thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối saccharomyces carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên

1

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đề tài này
Trước hết tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu - Trường
Đại học Nha Trang, Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác Quốc tế, Ban Chủ
nhiệm Khoa Chế biến, Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo
điều kiện về kinh phí và cơ sở vật chất cho tôi thực hiện đề tài này.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học
Nha Trang và Cử nhân Ngô Anh Tiến đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cám ơn: TS. Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS.TS.
Trần Thị Luyến, PGS.TS. Lương Đức Phẩm - Viện Công nghệ Sinh học Việt
Nam, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và
Môi trường và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để
công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: cô Ths. Khúc Thị
An, các quý thầy cô giáo phòng Thí nghiệm Hóa sinh – Vi sinh, phòng Thí
nghiệm Công nghệ Chế biến - Khoa Chế biến và Viện Công nghệ Sinh học -
Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi
trong quá trình nghiên cứu.

Sinh viên
Bùi Thị Phượng

2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS) 2
1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men 2
1.1.2. Đặc tính sinh lý tế bào nấm men 6
1.2. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY THU SINH KHỐI VI SINH
VẬT 12
1.2.1. Khái niệm về protein đơn bào 14
1.2.2. Giới thiệu về ứng dụng của sinh khối vi sinh vật 14
1.3. GIỚI THIỆU MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN DÙNG LÀM MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY TĂNG SINH S.CARLSBERGENSIS 16
1.3.1. Đậu tương 16
1.3.2. Cám gạo 18
1.3.3. Khoai tây 19
1.3.4. Bột ngô 19
1.3.5. Giá đậu xanh 20
1.3.6. Bắp cải 21
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 22
2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật 22
2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy nấm men 23



3

2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 23
2.3.2.2. Phương pháp hoạt hóa S.carlsbergensis từ đông khô 25
2.3.2.3. Thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa S.carlsbergensis
bằng môi trường Hansen 28
2.3.2.4. Thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối bằng MTTN 29
2.3.2.5. Phương pháp giữ giống và cấy chuyền 33
2.3.2.6. Phương pháp nhân giống, lên men và thu sinh khối 35
2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 36
2.5. CÁC DỤNG CỤ THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG ĐỀ
TÀI 36
2.5.1. Các dụng cụ thiết bị chủ yếu 36
2.5.2. Các loại hóa chất 36
2.6. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO HOẠT HÓA S.CARLSBERGENSIS
BẰNG MÔI TRƯỜNG HANSEN 37
3.1.1. Xác định thời gian hoạt hóa cho S.carlsbergensis 37
3.1.2. Xác định pH thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis 38
3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis 39
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI TĂNG SINH
KHỐI BẰNG MTTN 40
3.2.1. Xác định môi trường nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 40
3.2.2. Xác định tỷ lệ cơ chất pha MT6 cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 41

3.2.3. Xác định tỷ lệ đường Saccharose bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh
S.carlsbergensis 42
3.2.4. Xác định tỷ lệ dịch tự thủy phân nấm men bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh
S.carlsbergensis 43
3.2.5. Xác định tỷ lệ một số khoáng bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44
3.2.5.1. Xác định hàm lượng MgSO
4
bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44
3.2.5.2. Xác định hàm lượng K
2
HPO
4
bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh
S.carlsbergensis 45
3.2.6. Xác định thời gian nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis 46



4

3.2.7. Xác định pH nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis 47
3.3. THỬ NGHIỆM LÀM KHÔ SINH KHỐI NẤM MEN 48
3.4. ĐỀ XUẤT NUÔI THU SINH KHỐI S.CARLSBERGENSIS 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC

5

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT TÊN BẢNG TRANG
1 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nấm men 7

2 Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid trong đậu tương tách dầu 16

3 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong chất béo đậu tương 17

4 Bảng 1.4. Hàm lượng chất vô cơ trong đậu tương 17

5 Bảng 1.5. Hàm lượng vitamin trong đậu tương 18

6 Bảng 1.6. Bảng hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cải bắp 21

7 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của men sau sấy 48

8 Bảng 3.2. Bảng hàm lượng protein hòa tan của S.carlsbergensis 53

9 Bảng 3.3. Bảng biểu hiện lượng sinh khối thu hồi của
S.carlsbergensis

53









6

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT TÊN HÌNH TRANG
1 Hình 1.1. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men 2
2 Hình 1.2. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 3
3 Hình 1.3. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 6
4 Hình 2.1. Sơ đồ chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men 24
5 Hình 3.1. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 37
6 Hình 3.2. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH nuôi cấy 38
7 Hình 3.3. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo nhiệt độ nuôi cấy 39
8 Hình 3.4. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo môi

trường nuôi cấy

40
9 Hình 3.5. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cơ chất pha môi

trường nuôi
cấy

41
10 Hình 3.6. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ đường saccharose 42
11 Hình 3.7. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cao nấm men bổ sung 43
12 Hình 3.8. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng MgSO
4
bổ sung 44
13 Hình 3.9. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng K
2
HPO
4
bổ sung 45
14 Hình 3.10. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 47
15 Hình 3.11. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH của môi trường nuôi 48
16 Hình 3.12. Hình ảnh
Saccharomyces carlsbergensis
nhuộm tiêu bản sống nuôi trên
môi trường Hansen
52
17 Hình 3.13. Hình ảnh
Saccharomyces carlsbergensis
nhuộm tiêu bản sống nuôi trên
môi trường nghiên cứu
52




7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

MT: môi trường
MTTN: môi trường tự nhiên
MT1: môi trường nước chiết bột ngô
MT2: môi trường nước chiết cám gạo
MT3: môi trường nước chiết bắp cải
MT4: môi trường nước chiết khoai tây
MT5: môi trường nước chiết bột đậu tương
MT6: môi trường nước chiết giá đậu xanh
v/p: vòng/phút

1

MỞ ĐẦU
Nấm men là một trong số những vi sinh vật dùng trong sản xuất sinh khối
protein (SCP – Single cell protein) do tế bào rất giàu protein và có khả năng sinh
trưởng phát triển nhanh, dễ tách thu sinh khối sau khi nuôi sinh khối. Việc nuôi sinh
khối vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng hiện nay thường dùng bằng môi
trường nuôi nhân tạo hoặc một số nguyên liệu thông thường như rỉ đường, bã
rượu…Để góp tìm hiểu khả năng sử dụng môi trường tự nhiên trong việc nuôi sản
xuất sinh khối nấm men để sản xuất sinh khối nấm men dùng trong chăn nuôi chúng
tôi tiến hành: “Thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối Saccharomyces carlsbergensis
bằng môi trường tự nhiên”.
Nội dung của đề tài
1) Nghiên cứu tìm các điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa chủng
S.carlsbergensis.
2) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi để thu nhận sinh khối
nấm men S.carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên.
3) Thu nhận sinh khối nấm men và đánh giá sơ bộ sinh khối thu nhận.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm phong phú thêm về môi trường
nuôi cấy vi sinh vật để thu hồi sinh khối nói riêng và cho việc ứng dụng nuôi sinh
khối nấm men (S.carlsbergensis) nói riêng. Từ đó thu nhận sinh khối nấm men để

sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay nuôi trồng thủy sản hay sử dụng làm nguyên
liệu cho quá trình thủy phân sản xuất bột đạm, hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến
thực phẩm.
Do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu, vận dụng kiến thức đã học
vào thực hành, năng lực và thời gian có hạn nên em không thể tránh khỏi những
thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề
tài được hoàn thiện hơn.




2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS)
Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) chỉ là tên chung để chỉ nhóm vi nấm
thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi
(budding). Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng có
thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota).
1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men
Nấm men loài Saccharomyces carlsbergensis thuộc giới Eumycophyta (nấm),
lớp Ascomycetes, bộ Endomycetes, họ Saccharomycetaceae, giống Saccharomyces,
loài carlsbergensis.
− Hình dạng tế bào nấm men [8]
Hình dạng tế bào của nấm men S.carlsbergensis chủ yếu là hình cầu. Tuy
nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều
kiện nuôi cấy.

Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của Saccharomyces carlsbergensis
− Kích thước tế bào nấm men.

Tế bào nấm men S.carlsbergensis thường có kích thước rất lớn gấp từ 5
÷
10
lần tế bào vi khuẩn.
Kích thước trung bình


3

+ Chiều dài: 9
÷
10
µ
m
+ Chiều rộng: 2
÷
7
µ
m
Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các ở các lứa tuổi khác nhau và
điều kiện nuôi cấy khác nhau.
− Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Tế bào nấm men
S.carlsbergensis cũng như nhiều loại tế bào nấm men khác được cấu tạo chủ yếu từ
các phần cơ bản như sau:

N= nhân; M= ty thể; Va= không bào; ER= mạng lưới nội chất; Ves= bào nang
Hình 1.2. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men [17]
Vỏ tế bào
Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể
đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và
chất độc. Vỏ tế bào nấm men có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh
các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi
qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào.
Thành phần hóa học của vỏ tế bào gồm có các phức chất protein – polysacarit,
phosphate và lipit. Vỏ tế bào dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% khối lượng tế
bào.
Màng tế bào chất
Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày
không quá 0,1nm dính chặt với tế bào chất. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ


4

bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường
vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực
hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu
trú một số enzyme và cơ quan tử của tế bào (như roboxom).
Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của màng.
Mạng lưới nội chất (dictyosome)
Trong tế bào chất của nấm men còn chứa một hệ thống màng hai lớp, được gọi
là mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng
có kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và rồi có thể
từ đây tạo thành không bào. Mạng lưới này còn được gọi là thể golgi hay bộ máy
golgi.
Nhân tế bào: nhân là cấu tử bất biến của tế bào nấm men

Nhân của tế bào nấm men có vỏ màng, hạch nhân (thể nhiễm sắc – karyokon)
và chất nhân (karyoplasma). Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các quy trình trong
nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường
bên ngoài, cũng như giữa nhân với tế bào chất.
Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2
µ
m. Phần lớn nhân có
dạng hình cầu hoặc elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể thay đổi trong
suốt quá trình sống của tế bào. Kính thước nhân của tế bào nấm men không đồng
nhất ở các trạng thái sinh lý khác nhau. Ở tế bào nấm men đang sinh trưởng nhân rất
giàu acid nucleic và vùng sinh sản được hoạt hóa (nơi sẽ mọc chồi hoặc phân cắt tế
bào).
Thành phần hóa học cơ bản của nhân là acid dezoxinucleic (AND) có vai trò
truyền thông tin từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nhân còn có protein nhưng không
liên kết với các acid nucleic. Quá trình sinh tổng hợp protein và đặc điểm các
protein này được tiến hành theo lệnh của AND nhờ các acid ribonucleic truyền đạt
và vận chuyển (mARN và tARN). Hàm lượng AND trong tế bào bất kỳ là ổn định
nghiêm ngặt và không phụ thuộc vào các điều kiện của môi trường bên ngoài, vào
dinh dưỡng cũng như các yếu tố khác.



5

Ty thể (Mitochondria hay Chondrixom)
Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố đều trong tế
bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Chiều dài của sợi ty thể là 0,2
÷

7,5

µ
m. Hình dạng của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các
hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết thành chuỗi.
Những chất dinh dưỡng thấm vào nội bào được hấp thụ và tích lũy bởi ty thể
sẽ nhanh chóng thành dạng đậm đặc nhờ các enzyme tương ứng tham gia. Các phản
ứng năng lượng quan trọng – quá trình phosphosyl hóa có oxy tham gia và các phản
ứng của chu trình Krebs xảy ra hoàn toàn trong ty thể.
Ty thể của nấm men có cấu tạo chủ yếu từ khoảng 30% chất béo và 60
÷
70%
protein. Trong số protein này có khoảng 25
÷
75% ở dạng protein cấu trúc. Trong
ty thể có chứa các enzyme thực hiện các phản ứng oxy hóa trong chu trình Krebs,
chuyển điện tử qua chuỗi hô hấp và quá trình phosphoryl hóa để thực hiên chức
năng cung cấp năng lượng sinh học và vật liệu tham gia vào các cơ chế phức tạp tái
tạo ADN, phiên mã và dịch mã các thông tin di truyền vào sinh tổng hợp
phospholipid của sterin, vào hoạt hóa các acid béo
Không bào (vacuole)
Không bào là một cơ quan nội bào có dạng hang (hốc) chứa đầy dịch bào và
được tách ra từ tế bào chất thành màng không bào. Trong dịch bào ngoài các chất
điện ly hòa tan trong nước còn có các hợp chất dạng keo như protein, chất béo,
hydratcacbon và các enzyme chứa nguyên tử riêng biệt hoặc muối. Không bào có
chứa các enzyme thủy phân, enzyme oxy hóa – khử, các polyphosphat, lipit, các
hợp chất trung gian của tế bào có phân tử lượng thấp và các ion kim loại. Các quá
trình oxy hóa – khử xảy ra trong dịch bào.
Hình dạng và kích thước không bào thay đổi liên tục, chuyển dịch và tiếp xúc
với tế bào chất. Một tế bào nấm men có thể có một hoặc một vài không bào ở trung
tâm. Không bào chứa các ti thể vùi rất đa dạng, có thể là các chất ở dạng hòa tan, ở
dạng tinh thể hay ở dạng hạt hoặc giọt. Không bào của nấm men trưởng thành

thường lớn hơn khi ở tế bào trẻ. Tuy nhiên, ở một thời điểm của vòng đời khi nẩy
chồi mới bắt đầu thì hình như không bào được chia thành nhiều không bào nhỏ và


6

một số trong đó được chuyển sang tế bào con. Sau đó các không bào còn lại có xu
hướng tái hợp thành một không bào duy nhất.
1.1.2. Đặc tính sinh lý tế bào nấm men
* Sự sinh sản của nấm men S.carlsbergensis: hầu hết các tế bào nấm men
S.carlsbergensis khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi. Các tế bào
mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu vỏ sang tế bào con, mà ở chỗ các mấu chồi
sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ tế bào và tích tụ ở đây để chuyển sang cho tế bào con.
Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào. Khi chồi non tách khỏi
tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết
sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển
thành tế bào già theo thời gian.

Hình 1.3. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men [17]
* Thành phần hóa học của tế bào nấm men [8]
Thành phần sinh khối khô của tế bào nấm men nhìn chung bao gồm:
− Nước: 75
÷
85%
− Chất khô: 15
÷
25%. Trong đó chất khoáng chiếm 2
÷
14% hàm lượng
chất khô.

Thành phần hóa học của tế bào nấm men nếu tính theo các nguyên tố cấu
thành sẽ là (% theo trị số trung bình):



7

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nấm men
Các chất Thành phần (% chất khô)
Cacbon 47
Hydro 65
Nito 5
÷
10
Photpho 1.6
÷
3.5

Hàm lượng các nguyên tố không phải đa lượng

Canxi 0.3
÷
0.8
Kali 0.5
÷
2.5
Magiê 0.1
÷
0.4
Natri 0.06

÷
0.2
Các nguyên tố vi lượng (mg/kg)
Sắt 90
÷
350
Đồng 20
÷
135
Kẽm 100
÷
160
Mo 15
÷
65

• Protein: nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng
50% (tính theo chất khô) và khảng 45% protein hoàn chỉnh. Protein của nấm men
chứa không ít hơn 20 amino acid và có tất cả các amino acid không thay thế.
• Chất béo: chất béo trong tế bào nấm men có các acid oleic, linoelic,
palmitric. Trong chất béo có tới 30
÷
40% phosphatit.
• Tro: trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P
2
O
5
khoảng
25
÷

60, CaO 1
÷
8, MgO 4
÷
6, SiO
2
1
÷
2, Fe
2
O
3
0.05
÷
0.7.
• Phospho: trong tế bào nấm men thấy ortho
-
, pyro
-
và metaphosphat ở
dạng hữu cơ và vô cơ.




8

* Dinh dưỡng nấm men
Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của nấm
men. Trong môi trường có thể chia thành 4 nhóm thành phần chủ yếu là: nguồn

dinh dưỡng cacbon; nguồn nitơ dinh dưỡng; các nguồn khoáng đa lượng, trung
lượng và vi lượng; nguồn các chất sinh trưởng.
− Dinh dưỡng cacbon
Nấm men S.carlsbergensis không có enzyme polyhydrolase trong đó có
amylase và cellulose. Vì vậy, S.carlsbergensis không sử dụng được trực tiếp tinh
bột cũng như cellulose. Nên nguồn cacbon dinh dưỡng chủ yếu là các loại đường
như: mật rỉ đường, saccharose, maltose, glucose…
− Dinh dưỡng nitơ
Nguồn nitơ cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitơ của tế bào là các hợp
chất hữu cơ hoặc vô cơ. Nấm men S.carlsbergensis không có men ngoại bào để
phân giải protein, nên phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc
vô cơ. Đạm hữu cơ thường dùng là amino acid, pepton, amid từ dịch thủy phân các
loại khô dầu (đậu tương, lạc, bông, hướng dương) và thịt, cá, nước chiết nấm men
và cao men, nước chiết ngô và cao ngô…Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat,
sulfat…
− Các các nguồn khoáng đa lượng, trung lượng và vi lượng.
Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men
+ Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều
enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết
có năng lượng lớn. Nồng độ các nguồn phospho quá cao cũng làm cho vi sinh vật
phát triển kém và giảm hiệu suất sinh tổng hợp. Trong phòng thí nghiệm vi sinh
người ta thường dùng muối KH
2
PO
4
và K
2
HPO
4
làm nguồn P và K.

+ Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số amino acid, albumin, vitamin
và enzyme. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH
4
)
2
SO
4
làm nguồn
amon và nguồn lưu huỳnh.
+ Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men.


9

+ Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác.
+ Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men,
tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid
pyruvic.
+ Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
− Nguồn các chất sinh trưởng gồm các vitamin, các amino acid, peptit
Trong thực tế sản xuất người ta có thể dùng nguồn chất sinh trưởng là cao ngô,
cao nấm men, dịch tự thủy phân, dịch chiết từ rau quả, giá đỗ, dịch thủy phân từ
protein
* Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men
Nấm men S.carlsbergensis hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt,
các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo
hai con đường cơ bản là:
− Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những
lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi
trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi

cũng được thải ra theo con đường này.
− Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm
nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permease hoạt hóa.
Permease là một protein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành
hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và
permease lại tiếp tục vận chuyển tiếp.
* Quá trình sinh trưởng và phát triển
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm
men S.carlsbergensis tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy
nhiều cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết ở trong môi trường giảm tới mức
thấp nhất. Khi đó sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và ngừng hẳn.
Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay
người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:


10
+ Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi
hay gián tiếp trên mặt thạch.
+ Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy…
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5
giai đoạn:





Hình 1.4. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men
• Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh
khối chưa tăng nhiều.
• Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào

ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men.
• Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần
dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.
• Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh
sản bằng tốc độ chết.
• Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số
lượng tế bào nấm men giảm dần.
* Các hình thức hô hấp của nấm men
Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy ý. Chúng có thể sống ở điều kiện hiếu khí
cũng như kỵ khí. Chính vì thế chúng có hai kiểu hô hấp khác nhau, tùy thuộc vào
điều kiện có đủ oxy cung cấp cho chúng hay không. Vì vậy, khi nuôi cấy nấm men
ở điều kiện tĩnh, có nghĩa là không sục khí, thì thời gian đầu nấm men sinh trưởng ở
điều kiện khí và lượng oxy hòa tan cạn dần nấm men chuyển sang hô hấp kỵ khí.

N


11
Hô hấp hiếu khí:
C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
6CO
2
+ 6H

2
O + 674 cal
Hô hấp kị khí:
C
6
H
12
O
6
2CH
3
CH
2
OH + 2CO
2
+ 33 cal
* Những nhân tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men
Các yếu tố ảnh hưởng ở đây là: nhiệt độ, oxy hòa tan hay độ hiếu khí, pH môi
trường, thời gian nuôi, thành phần môi trường, các sản phẩm tạo ra trong môi
trường nuôi và các điều kiện khác của môi trường nuôi cấy.
• Nhiệt độ
Một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm
men là nhiệt độ. Đối với sinh trưởng nấm men S.carlsbergensis nhiệt độ tối thích
vào khoảng 24
÷
36
0
C. Khi nhiệt độ thấp thì sinh trưởng kém.
• Oxy hòa tan – độ hiếu khí
Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxy hòa tan trong môi trường, đơn vị

tính là mg O
2
/lít môi trường. Ở nhiệt độ càng cao lượng oxy hòa tan trong dịch càng
thấp. Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản
của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong môi trường có
khuấy trộn thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn. Do đó tế bào
nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn.
• pH của môi trường
pH của môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng tới đời sống của nấm men. pH quá
cao hoặc quá thấp đều gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và sinh trưởng của
nấm men. pH thích hợp cho S.carlsbergensis phát triển là: 4.2
÷
6.2.
• Thời gian nuôi cấy
Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi
chất dinh dưỡng cần thiết trong môi trường giảm tới mức thấp nhất. Khi đó sự sinh
trưởng và phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần
phân chia nữa, nhưng sự tăng sinh khối không đáng kể. Thời gian thích hợp để nuôi
cấy tăng sinh cho S.carlsbergensis là 24
÷
36 giờ.


12
1.2. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY THU SINH KHỐI VI
SINH VẬT
1.2.1. Khái niệm về protein đơn bào
Protein đơn bào là một thuật ngữ được gọi theo quy ước dùng để chỉ vật chất
tế bào vi sinh vật được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật. Thuật ngữ này
không hoàn toàn chính xác, vì thông thường sản phẩm được tạo ra không phải là

một protein thuần khiết mà là các tế bào đã được xử lý thuộc nhiều loại vi sinh vật
khác nhau, cả đơn bào lẫn đa bào, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo.
• So với sản xuất các protein truyền thống, sản xuất SCP có những ưu
thế sau:
− Tốc độ sản xuất cao
− Hàm lượng protein cao (30
÷
80% tính theo trọng lượng khô)
− Có thể dùng các nguồn cacbon khác nhau
− Các chủng có năng suất cao và thành phần tốt: dễ kiếm, dễ chọn
− Diện tích sử dụng không lớn, cho sản lượng cao
− Không phụ thuộc vào mùa vụ, khí hậu
• Các bước của một quá trình sản xuất SCP bao gồm:
− Chuẩn bị nguồn cacbon
− Chuẩn bị môi trường thích hợp chứa nguồn cacbon và các nguồn nitơ,
photpho, và các chất dinh dưỡng khác
− Ngăn ngừa sự nhiễm tạp môi trường hoặc thiết bị sản xuất
− Cấy vi sinh vật mong muốn
− Tách sinh khối tế bào vi sinh vật khỏi môi trường nuôi cấy
− Xử lý để thu được sinh khối tinh
Trong đó cần chú ý những vấn đề sau:
Nuôi cấy: lên men diễn ra dưới điều kiện vô trùng hoặc điều kiện sạch cần
phải có các biện pháp để trách tạp nhiễm ở các điểm sau:


13
− Môi trường, thiết bị: đun nóng hoặc lọc các thành phần môi trường và
khử trùng các thiết bị lên men.
− Thông khí (các quá trình sản xuất SCP cần thông khí mạnh).
− Hệ thống làm lạnh (loại bỏ nhiệt sinh ra trong quá trình sinh vật phát

triển).
Tuyển chọn vi sinh vật
Một vi sinh vật được sử dụng cho mục đích sản xuất SCP làm nguồn protein
cho người hoặc động vật cần phải có một số đặc điểm cơ bản:
− Không gây bệnh cho động thực vật và người.
− Có giá trị dinh dưỡng cao.
− Được chấp nhận như là một loại thực phẩm hoặc thức ăn gia súc.
− Không chứa các chất độc.
− Giá thành sản xuất thấp, giá thành sản xuất phụ thuộc vào:
+ Tốc độ sinh trưởng, sản lượng, hàm lượng protein
+ Có đòi hỏi các chất dinh dưỡng bổ sung hay không
+ Có ưu thế phát triển chọn lọc trên môi trường sản xuất
+ Dễ tách và làm khô
Hệ vi sinh vật dùng nuôi cấy trong sản xuất SCP
− Vi khuẩn: Lactobacillus fermentus, Bacillus subtilis…
− Tảo: Chlorella, Scenedesmus, Spirulina…
− Nấm men: Saccharomyces, Candida, Torlopsis…
− Nấm sợi: Aspergilus oryzae, Trichoderma reesei…
− Nấm ăn: nấm mỡ, nấm hương, mộc nhĩ…





14
1.2.2. Giới thiệu về ứng dụng của sinh khối vi sinh vật
Công nghệ thu sinh khối vi sinh vật là các quá trình nuôi cấy các chủng thuần
khiết hoặc hỗn hợp vài chủng để thu khối lượng tế bào khi sinh trưởng với các đặc
điểm sau:
− Sinh khối làm nguồn protein dùng trong dinh dưỡng động vật là những tế

bào vi sinh vật, kể cả sinh khối tảo, đã sấy khô và chết, giàu protein, vitamin nhóm
B và khoáng chất. Nguồn sinh khối này được gọi là protein đơn bào.
− Thu sinh khối nấm men là những tế bào sống để sản xuất bánh men –
men bánh mỳ, bột nở làm bánh gato, sinh khối vi khuẩn lactic sống có hoạt tính
enzemy tiêu hóa để sản xuất các thuốc trợ tiê hóa như biolactovin, men tiêu hóa
− Thu sinh khối cố định làm phân bón vi sinh: các loại phân bón vi sinh
với vi khuẩn sống tự do trong đất và sống cộng sinh với cây họ đậu, hoặc các nhóm
vi khuẩn khác có hoạt tính chuyển hóa phophot không tan thành dạng tan dùng làm
phân bón
− Thu sinh khối vi khuẩn có độc tố đối với các loại sâu thân mềm phá hoại
rau màu hoặc các chế phẩm vi nấm có khả năng diệt sâu mềm, sâu róm, mối để
sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.
− Thu sinh khối vi sinh vật có hệ enzyme phân giải các chất hữu cơ kể cả
thuốc trừ sâu và hydrocacbua ; để sản xuất các chế phẩm vi sinh xử lý nước thải và
ô nhiễm trong bảo vệ môi trường.
Sản xuất sinh khối nấm men
Sinh khối nấm men cũng được nuôi để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi do sinh
khối nấm men giàu nguồn protein – vitamin. Sản phẩm này thường được gọi là men
gia súc hay men thức ăn chăn nuôi hoặc còn gọi là nguồn protein đơn bào (SCP).
Sinh khối nấm men của loại nấm men Saccharomyces còn sống, có khả năng lên
men rượu được dùng thêm vào thức ăn tươi cho heo (rau, cám, bã rượu gạo ) để ủ
thức ăn với mục đích tạo hương thơm và có thể làm cho thức ăn dễ tiêu hóa hơn.
Sản xuất protein nấm men được tiến hành từ đầu thế kỷ XX ở Đức (Del Bruck,
1916) với phương pháp nuôi Candida utilis trên rỉ đường, sau đó năm 1936 được


15
tiến hành sản xuất lớn trên cơ sở nuôi trong dịch kiềm sulfit – dịch thải của công
nghiệp cellulose, ở Mỹ năm 1946 mới sản xuất sinh khối nấm men và đến nay nhiều
nước trên thế giới đã tổ chức sản xuất loại sản phẩm này dùng chủ yếu cho chăn

nuôi và có thể tách làm tinh sạch protein dùng trong dinh dưỡng cho người – làm
thức ăn nhân tạo hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm.
Vấn đề giải quyết sự thiếu hụt protein trong khẩu phần thức ăn chăn nuôi gia
súc và gia cầm là một nhiệm vụ rất quan trọng đối với nền kinh tế quốc dân. Cân
đối được dinh dưỡng chăn nuôi sẽ có hiệu quả kinh tế to lớn. Một trong các biện
pháp hữu hiệu giải quyết sự thiếu hụt protein này là tăng cường sản xuất sinh khối
nấm men.
Sinh khối nấm men sau khi thu được thường đem đi sấy khô bằng phương
pháp sấy phun hoặc sấy trục trống quay.
Sấy phun: gồm một buồng sấy hình trụ đầu dưới hình nón (đường kính 8
÷
10,
phần trụ cao 5.5
÷
7m, phần nón 6.6
÷
8.7m). Phần bên trong trên đỉnh buồng sấy
lắp hệ thống phun. Khí nóng hỗn hợp với không khí theo ống ở trung tâm buồng
phía dưới đĩa phun làm nóng buồng sấy. Khí thừa sẽ qua cyclon khí ra ngoài.
Nhiệt của khí nóng đưa vào buồng sấy tới 280
÷
300
0
C, ở cửa ra của sấy là
85
÷
95
0
C. Huyền phù nấm men qua sấy chỉ khoảng vài giây. Nấm men được đưa
nóng lên không quá 95

0
C.
Sấy trống quay: gồm có hai dãy ống trụ hình trống, dưới mỗi dãy là các máng.
Huyền phù nấm men được đưa vào dãy máng bám vào trống thành màng mỏng khi
hai trống xoay tròn ngược chiều nhau (6
÷
8 vòng/phút). Hơi nóng được đưa vào
bên trong trống và phần dưới trụ trống ngập vào huyền phù men (mỗi vòng ngập
khoảng 8
÷
10 giây), như vậy men được sấy đến độ ẩm không quá 10%. Phía trên
trống lắp 1 lưỡi dao mỏng để gạt men khô. Men khô đưa đi đóng bao.




16
1.3. GIỚI THIỆU MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN DÙNG LÀM
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TĂNG SINH S.CARLSBERGENSIS
Các nguyên liệu tự nhiên dùng để pha môi trường dịch thể để nuôi cấy nấm
men S.carlsbergensis là: bột đậu tương được xay từ đậu tương, bột cám gạo xay ra
từ thóc, khoai tây, bắp cải, bột ngô xay từ hạt ngô vàng, giá đậu xanh. Chọn các
nguyên liệu này làm môi trường nuôi cấy S.carlsbergensis vì chúng rất giàu dinh
dưỡng cung cấp cho S.carlsbergensis tăng sinh cụ thể:
1.3.1. Đậu tương [9]
Chọn đậu tương làm môi trường nuôi cấy do thành phần các chất dinh dưỡng
trong đậu tương (g/100g) là: nước: 8, protein: 40.9, chất béo: 18.5, tro: 4.8.
• Protein: protein trong đậu tương khoảng 40%. Giá trị protein đậu tương
rất cao với 86
÷

88% là protein tan trong nước. Protein trong đậu tương là loại
protein có chất lượng cao và hàm lượng các loại amino acid là toàn diện.
Hàm lượng amino acid trong đậu tương tách dầu được thể hiện trong bảng 1.2:
Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid trong đậu tương tách dầu
Amino acido acid Hàm lượng (g/16g)
Lysin 6.9
Leucinn 7.7
Valin 5.4
Isoleucin 5.1
Threonin 4.3
Phenylalanin + tyrosin 8.9
Methyoni + cysin 3.2
Tryptophan 1.3
• Chất béo: chất béo trong đậu tương khoảng 20%. Các loại acid béo trong
chất béo đậu tương có trên 10 loại, trong đó hàm lượng chất béo không no trên
60%. Thành phần acid béo trong chất béo đậu tương được thể hiện trong bảng 1.3:


17
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong chất béo đậu tương
• Chất đường bột: chất đường bột trong đậu tương khoảng 25% với thành
phần phức tạp, trong đó chủ yếu là đường saccharose, đường lupeose, đường
verbascose, đường arabinoglactan (là loại đường đa). Tinh bột rất ít khoảng 0.4
÷

0.9%. Chất đường bột trong đậu tương có 2 loại ở dạng tan hoặc không tan.
• Chất vô cơ: có trên 10 loại. Hàm lượng chất vô cơ trong đậu tương được
thể hiện trong bảng 1.4:
Bảng 1.4. Hàm lượng chất vô cơ trong đậu tương

Acid béo Loại Tỷ lệ (%)
Acid msyristic Acid béo no < 0.5
Acid palmic Acid béo no 7
÷
12
Acid stearic Acid béo no 2
÷
5.5
Acid arachic Acid béo no < 1.0
Acid behenic Acid béo no < 0.5
Acid palmitoleic Acid béo không no < 0.5
Acid oleic Acid béo không no 20
÷
50
Acid linonic Acid béo không no 35
÷
60
Acid linolenic Acid béo không no 2
÷
13
Acid arachidonic Acid béo không no < 1.0
Nguyên tố Tỷ lệ (%) Nguyên tố Tỷ lệ (%)
Kali 1.67 Chlor 0.02

Photpho 0.66 Sắt 0.01
Lưu huỳnh 0.41 Đồng 0.0012
Natri 0.34 Mangan 0.0028
Canxi 0.28 Kẽm 0.0022
Magie 0.22 Alumin 0.0007



18
• Vitamin: trong đậu tương có nhiều vitamin, với nhiều chủng loại, chủ
yếu là vitamin tan trong nước. Hàm lượng vitamin trong đậu tương (mg/100g) được
thể hiện trong bảng 1.5:
Bảng 1.5. Hàm lượng vitamin trong đậu tương

Loại vitamin Hàm lượng (mg/100g)
B
1
0.9
÷
1.6
B
2
0.2
÷
0.3
B
6
0.6
÷
1.2

C 2.1
E 20
Caroten 0.08

Với các chất dinh dưỡng trên thì có thể chọn đậu tương làm môi trường nuôi
cấy vi sinh.
1.3.2. Cám gạo
Cám được sản xuất từ hạt thóc (hạt lúa) xay ra.
Chọn cám làm môi trường nuôi cấy vì cám có những tính chất sau:
Hạt lúa gồm [5]:
− Vỏ trấu: 19
÷
21% cấu tạo từ cellulose kết chặt lại nhờ chất khoáng
lignin.
− Vỏ quả: 5
÷
6% khối lượng hạt, trong thành phần vỏ quả có có cellulose,
pentose, pectin và tro.
− Vỏ hạt: 1
÷
2.5% khối lượng hạt. Vỏ hạt chứa ít cellulose hơn nhưng lại
nhiều hợp chất nitơ và đường hơn vỏ quả.
− Lớp alơrông: 6
÷
12% khối lượng hạt, rất giàu protein (35
÷
45%), đường
(6
÷
8%), chất béo (8

÷
9%), vitamin và tro (11
÷
14%), cellulose (7
÷
10%) và
pentose (15
÷
17%).