyết thanh. Các
kháng nguyên là vi khuẩn bất hoạt, một phần của vi khuẩn, có thể là giải độc tố,
độc tố thô…được đưa vào cơ thể súc vật gây miễn dịch sinh kháng thể đặc hiệu.
Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu này sẽ được sử dụng để chữa bệnh.
Trước đây người ta dùng huyết thanh lấy từ ngựa, cừu được mẫn cảm chống
vi khuẩn gây bệnh, rồi dùng gamma – globulin chiết tách từ những huyết thanh
có kháng thể ấy. Ngày nay với kỹ thuật tế bào lai, người ta đã có huyết thanh đơn
clon chỉ chống một nhóm quyết định kháng nguyên quan trọng sinh bệnh mà
thôi. Ví dụ huyết thanh idiotyp chống tự kháng thể thấy trong bệnh đái đường tự
mẫn, huyết thanh chống interleukin – 6 để chống viêm [1,tr.358-359],[5,tr.22].
- 10 -
Ngoài ra kháng nguyên còn có ứng dụng trong các phản ứng kháng nguyên –
kháng thể sử dụng trong các kỹ thuật miễn dịch: kỹ thuật ELISA,…
1.2. Độc tố cá Nóc Tetrodotoxin (TTX)
1.2.1. Công thức, cấu tạo của TTX [2],[3],[7],[13]
Tetrodotoxin (TTX) còn g ọi là độc tố cá Nóc, là một chất độc thần kinh
mạnh, có khả năng gây độc rất cao, tỷ lệ gây tử vong gấp 10 lần nọc độc rắn cạp
nong, từ 10 đến 100 lần nhện độc v à gấp 10 000 lần so với mức độ độc của cyanua.
Liều gây độc được xác định là 1 – 4 mg. Liều gây chết chuột LD
50
= 8 – 10 g/kg

thể trọng [7].
TTX là một hợp chất hữu cơ phi protein, có tên là anhydrotetrodotoxin – 4 –
epitetrotoxin hay axit tetronic, có công th ức phân tử là C
11
H
17
O
8
N
3
- được công
bố năm 1964 tại “Hội nghị quốc tế về hoá học của các chất trong tự nhi ên” được
tổ chức tại Tokyo, bởi nhóm nghi ên cứu Ritsuda Kasuke (Đại học Tokyo), nhóm
nghiên cứu Hida Yoshimasa (Đại học Nagoya), ông Mosher, ông Wood – Ward.
Công thức cấu tạo của TTX ở h ình 1.1
Trong phân tử TTX có một nhóm Guanidin tích điện d ương gồm ba nguyên
tử Nitơ và một vòng pyrimidin hợp nhất với những v òng bổ sung tạo thành một
hệ có năm vòng tất cả. Hệ thống vòng này có chứa các nhóm hydroxyl vốn có
khả năng làm cho phức liên kết giữa TTX và kênh Na ổn định được ở bề mặt liên
pha nước. Vùng liên kết giữa TTX và kênh Na là cực kỳ hẹp (d = 10
-10
nm) . TTX
rất giống cation Na
+
đã hydrat hoá nên sẽ đi vào được cửa (miệng) của phức hệ
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử TTX
- 11 -
peptid tạo nên kênh Na, ở đây TTX liên kết với một gốc glutamat của phức hệ
peptid và sau đó gi ữ chặt lấy chỗ dựa của m ình ngay cả khi phức hệ peptid thay
đổi độ bền. Dù có các thay đổi về hình thể của phức, TTX sau này vẫn được gắn

kết với lỗ của kênh Na bằng liên kết tĩnh điện.
1.2.2. Tính chất của TTX [2], [3]
Tổng hợp các nghiên cứu về độc tố cá Nóc, có thể n êu lên tính chất của độc tố
TTX như sau:
- Tính tan: Độc tố cá Nóc tinh khiết (tetrodotoxin) l à một tinh thể không màu,
không mùi và không vị. Tan tốt trong nước và dung môi hữu cơ, không tan trong
axit. Tuy nhiên, có thể tan trong dung dịch có độ axit thấp.
- Tính bền: Độc tố cá Nóc rất ổn định trong dung dịch có độ axit nh ưng lại dễ bị
phân giải trong dung dịch kiềm. Độc tố sẽ giảm đi nếu đun sôi với dung dịch
natri cacbonat hoặc ammoniac 0,2% v à sẽ biến đổi ngay lập tức nếu đun sôi với
dung dịch Natrihydroxit 0,1%. Nếu ngâm trong dung dịch kiềm với pH 14 trong
1 giờ sẽ phân giải hoàn toàn.
- Tính kháng nhiệt: Độc tố cá Nóc có tính kháng nhiệt cao, chịu đ ược nóng và độ
khô mà không mất đi độc tính. Khi đun sôi độc tố ở nhiệt độ cao v à kéo dài thì
cũng không làm giảm độc tính được trên 30%.
- Tính liên kết: Có tính liên kết cao, chống lại được các tia cực tím và các tia
chiếu của ánh nắng mặt trời, để tia cực tím trực tiếp 48 giờ độc tính cũng không
thay đổi. Để dưới ánh nắng mặt trời 1 năm, độc tính cũng không thay đổi.
- Rất dễ thẩm thấu vào màng nhầy của động vật.
- Độc tố cá Nóc với cơ thể con người:
+ Liều gây chết: 1,0 - 2,0 mg.
+ Không bị phân giải bởi các men ti êu hóa.
+ Thời gian hấp thụ, phân hủy v à bài tiết trong cơ thể rất lâu còn ngộ độc sau khi
ăn thì rất ngắn.
- 12 -
1.2.3. Cơ chế gây độc của Tetrodotoxin [2],[3],[7]
Hình 1.2. Cơ chế tác động của TTX đối với k ênh ion Na
+
[25]
Dòng ion natri di chuyển vào trong tế bào thần kinh là bước cần thiết để dẫn

truyền các xung thần kinh nhằm kích thích các sợi thần kinh và chạy dọc theo sợi
trục thần kinh. Bình thường tế bào sợi trục thần kinh chứa nồng độ K
+
cao và
nồng độ Na
+
thấp tạo ra điện thế âm. Sự kích thích sợi trục thần kinh mang lại thế
hoạt động phát sinh từ dòng ion Na bên trong tế bào, khi đó sinh ra hiệu điện thế
dương nhiều hơn. Kênh truyền dẫn ion Na được hình thành bởi chuỗi peptid đơn
với bốn đơn vị lặp lại mà mỗi đơn vị chứa 6 vòng xoắn ốc.
Tetrodotoxin rất đặc hiệu với kênh dẫn ion Na và không tác động lên kênh
dẫn K
+
. Sự cầm giữ vững chắc của TTX vào phức hệ protein tạo kênh Na được
thể hiện bằng thời gian chiếm giữ của TTX tại phức. Nếu như Na
+
đã được
hydrat hoá thường liên kết thuận nghịch với kênh trong khoảng một nano giây
(10
-9
s) thì TTX lại liên kết và lưu lại trong kênh hàng chục giây. Do kích thước
lớn nên phân tử TTX chặn không cho ion Na
+
có cơ hội để đi vào kênh do đó sự
vận động của ion Na
+
chấm dứt và kéo theo điện thế hoạt động dọc theo màng
dây thần kinh cũng ngừng. Như vậy TTX đã phong toả một cách chính xác cánh
cổng điện thế của kênh Na ở mặt ngoài của màng dây thần kinh. Chỉ một mg
TTX hoặc ít hơn một số lượng có thể đặt vừa đầu một đinh ghim là đủ để giết

chết một người trưởng thành. Nói cách khác, tetrodotoxin đã khoá đường dẫn
- 13 -
xung thần kinh dọc theo sợi trục thần kinh gây tê liệt hô hấp và cơ vận động nên
làm nạn nhân tử vong.
- Triệu chứng ngộ độc cá Nóc : Sự bắt đầu của triệu chứng th ường diễn ra từ 10-
45 phút sau khi ăn đ ộc tố vào bụng, nhưng có thể trì hoãn lâu khoảng 3 giờ, phụ
thuộc vào sự khác nhau giữa từng ng ười và lượng độc tố tiêu thụ. Đầu tiên là mất
cảm giác ở môi và lưỡi, sau đó tê liệt cử động và mất cảm giác, huyết áp tụt
xuống do động mạch vành bị rãn, cảm giác thấy khó thở do t ê liệt, ý thức vẫn
bình thường cho đến lúc trước khi chết, nhưng cuối cùng cũng sẽ mất ý thức và
sau đó ngừng thở do bị tê liệt hoàn toàn trung khu hô h ấp. Tình trạng tê liệt
thường kèm theo ỉa chảy, buồn nôn, mất điều h òa, chóng mặt, đau đầu.
- Cấp cứu ngộ độc do cá nóc: Hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc hiệu và giải độc.
Nguyên tắc cấp cứu và xử trí cơ bản là:
+ Khi mới ở độ I: Gây nôn, sử dụng thuốc lợi tiểu để loại bớt độc tố, rửa dạ dày
cho uống than hoạt tính v à cùng lúc đó phải nhanh chóng đưa bệnh nhân đến
bệnh viện.
+ Đề phòng liệt hô hấp: tiến hành hô hấp nhân tạo, hồi sức tim mạch, chống trụy
tim mạch.
+ Chống sốc: truyền dịch, thở oxy.
1.2.4. Tính miễn dịch của độc tố TTX
TTX có công thức phân tử C
11
H
17
O
8
N
3
, là một phi protein có trọng lượng

phân tử nhỏ hơn 1000 ( MW
TTX
=319 ), và được xem như là một hapten, hoàn
toàn không có tính mi ễn dịch, không có khả năng sinh kháng thể [3], [21], [22].
1.3. Cơ sở cộng hợp [1], [6,tr.128]
Một phân tử được gọi là kháng nguyên (antigen) khi nó có th ể liên kết với các
thành phần của cơ quan miễn dịch (kháng thể hoặc thụ thể - receptor của tế bào).
Tuy nhiên phân tử kháng nguyên này có thể không gây ra đáp ứng miễn dịch
tổng hợp kháng thể của nó. Do đó cần phân biệt hai thuật ngữ l à phân tử có tính
kháng nguyên và phân t ử có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch, nghĩa l à có thể
tạo ra kháng thể. Từ đó tất cả các phân tử gây ra đáp ứng miễn dịch (đ ược gọi là
- 14 -
immunogen) đều là những kháng nguyên nhưng không ph ải tất cả các kháng
nguyên đều là immunogen.
Người ta cho rằng các kháng nguy ên phải có hai thuộc tính l à tính kháng
nguyên và tính gây ra đáp ứng miễn dịch. Những kháng nguy ên chỉ có thuộc tính
kháng nguyên thường được gọi là hapten. Hapten có th ể coi là immunogen không
đầy đủ. Một immunogen phải “lạ” nghĩa l à không phải của bản thân (nonself) v à
cần có kích thước đủ lớn, càng lớn càng dễ gây đáp ứng miễn dịch tạo ra kháng
thể.
Những chất có phân tử l ượng thấp hơn 1000 dalton như penixilin, proges
teron…không thể là immunogen. Nói chung nhi ều protein lạ có phân tử l ượng
lớn hơn 6000 dalton đều là những immunogen. Một số chất có bản chất axit
nucleic như ADN, ARN gây đáp ứng miễn dịch rất kém, chúng có thể trở th ành
immunogen nếu được gắn với một protein mang.
Do đó, để các hapten trở th ành một immunogen thực sự, có khả năng gây ra
đáp ứng miễn dịch cần phải gắn kết nó với một đại phân tử l à protein mang. Hay
đây chính là quá trình cộng hợp.
1.3.1. Các đặc điểm hoá học của việ c kết nối [4,tr.142]
Trong suốt thập kỷ qua nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để

kết nối protein-saccharide và đang chờ phê duyệt. Tiêu chuẩn của một phương
pháp hoàn hảo được sử dụng trong vacxin cộng hợp glyco là không được làm
thay đổi cấu trúc polysaccharid và các thành phần protein.
Phần lớn các phân đoạn polysaccharid của các oligosaccharid có chức năng
hemiaxetal hoặc hemiketal. Một phương pháp cộng hợp đơn giản và hiệu quả đáp
ứng đủ các tiêu chuẩn liên kết trực tiếp saccharid qua việc giảm đường nhóm -
amino.
Một giải pháp hữu hiệu khác để giải quyết vấn đề này là phát triển nhiều hơn
các nhóm aldehyd hoạt động tự do tại điểm cuối của các saccharid.
Ở phương pháp khác, cũng đã có sự hoạt hoá không đặc hiệu ở các nhóm
hydroxyl qua việc sử dụng carbonyl diimidazole. Sự hoạt hoá được diễn ra bởi
một trình tự phức tạp theo từng bước mà các phân tử chất đệm được gắn kết tới
- 15 -
cả polysaccharid hoạt tính và một protein vỏ não mô cầu kết nối theo cùng một
liên kết thioether, sẽ bất lợi khi tiến hành trong các dung môi hữu cơ.
1.3.2. Chất mang tải [1],[4],[6]
Chất mang tải là một phần của kháng nguyên nói chung là protein, liên kết
với hapten làm cho nó trở nên sinh kháng thể được [1,tr. 35], [6].
Để tăng khả năng sinh miễn dịch tối đa kháng nguyên cần được gắn các
protein tải mà không bị che mất biểu vị khi gặp tế bào – T hoặc B [4,tr. 143].
Các protein mang (carrier protein) là những phân tử lớn có khả năng gây kích
thích đáp ứng miễn dịch của một cơ thể được gây miễn dịch. Nhiều loại protein
mang được dùng để gắn với các hapten. Việc lựa chọn loại chất protein mang nào
là dựa vào đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, độ hoà tan và cách cộng hợp thích
hợp giữa protein mang và hapten. Ví dụ: hai loại protein mang là Keyhole
Limpet Hemocyanin (KLH) và Albumin huyết thanh bò (BSA) thường hay được
dùng nhất. Các kháng thể được tạo ra đều trực tiếp kháng lại protein mang cũng
như hapten. Vì vậy protein mang được lựa chọn cần phải liên quan đến các xét
nghiệm sẽ làm. Để tạo ra một immunogen tốt nhất, cần phải điều chế cộng hợp
(conjugate) hapten – protein mang ở tỷ lệ phù hợp. Hiện nay các chất cộng hợp

hapten – BSA có thể được dùng tốt bởi vì chúng không cản trở việc đo các kháng
thể kháng lại hapten [6,tr.130].
Các protein mang có thể được bán sẵn ở dạng đã hoạt hoá. Ví dụ các protein
mang đã hoạt hoá meleimide như: KLH và BSA đã hoạt hoá maleimide,
Ovalbumin đã hoạt hoá malemide của hãng hoá chất Pierce. Những protein mang
này dễ dàng phản ứng với các hapten peptid chứa nhóm amid bậc nhất hoặc
nhóm sulfohydril (- SH). Nếu một peptid hapten không chứa nhóm SH tự do thì
người ta có thể đưa nhóm này vào nhóm amin bậc nhất của hapten bằng một số
thuốc thử (hoá chất), ví dụ hoá chất Traut hoặc thuốc thử SATA (N –
succinimdyl – S – acetylthioacetate).
Nếu một hapten peptid chỉ chứa cầu disulfid (S – S) thì có thể dùng các chất
khử như DDT (dithiothreitol) hoặc 2 mercaptoethanol để tạo cho hapten này có
nhóm tự do. Vấn đề là, nếu có một hapten tổng hợp không phải peptid thì người
ra phải tìm cách thiết kế tổng hợp một peptid – hapten, để cho phép đưa 1 gốc
- 16 -
Cystein vào một đầu tận cùng C hoặc tận cùng N của peptid. Những hapten như
thế rất dễ cộng hợp với protein mang đã hoạt hoá với maleimide để tạo ra một
immunogen có hiệu quả cao.
Ngoài ra người ta thường dùng giải độc tố bạch hầu - uốn ván (DT - TT,
diphtherea toxoid – tetanus toxoid) làm vật tải kháng nguyên và thấy phù hợp
cho trẻ em. Mặt hạn chế của việc sử dụng các giải độc tố này là việc chúng bắt
nguồn từ các độc tố vi khuẩn tự nhiên đã được giải độc tố bằng formaldehyde
làm huỷ hoại lysin một thành phần quan trọng tham gia kết nối kháng nguyên. Vì
thế dùng protein bạch hầu CRM 197 từ chủng đột biến không độc là giải pháp
tránh được nhược điểm đó [4, tr. 143].
Giải độc tố uốn ván tetanus toxoid (TT) đ ược giải độc bằng formalin. Kể từ
năm 1924 lần đầu tiên phát hiện formalin khử độc độc tố uốn ván v à nó vẫn được
sử dụng rộng rãi đến nay [4, tr.162].
Mỗi phân tử Tetanus Toxoid gồm 48 nhóm ami no có khả năng tham gia gắn
kết [17].

Trong miễn dịch học người ta đã giải thích sự cần thiết phải có tính chất mang
tải như sau: kháng nguyên được hấp thu và tiêu đi một phần bởi tế bào trình diện
kháng nguyên, phần này phải được biểu lộ trên bề mặt của nó, kết hợp với phức
hợp hoà hợp mô lớp II. Như vậy là phải có một sự bổ cứu giữa chất mang tải và
phức hoà hợp mô [1, tr.35].
1.3.3. Các thuốc thử tạo liên kết chéo để điều chế immunogen [6]
Có hai loại thuốc thử tạo liên kết chéo là:
- Chất gắn hai nhóm chức giống nhau (homobifuctional cross - linker). Thuốc
thử này kết hợp cặp đôi qua cùng một chuỗi bên trong peptid và protein mang.
- Chất gắn hai nhóm chức không giống nhau (heterobifunctional cross -
linker) gắn cặp đôi với hai chuỗi bên khác nhau của hapten và protein mang.
Việc lựa chọn thuốc thử gắn cặp đôi có ý nghĩa quan trọng. Nói chung, sẽ tạo
ra ái lực cao hơn và kháng huyết thanh có hiệu giá cao hơn, mặc dù các chất cộng
hợp immunogen được tạo thành sẽ cho ra các kháng thể nhận diện được một dãy
các epitop. Thuốc thử đặc hiệu cao hơn chỉ nên được dùng khi cấu trúc hoá học
- 17 -
đã được biết rõ hoặc đã cải biến. Tuy vậy, chúng sẽ tạo ra kháng huyết thanh có
hiệu giá và tính háo kháng nguyên thấp hơn.
1.4. Tình hình nghiên c ứu cộng hợp ở trong và ngoài nư ớc
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt nam chưa có nhiều nghiên cứu sâu về các loại kháng nguy ên cộng hợp
để ứng dụng vào công tác sản xuất vacxin. Đây l à một lĩnh vực của công nghệ
cao, đòi hỏi dây chuyền công nghệ hiện đại v à là một định hướng cho ngành sản
xuất vacxin ở Việt nam trong t ương lai [4].
Viện Nghiên Cứu Biển cũng đã tiến hành nghiên cứu cơ bản độc tố cá nóc
TTX. Họ cũng đã chiết tách và tinh chế độc tố TTX từ các lo ài cá nóc của Việt
Nam nhưng chưa có một nghiên cứu nào chuyên sâu về độc tố này cũng như
những nghiên cứu ứng dụng của độc tố TTX .
Viện Vacxin và sinh phẩm Y Tế Nha trang đã tinh chế được độc tố cá Nóc
(TTX) với độ sạch từ 80-85% và đang ứng dụng loại độc tố này để nghiên cứu

sản xuất kháng thể kháng độc tố Cá Nóc.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu cộng hợp
Một phân tử hóa học nhỏ thì trơ về mặt miễn dịch học. Nó đ ược làm thay đổi
về phương diện hóa học bằng liên kết hóa trị với một phân tử protein mang có
trọng lượng phân tử lớn để tạo th ành một mẫu kháng nguyên nhân tạo trước khi
nó có thể thực hiện vai trò một chất kháng nguyên. S ự lựa chọn phân tử chất
mang của haptenic vaccine có tầm quan trọng cho sự sản xuất th ành công của
haptenic – specific antibody [21]. Từ đó các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều
về cộng hợp để tạo ra các loại kháng nguyên nhân tạo sử dụng điều chế vacxin và
huyết thanh.
Công nghệ kháng nguyên cộng hợp đã được tiến hành hơn 60 năm trư ớc.
Geobel và Avery đ ã kết hợp polysaccharide phế cầu khuẩn type 3 với globulin
huyết thanh ngựa thông qua việc diazo hoá các phân tử thay thế ete p –
aminobenzyl ở polysaccharide. Ở vacxin cộng hợp đ ã hình thành đơn vị lặp lại
oligosaccharide (axit cellobiur onic) của polysaccharide type 3 [4,tr.142].
- 18 -
Công nghệ vacxin cộng hợp glyco ph ù hợp cho các kháng nguy ên gia tăng
khả năng nhận biết kháng nguy ên của cơ thể non (trẻ sơ sinh đến hai tuổi). Nó
được ứng dụng cho các polysaccharide vỏ của các chủng Staphylococcus aureus ,
Klebsiella và Pseudomonus aeruginosa . Vacxin cộng hợp phòng viêm màng não
do H. influenza type b gây ra là s ản phẩm thương mại rất thành công.
Ngoài những nghiên cứu thành công trên lĩnh vực cộng hợp các Glyco với
protein mang, các nhà khoa h ọc cũng tiến hành nghiên cứu tạo ra các kháng
nguyên nhân tạo của các peptide, các hapten b ằng cách cộng hợp chúng với một
protein mang để tạo ra các immunoge n có tính miễn dịch.
Năm 1981, David M.B. và Preston G.F. đã áp dụng phương pháp
carbodiimide để cộng hợp một hợp chất có trong l ượng phân tử nhỏ để miễn
dịch protein G với một protein mang [20].
Năm 1986, James V. Staros và cộng sự thuộc phòng hoá sinh, trường Đại học

Vanderbilt đã sử dụng N – Hydroxysulfosuccinimide (OHSu(SO
3
)) trong phản
ứng gắn kết chất trung gian carbodiimide tan trong n ước (EDC: 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl) Carbodiimide ) nhằm nâng cao hiệu quả của phản ứng gắn
kết peptit với protein mang. Hợp chất EDC thường được sử dụng trong các phản
ứng gắn kết hay phản ứng cộng hợp để li ên kết một peptit có tính kháng nguy ên
với một protein mang , nó có tác dụng hình thành liên kết amid giữa gốc
carboxylic acid và nhóm amin . Tuy nhiên, tiện ích của nó bị giới hạn do hi ệu suất
gắn kết của nó là chậm. Ở trong nghiên cứu này họ đã tìm ra một phương pháp
để nâng cao hiệu suất gắn kết rất lớn đó l à việc cộng thêm vào dung dịch chất N
– Hydroxysulfosuccinimide (OHSu(SO
3
) [15],[26],[27].
Năm 1989, J.M. Peeters và cộng sự thuộc phòng thí nghiệm hoá hữu cơ,
Trường Đại Học Cathohc và Viện Bảo vệ sức khoẻ và môi trường cộng đồng
Quốc gia – Hà Lan đã nghiên cứu cộng hợp peptide Ata -Orn-angiotensin với 2
lọai protein mang l à tetanus toxoid (TT) và Diphtheria toxoid (TD) với bốn chất
gắn kết khác nhau là Succimidyl 6 -(N-maleimido)-n-hexanoate (MHS),
Succimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-cacboxylate (SMCC),
Succimidyl M-maleimidobezoate (MB S) hoặc Succimidyl 3-(2-pyridyldithio)
propionate (SPDP). Người ta đã sử dụng phương pháp ELISA đ ể so sánh tính
- 19 -
kháng nguyên cũng như tính miễn dịch của cộng hợp. Kết quả nghiên cứu cho
thấy MHS là chất gắn kết cho hiệu suất gắn kết tương đối từ 10-71% (phụ thuộc
vào pH của môi trường gắn) và có độ bền cao. MHS là chất được đề nghị chon
để làm xúc tác để cộng hợp peptide với TT v à TD [17].
Năm 1990 Carla Deen và các c ộng sự thuộc phòng thí nghiệm sinh học và
dược phẩm – Hà Lan đã nghiên cứu phương pháp gắn kết một hợp chất
carbodiimide mới cho peptid tổng hợp . carbodimide là một chất gắn kết hai

nhóm chức không giống nhau cho phản ứng gắn kết nhóm carboxyl và amino.
Trong nghiên cứu peptide tổng hợp là SAM-II được gắn với protein mang KLH
(keyhole limpet hemocyamin), CCG (chicken gamma globulin), ho ặc BSA
(bovine serum albumin) thông qua hợp chất Carbodiimide EDC (1 -Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl) Carbodiimide) đ ể tạo ra kháng nguyên nhân tạo. Người ta
đã so sánh tính miễn dịch của cộng hợp qua chất gắn kết l à EDC và chất gắn kết
được cho là tốt MBS (N-hydroSuccimidyl M-maleimidobezoyl) bằng phương
pháp ELISA, kết quả cho thấy tính miễn dịch của kháng nguyên nhân tạo cộng
hợp bằng phương pháp sử dụng chất gắn kết EDC là tương đương với phương
pháp sử dụng MBS. Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương pháp gắn kết
peptid với protein mang qua EDC l à một phương pháp gắn kết mới có hiệu quả
nhằm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch kháng peptit [12].
Năm 2002, Nakamura M. và cộng sự tại Nhật Bản đã nghiên cứu tạo ra kháng
thể đa dòng chống lại độc tố mu-conotoxin GIIIA. Mu-conotoxin GIIIA là một
độc tố peptit mạnh trong loài ốc nón, tính độc của nó gần bằng với tetrodotoxin.
Kháng thể đa dòng của conotoxin GIIIA được tạo ra bằng ph ương pháp cộng
hợp đặc hiệu mà chất kháng nguyên đã được khử độc nhưng vẫn giữ lại được vị
trí cấu trúc hoạt động của độc tố đối với kênh Na
+
. Protein mang được gắn với nó
là BSA (bovine serum albumin). Phương pháp nghiên c ứu này tạo ra một kháng
thể chống lại độc tố peptid sẽ l à ứng dụng cho những độc tố peptit khác [19].
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu cộng hợp độc tố tetrodotoxin (TTX)
Cá Nóc là loài cá bi ển có độc tính cao. Hiện nay ở một số n ước Châu Á như
Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc… cá Nóc vẫn được xem là một thực phẩm ưa
thích. Cá Nóc và độc tính cá Nóc đã được các nhà nghiên cứu trên Thế Giới quan
- 20 -
tâm, đặc biệt trong những năm gần đây các nhà khoa học Nhật Bản và Trung
Quốc đã tiến hành nhiều nghiên cứu về ứng dụng loại độc tố này.
Năm 1964 Johnson H .M. là người đầu tiên công bố thành công của ông trong

nghiên cứu cộng hợp độc tố TTX của lo ài ốc biển với protein mang để biến chất
có tính hapten thành m ột kháng nguyên nhân t ạo thông qua tác nhân cộng hợp là
formaldehyde. Nghiên c ứu của ông đã mở ra một hướng mới cho việc nghiên cứu
về miễn dịch của các hapten nói chung và TTX nói riêng [14].
Tiếp đó đến năm 1989, dựa trên cơ sở nghiên cứu của Johnson H.M. nhóm
nghiên cứu của Reachel I. Huot và Tran C.Chanh thuộc Labo nghiên cứu phát
triển về virut và miễn dịch học của Đại học Texas - Mỹ cũng đã nghiên cứu cộng
hợp thành công giữa độc tố TTX với protein mang là KLH (keyhole limpet
hemocyamin) để tạo kháng nguyên nhân tạo TTX-KLH theo đường
formadehyde. Kháng nguyên này được đem gây miễn dịch trên chuột BALB/c,
kết quả chuột BALB/c cho đáp ứng kháng thể kháng TTX. Sau đó sử dụng lách
của chuột có kháng thể để nghiên cứu thành công kháng thể đơn dòng kháng
TTX [24].
Năm 1991, nhóm nghiên c ứu của Bennett Kaufman thuộc Phòng quản lý
thuốc và thực phẩm của Trung tâm nghiên cứu đánh giá sinh học - Mỹ đã nghiên
cứu sản xuất kháng huyết thanh chống lại độc tố TTX trên thỏ. Với kháng
nguyên miễn dịch nhân tạo là TTX-Formaldehyde-KLH được làm bằng phương
cộng hợp giữa TTX với protein mang KLH (keyhole linpet hemocyanin) thông
qua formaldehyde. Kháng huy ết thanh này có khả năng bảo vệ được chuột khi
tiêm thử thách với TTX [11].
Năm 1995, nhóm nghiên cứu K. Matsumura thuộc Viện nghiên cứu sức khoẻ
của Nhật Bản đã thành công với việc tạo ra kháng thể đ ơn dòng chống lại độc tố
TTX. Kháng thể được tạo ra khi gây miễn dịch bằng kháng nguyên nhân t ạo
TTX trên thỏ. Kháng thể đơn dòng này có có thể trung hoà được độc tố TTX ở cả
trong ống nghiệm cũng như trên cơ thể sinh vật. Kết quả kiểm tra khả năng bảo
vệ của kháng thể khi ti êm thử thách trên chuột là rất tốt. Nghiên cứu cho thấy
rằng tỷ lệ sống sót của súc vật khi tiêm với liều gây chết là rất cao [18].
- 21 -
Năm 2004 nhóm nghiên cứu Qin-Hui Xu - Viện Dược lý và Độc chất học Bắc
Kinh - Trung Quốc đã nghiên cứu tạo ra kháng thể đa dòng bằng cách: Cho

hapten TTX cộng hợp với protein mang là TTH (Tachypleus Tridentatus
Hemocyanin) để tạo ra kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH theo con đường
formadehyde. Kháng nguyên này được gây miễn dịch trên chuột BALB\c để tạo
ra kháng thể. Người ta tiêm lên chuột đã được miễn dịch và chuột không được
miễn dịch với liều gây chết của TTX. Kết quả cho thấy rằng những chuột được
miễn dịch bằng kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH còn sống và những chuột
không được miễn dịch thì chết. Như vậy kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH đã
tạo đáp ứng miễn dịch trên chuột cho ra kháng thể đa dòng trung hoà được độc tố
TTX và bảo vệ được chuột sống. Qua kết quả nghiên cứu này họ đã đề xuất sản
xuất vacxin hoá học cho hapten TTX [23].
Năm 2005 nhóm nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu vacxin haptenic của
TTX và so sánh hai loại protein mang là TTH và TT. Bằng cách cộng hợp TTX
lần lược với 2 loại protein mang là Tachypleus tridentatus hemocyanin (TTH) và
tetanus toxoid (TT ) thông qua con đường formadehyde để tạo ra hai loại kháng
nguyên nhân tạo TTX – TTH và TTX – TT. Sau đó dùng hai loại kháng nguyên
này đem gây miễn dịch trên chuột BALB/c. Chuột sau miễn dịch được thử thách
với TTX với liều tiêm tăng dần 600, 630, 800, 1200, 1500, 2000 v à 2400g/kg.
Kết quả liều gây chết LD50 của nhóm chuột được miễn dịch với kháng nguyên
cộng hợp TTX-TTH là 2020g/kg, liều gây chết LD
50
của nhóm chuột được
miễn dịch với kháng nguyên cộng hợp TTX-TT là 1410g/kg. Còn nhóm chuột
đối chứng được miễn dịch với kháng nguyên là hai loại protein mang TTH v à TT
đều bị chết khi tiêm TTX với liều 600g/kg. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy
khả năng tạo kháng thể kháng độc tố TTX phụ thuộc rất nhiều vào protein mang
[22].
Năm 2006, vẫn là nhóm nghiên cứu của Qin-Hui Xu đã tiến hành nghiên cứu
hiệu quả của protein mang tác động l ên khả năng tạo kháng thể của kháng
nguyên nhân tạo protein mang – TTX. Dựa vào phương pháp nghiên c ứu của
Johnson H.M, nhóm này đã thành công trong vi ệc gắn TTX với lần l ược các

protein mang khác nhau: TTH - tachypleus tridentatus hemocyanin, LPH –
limulus polyphemus hemocyanin, TT – tetanus toxoid, DT – diphtheria toxoid,
- 22 -
BSA – bovine serum albumin thông qua con đường formaldehyde. Tạo ra lần
lượt các loại kháng nguy ên nhân tạo TTX-TTH, TTX-LPH, TTX-TT, TTX-DT
và TTX-BSA. Sau đó tiến hành gây miễn dịch trên chuột BABL/c, kháng thể đặc
hiệu và hiệu lực kháng độc tố đã được phát hiện. Tiến hành tiêm thử thách 3 x
liều gây chết (LD) của TTX vào các nhóm chuột đã được miễn dịch thì tỷ lệ sống
của các nhóm chuột nh ư sau: 92%, 75%, 42%, 8% và 0% tương ứng với kháng
nguyên nhân tạo mang protein –TTH, - TT, - LPH, -DT và - BSA. Như vậy
kháng thể kháng TTX đặc hiệu và hiệu lực kháng độc tố có trong huy êt thanh của
chuột được miễn dịch với kháng nguy ên TTX-TTH là tốt nhất và TTX-BSA là
thấp nhất. Những kết quả này gợi ý để sử dụng protein mang trong haptenic TTX
vaccine là rất quan trọng tron g việc tìm ra kháng thể kháng TTX có hiệu lực, v à
cả hai TTH và TT được lựa chọn làm chất mang cho sự phát triển xuất sắ c của
vacxin TTX thực nghiệm [21].
Thông qua việc tìm hiểu những nghiên cứu ở ngoài nước như trên, thấy rằng
việc tạo ra một kháng nguyên độc tố cá Nóc có chất l ượng là rất quan trọng để
tạo ra huyết thanh kháng độc tố cá Nóc . Do đó, bước đầu nghiên cứu thử nghiệm
với mục đích tạo ra đ ược kháng nguyên nhân tạo độc tố cá Nóc với hiệu suất cao
để gây miễn dịch, chúng tôi tiến hành làm đề tài: “So sánh hiệu suất cộng hợp
độc tố cá Nóc (Tetrodotoxin) với Toxoid Tetanus bằng hai ph ương pháp
Formaldehyde và Fluorosulfonyl benzoic acid” .
Đề tài thực hiện với các nội dung sau:
1. Cộng hợp TTX với protein mang TT thông qua Formaldehyde
2. Cộng hợp TTX với protein mang TT thông qua Fluorosulfonyl benzoic acid
3. So sánh hiệu suất cộng hợp của hai ph ương pháp trên
4. Định lượng hàm lượng TTX bằng phương pháp sinh hóa trên chu ột
- 23 -
Chương 2

VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
- 24 -
2.1. Vật liệu
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
 Tủ ấm – Memmer - Đức
 Tủ lạnh - Toshiba
 Máy khuấy từ - Biotech
 Máy đông khô - CHRIST
 Cột sắc ký – Pharmacia
 Máy đo quang phổ kế - Ultrospec 2000 – Pharmacia Biotech
 Máy chỉnh pH – Denver Instrument.
 Bộ sắc ký lọc gel – Pharmacia.
 Micropipet 20l, 100 l, 200 l và 1000 l – Gilson.
 Lọ penicilin 10ml - Việt Nam
 Micro tube - eppendof
 Bơm tiêm 0.5ml - Việt Nam.
 Cốc thủy tinh 100ml, 250 ml - Duran
 Túi thẩm tích Spectra/Por
R
- Mỹ.
Hình 2.1: Máy đo quang phổ
- 25 -
2.1.2. Vật liệu và hóa chất
 Tetrodotoxin (TTX) đông khô đ ã được tinh chế từ phòng nghiên cứu viện
vacxin Nha Trang v à TTX của Nhật Bản lô 7455.
 Giải độc tố uốn ván Tetanus toxoid (TT) - Viện vacxin Nha Trang s ản xuất.
 Súc vật thí nghiệm: Chuột Swiss trắng trọng lượng 19 – 20 g.
 Gel sắc ký Bio-Gel


P-2– Bio-Rad.
 Formaldehyde 35% - Merck
 Fluoro-sulfo benzoic acid – Merck
 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide ( EDC) - Novabiochem
 2 - Propanol - Sigma
 Sulfo-N-hydroxysuccinimide – PIERCE
 NaH
2
PO
4
- Merck
 Na
2
HPO
4
- Merck
 Na
3
PO
4
- Merck
 HCl – Merck
 Nước cất.
 NaCl – Meck
Hình 2.2: Chuột Swiss trắng thí nghiệm trọng lượng 19-20 gam