xác định type vi khuẩn pasturella multocida bằng kỹ thuật pcr
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.65 MB, 66 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
XÁC ĐỊNH TYPE
VI KHUẨN PASTURELLA MULTOCIDA BẰNG
KỸ THUẬT PCR
Giáo viên hướng dẫn: TS. VŨ NGỌC BỘI
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ DUYÊN
MSSV : 47135059
NHA TRANG, 2009
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước tiên em xin gửi tới Ban giám
hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và
Môi trường, phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học lòng biết ơn, niềm tự hào
được học tập tại trường trong những năm qua.
Lòng biết ơn sâu sắc xin được giành cho thầy TS. Vũ Ngọc Bội – Phó
Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, TS. Lê Lập – Trưởng bộ
môn Nghiên cứu vi trùng Phân viện Thú y miền Trung, Ths. Đào Duy Hưng,
Bác sĩ Đặng Thanh Hiền, Bác sĩ Trương Công Thôi – Bộ môn nghiên cứu vi
trùng Phân viện Thú y miền Trung.
Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Tân – Viện trưởng Phân viện
Thý y miền Trung, cùng toàn thể các cán bộ tại Phân viện Thú y miền Trung
đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian thực tập vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện
Công nghệ sinh học và Môi trường, Ths. Khúc Thị An – Quyền trưởng bộ
môn Công nghệ sinh học, cùng toàn thể quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệ
sinh học đã giảng dạy, tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập vừa
qua.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn cha mẹ và bạn bè đã ủng hộ, động
viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án tôt nghiệp này.
Nha Trang, ngày tháng năm 2009
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Duyên
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
LỜI NÓI ĐẦU i
PHẦN I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3
1.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 3
1.1.1. Các nghiên cứu trong nước 3
1.1.2. Các nghiên cứu ngoài nước 4
1.2.Vi khuẩn P. multocida 6
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn 6
1.2.1.1. Phân loại vi khuẩn 6
1.2.1.2. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn 7
1.2.2. Đặc tính nuôi cấy 8
1.2.2.1. Trong môi trường nước thịt 8
1.2.2.2. Trên môi trường thạch thường 8
1.2.2.3. Trên môi trường thạch máu 9
1.2.2.3. Trên môi trường thạch huyết thanh 9
1.2.2.4. Trên môi trường thạch MacConkey 10
1.2.3. Đặc tính sinh hóa của P. multocida 11
1.3. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida 12
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida 12
1.3.2. Phân loại kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô 13
1.3.2.1 Phân loại kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ) 14
1.3.2.2. Kháng nguyên thân 15
1.3.3. Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P. multocida 16
1.3.3.1. Type A 16
1.3.3.2. Type B 17
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
iii
1.3.3.3. Type D của vi khuẩn P. multocida 17
1.4. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P. multocida 18
1.4.1. Đối tượng gây bệnh 18
1.4.2. Sức đề kháng của vi khuẩn 20
1.4.3. Cơ chế gây bệnh của P. multocida 21
1.4.3. Dịch tễ của bệnh do P. multocida 22
1.4.4. Các con đường lây nhiễm 23
1.4.5. Triệu chứng và bệnh tích 24
1.4.5.1. P. multocida gây bệnh trên đối tượng trâu, bò 24
1.4.5.2. P. multocida gây bệnh trên đối tượng gà 25
1.4.5.3. Bệnh trên đối tượng lợn 26
1.4.6. Điều trị và phòng bệnh 26
1.4.6.1.Biện pháp phòng bệnh 26
1.4.6.2. Biện pháp điều trị bệnh 27
1.5. Một số phương pháp định type vi khuẩn 27
1.4.1. Phương pháp phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu 28
1.4.2. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 28
1.4.2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 28
1.4.2.2 Các bước của phản ứng PCR 29
PHẦN II:NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. Nội dung nghiên cứu 31
2.2. Đối tượng nghiên cứu 31
2.3. Nguyên liệu, vật liệu dùng tron nghiên cứu 31
2.3.1. Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh vật: 31
2.3.2. Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh hóa: 31
2.3.3. Nguyên liệu để tiến hành phản ứng PCR 32
2.4. Phương pháp nghiên cứu 32
2.4.1. Xác định đặc tính sinh vật 32
2.4.1.1. Phương pháp nhuộm Gram 32
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
iv
2.4.1. 2. Kiểm tra đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường
thạch 33
2.4.2. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 33
2.4.2.1. Thử nghiệm oxidase 33
2.4.2.2. Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm 34
2.4.2.3. Kiểm tra khả năng lên men một số loại đường đơn khác 35
2.4.2.4. Phản ứng O-F 35
2.4.3. Phản ứng PCR 37
2.4.3.1. Bước tách chiết DNA 37
2.4.2. Bước tiến hành phản ứng PCR 38
2.4.3. Bước điện di 39
PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Đặc tính sinh vật hóa học 40
3.1.1. Đặc tính sinh vật 40
3.1.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa 42
Để tiến hành xác định 12 chủng nghiên cứu là vi khuẩn P. multocida chúng tôi
tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên
môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một số loại đường
đặc trưng. Kết quả thu được được thể hiện qua một số hình ảnh sau: 42
3.2. Phản ứng PCR 46
3.3. Xác định type của vi khuẩn P. multocida 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
1. Kết luận 50
2. Đề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Hệ thống định type và các type huyết thanh của vi khuẩn P. multocida
hiện nay 16
Bảng 1.2: Các serotype gây bệnh chủ yếu trên động vật 20
Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng để tiến hành phản ứng đối với P. multocida 32
Bảng 2.2 : Thành phần các chất tham gia phản ứng O-F 36
Bảng 2.3: Tỷ lệ các thành phần tham gia phản ứng PCR 38
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 38
Bảng 3.1: Các đặc tính sinh vật của P. multocida 40
Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P. multocida 44
Bảng 3.3: Kết quả định type vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR 48
của vi khuẩn P. multocida 49
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn P. multocida 41
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn P. multocida trên môi trường thạch
máu 41
Hình 3.3: Đặc tính sinh hóa của P. multocida 42
Hình 3.4: Phản ứng O-F của P. multocida. 43
Hình 3.5: Kết quả PCR xác định vi khuẩn P.multocida 46
Hình 3.6: Kết quả đọc điện di gene mã hóa cho type A, type B 49
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
1
LỜI NÓI ĐẦU
Chăn nuôi gia súc gia cầm đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế
của Việt Nam. Riêng năm 2008 ước tính tổng sản lượng thịt trâu, bò khoảng
gần 300 nghìn tấn, sản lượng sữa khoảng 262, 2 nghìn tấn, sản lượng thịt lợn
khoảng 2,5 triệu tấn, và sản lượng thịt gia cầm khoảng 417 nghìn tấn. Trong 4
tháng đầu năm 2009, tình hình chăn nuôi gia súc gia cầm ổn định. Đàn bò cả
nước ước tính tăng từ 1% đến 2% so với cùng kỳ năm trước, đàn lợn tăng 3%
đến 4%, đàn gia cầm tăng 6% đến 7%. Nhưng dịch bệnh như lở mồm long
móng ở trâu bò, heo tai xanh, cúm gia cầm vẫn xảy ra. Riêng tụ huyết trùng
do Pasteurella multocida (P. multocida) trên trâu bò, lợn vẫn xảy ra rải rác tại
một số tỉnh: Cao Bằng, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Nghệ An, Quảng Trị, Tây
Ninh, Kon Tum, Bạc Liêu…[2].
Bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết xuất huyết là một bệnh truyền nhiễm
cấp tính ở trâu bò. Bệnh do vi khuẩn P. multocida serotype B:2 gây ra (chủ
yếu lưu hành ở Châu Á) và serotype E:2 (lưu hành ở Châu Phi) (theo De
Alwis, 1999), P. multocida serotype B:2 liên quan đến bệnh tụ huyết trùng ở
lợn cũng đã được một số tác giả báo cáo (Gamage và cộng sự, 1995; Verma,
1991; Towsend và cộng sự, 1998). P. multocida serotype A:1 được xác định
là gây bệnh tụ huyết trùng ở gà tại Việt Nam (K. A. Brogden, 2001).
Với mục đích xác định vi khuẩn P. multocida nhằm phục vụ công tác
phòng và chống dịch bệnh có hiệu quả, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR” với
nội dung như sau:
1) Xác định vi khuẩn P. multocida thông qua một số đặc tính sinh vật,
sinh hóa của vi khuẩn.
2) Xác định vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR.
3) Định type A, B, D của vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
2
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo này chắc chắn sẽ còn hạn chế.
Em kính mong nhận được sự góp ý của quí thầy cô và bạn bè để nghiên
cứu thêm hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
3
PHẦN I:
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Các nghiên cứu trong nước
Theo Phan Thanh Phượng và cộng sự (2000), khi tiến hành định type
trên 17 chủng P. multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Trung và 11
chủng P.multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Bắc, trong đó ứng dụng
kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao để định type vi
khuẩn. Kết quả chỉ có một chủng trong số 17 chủng phân lập từ miền Trung
không cho hình ảnh PCR đặc hiệu của type B gây bại huyết xuất huyết, tất cả
các chủng còn lại đều cho hình rất đặc trưng của type B. Bằng kỹ thuật
Western blot với các kháng huyết thanh đặc hiệu, tác giả cũng đã xác định
được chủng còn lại thuộc type D.
Theo Trần Xuân Hạnh và cộng sự (2002)[1], đã tiến hành thí nghiệm
PCR với hai cặp mồi HSB và CAPB trên đối tượng vi khuẩn P. multocida
phân lập từ lợn tại Việt Nam, trong đó cặp mồi HSB được K.M.Townsend và
cộng sự công bố vào năm 1998, và cặp mồi CAPB cũng do chính tác giả
thông báo vào năm 2001. Hai cặp mồi này đặc hiệu cho các chủng P.
multocida thuộc serotype B:2, B:5 hoặc B:2,5. Trong 32 chủng P. multocida
thực hiện phản ứng PCR có 19 chủng đã dương tính với HSB (HSB-PCR),
tuy nhiên, trong số này lại chỉ có 8 chủng dương tính với CAPB (CAPB-
PCR). Những chủng P. multocida dương tính với HSB-PCR mà âm tính với
CAPB-PCR đều cho kết quả dương tính với lactose. Bằng phản ứng với
Acriflavine (Carter và Subronto, 1973) và kỹ thuật PCR với cặp mồi là CAPD
(cặp mồi đặc hiệu cho P. multocida type D), các chủng này đã được xác định
thuộc type D. Vì hiện tượng dương tính khi chạy HSB-PCR với một số chủng
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
4
P. multocida type D, nên để xác định vi khuẩn P. multocida type B cần chạy
với cả hai cặp mồi HSB và CAPB.
Khi nghiên cứu về đặc tính và type huyết thanh học của vi khuẩn tụ
huyết trùng trâu, bò phân lập được ở một số tỉnh phía Bắc, bước đầu Trương
Văn Dung và cộng sự (1998)[3], đã đưa ra những kết luận sau:
Ở trâu bò nghi tụ huyết trùng thì khi lấy mẫu để phân lập có thể lấy từ
tủy xương, gan, thận, lá lách, phổi, tim.
Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch đường hô hấp trên có thể ria
trực tiếp trên thạch máu ở địa điểm lấy mẫu và vận chuyển nhanh về
phòng thí nghiệm.
Những vi khuẩn P. multocida phân lập được mang các đặc tính sau:
Không mọc trên môi trường MacConkey, không dung huyết, sinh
Indol, lên men đường Mannitol, Xylose, Dextrose, không lên men
đường Lactose, Inositol…
Vi khuẩn tụ huyết trùng ở trâu, bò phía Bắc Việt Nam có mặt đủ 3 loại
serotype A, B, D hướng liên serotype là đáng lưu ý.
1.1.2. Các nghiên cứu ngoài nước
P. multocida là vi khuẩn gram âm gây bệnh trên nhiều đối tượng gia
súc tại nhiều nơi trên thế giới. Vì thế đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa
học trên thế giới về hình thái, đặc tính sinh hóa và khả năng cũng như đặc tính
gây bệnh của vi khuẩn này đối với gia súc.
Theo hệ thống định type của Carter và Heddleston thì ở châu Á chủ yếu
là serotype B:2 và châu Phi là serotype E:2 gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò.
Còn theo hệ thống định type của Namioka – Carter thì 6:B, 6:E lại là serotype
gây bệnh chủ yếu. Ở động vật hoang dã khi tiến hành phân lập vi khuẩn từ
bệnh phẩm kết quả thu được thường là serotype B:2,5. Theo De – Alwis
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
5
(1990), tại Ấn Độ các serotype A:1, A:3 cũng đã được báo cáo là tìm thấy ở
trâu, bò.
Theo Kirsty.M. Townsend và cộng sự (1998)[18], khi dùng kỹ thuật
phân tử để xác định gene mã hóa cho vi khuẩn P. multocida và gene mã hóa
các type A, B, D, E, F cho thấy phản ứng PCR có độ đặc trưng cao, và cho kết
quả phù hợp với kết quả xác định type thông thường (bằng các phương pháp
thông thường như ngưng kết hồng cầu gián tiếp) (ngoại trừ những chủng có
type F không cho kết quả phù hợp). Các nghiên cứu sử dụng các phương pháp
thông thường để định type cho vi khuẩn trước đó đã thu được những kết quả
không rõ ràng và đang gây nhiều tranh cãi giữa các nhà nghiên cứu,
Kirst.M.Townsend thực hiện thí nghiệm bằng phương pháp PCR đã xác định
được chính xác các chủng P. multocida cho kết quả nghi ngờ thuộc type A.
Multiplex PCR cũng giúp phân biệt giữa type A và F.
Cũng theo tác giả Kirsty.M.Townsend (1998), cặp mồi KMT1SP6-
KMT1T7 (KMT1SP6: 5
’
-GCTGTAACGAACTCGCCAC- 3
’
và KMT1T7: 5
’
-ATCCGCTAATTTCCCAGTGG- 3
’
) tạo sản phẩm khuếch đại có khoảng
460 bp từ tất cả các chủng P.multocida (vì thế cặp mồi này đặc trưng cho loài
P. multocida).
Cặp mồi KTSP61-KTT72 (KTSP61: 5
’
-ATCCGCTAACACACTCTC-
3
’
và KTT72: 5
’
-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG- 3
’
) khuếch đại một sản
phẩm đặc trưng khoảng 590 bp, đoạn gene tương ứng chính là gene mã hóa
type B gây bệnh tụ huyết trùng ở gia súc, đặc hiệu cho serotype B:2, B:5 hoặc
B:2,5. Townsend ký hiệu cặp mồi KTSP61-KTT72 là HSB trong quá trình
tiến hành nghiên cứu.
Gần đây từ vùng gene tổng hợp kháng nguyên vỏ nhầy các cặp mồi
khác đã được thiết kế ký hiệu CAPB (Kirsty.M.Townsend và cộng sự,
2001)[17]:
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
6
CAPB-FWD: 5
’
-CATTTATCCAAGCTCCACC- 3
’
CAPB-REV: 5
’
-GCCCGAGAGAGTTTCAATCC- 3
’
Cả hai cặp mồi HSB và CAPB đều được dùng để xác định những
chủng thuộc serotype B.
1.2.Vi khuẩn P. multocida
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn
1.2.1.1. Phân loại vi khuẩn
Vi khuẩn P. multocida được tìm thấy đầu tiên vào năm 1878 ở gà bị
bệnh toi (tụ huyết trùng), nhưng đến năm 1880, vi khuẩn P. multocida mới
được Louis Pasteur phân lập, vì vậy vi khuẩn này được đặt tên theo tên của
ông. Năm 1885, Kit đã phân lập được vi khuẩn này từ trâu, bò bị bệnh, và đã
đặt tên cho vi khuẩn là Bacterium bipolarmulticidium, vào năm 1886, Hueppe
đã đặt lại tên là Bacterium septicemia haemorrhagica, tên được ông đặt theo
tên bệnh do vi khuẩn này gây ra phổ biến ở trâu, bò là Haemorrhagic
septicemia. Lignieres (1900) đặt tên vi khuẩn theo vật chủ: chủng phân lập từ
trâu, bò: Pasteurella boviseptica; chủng vi khuẩn phân lập từ lợn: Pasteurella
suiseptica; vi khuẩn phân lập từ gia cầm: Pasteurella aviseptica. Topley và
Winsol (1929), đã đặt lại tên vi khuẩn thành Pasteurella septica, sau đó
Rosenbach và Merchant (1939) đổi tên thành Pasteurella multocida [27].
Theo Bergey (1994)[12] các đơn vị phân loại loài của vi khuẩn P.
multocida như sau :
Giới: Bacteria.
Ngành: proteobacteria.
Lớp: Gamma proteobacteria.
Bộ: Pasteurellales.
Họ: Pasteurellaceae.
Chi: Pasteurella.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
7
Loài: Pasteurella multocida.
Theo Mutters và cộng sự (1985)[20], P. multocida chia thành 3 nhóm
dưới loài : P. multocida multocida (P. m. multocida), P. multocida septica (P.
m. septica), P. multocida gallicida (P. m. gallacida). Có thể phân biệt các
chủng dưới loài thông qua khả năng lên men đường, hai đường được Mutters
chọn để phân biệt chủ yếu là Sorbitol và Dulcitol. P. multocida multocida
được chia nhỏ hơn thành hai chủng ký hiệu là a và b.
1.2.1.2. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn
Theo Smith (1959)[14], kích thước và hình thái của vi khuẩn có sự thay
đổi phụ thuộc nguồn gốc của chúng. Vi khuẩn phân lập từ bò có kích thước
đồng nhất từ 0,5µm đến 1,2µm. Vi khuẩn phân lập từ lợn thì có kích thước
tròn hơn khoảng 0,8 µm - 1,0 µm.
Hagan và Brunner (1988)[15], P. multocida là cầu trực khuẩn : có chiều
rộng khoảng 0,3 µm, có chiều dài khoảng từ 0,4 µm đến 0,8 µm.
Theo Malcolm De Alwis (M.C.L.De Alwis hoặc gọi tắt là De Alwis)
(1999)[27], P. multocida là vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, tồn tại
ở dạng trực khuẩn hoặc hình cầu. Vi khuẩn có kích thước 0,2 μm - 0,4 μm cho
đến 0,6 μm - 2,5 μm. Khi cấy chuyển nhiều lần, hoặc nuôi cấy vi khuẩn trong
điều kiện bất lợi, vi khuẩn tồn tại dạng đa hình thái, có chiều dài tăng, đôi khi
tồn tại cả dạng sợi. Trong môi trường mới phân lập, trong mô của vật chủ,
hoặc là trong dịch nhầy P. multocida tồn tại ở dạng cầu khuẩn, bắt màu hai
cực, đặc biệt là nhuộm với Leishman hoặc Methylene blue.
Carter (1967)[10], cho rằng vi khuẩn P. multocida khi tồn tại trong máu
động vật thường chỉ có một hình dạng nhất định, còn trong môi trường nhân
tạo vi khuẩn nuôi cấy thường đa hình dạng: có vi khuẩn hình trứng, có vi
khuẩn hình cầu. Trong một canh khuẩn nuôi cấy có thể thấy một số vi khuẩn
hình que, một số hình trứng hoặc hình cầu cùng tồn tại. Tác giả còn nhận thấy
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
8
khi nuôi cấy nhiều lần trên môi trường nhân tạo thì chiều dài của vi khuẩn
tăng lên.
Theo Nguyễn Bá Hiên (2005)[6], vi khuẩn P. multocida phân lập từ
trâu, bò là cầu trực khuẩn nhỏ, có hình trứng hoặc hình bầu dục, hai đầu tròn,
kích thước khoảng 0,25 µm - 0,4 µm x 0,4 µm - 1,5 µm
Theo Rosenbush và Merchart (1939)[23], khi nuôi cấy trong môi
trường có thêm carbon, vi khuẩn thường phát triển thành chuỗi.
1.2.2. Đặc tính nuôi cấy
P. multocida là loại vi khuẩn hiếu khí nhưng trong môi trường ít oxy vi
khuẩn vẫn tồn tại được, phát triển tốt trong nhiều loại môi trường thông
thường. P. multocida cũng phát triển tốt trên các môi trường thạch có bổ sung
dextrose thủy phân từ tinh bột, môi trường CSY (casein – sucrose – yeast)
(theo De Alwis, 1999)[27].
1.2.2.1. Trong môi trường nước thịt
Theo Carter (1952), trong môi trường nước thịt vi khuẩn P. multocida
mọc tốt, làm đục môi trường, tạo mùi đặc trưng. Mùi tanh đặc trưng thể hiện
rõ nét nhất ở pha phát triển nhanh. Sau khi nuôi cấy vi khuẩn lâu thì mùi tanh
mất dần.
Theo Hudson (1954)[16], nhiệt độ thích hợp nhất cho P. multocida phát
triển là 37
0
C, với độ pH là 7,2 - 7,6. Vi khuẩn phát triển kém ở nhiệt độ phòng
và pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 8,5. Tác giả cũng xác định vi khuẩn mọc tốt
hơn nếu cho 5% - 10% huyết thanh động vật.
1.2.2.2. Trên môi trường thạch thường
Khuẩn lạc của P. multocida trên môi trường thạch thường có đặc điểm:
nhẵn, lồi, đường kính khoảng 1 mm đến 2 mm, mùi hơi ngọt (sweetish).
Những chủng vỏ dày sinh khuẩn lạc nhầy hoặc ướt (theo Hagan và Brunner,
1988)[15].
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
9
1.2.2.3. Trên môi trường thạch máu
Theo De Alwis (1999)[27], khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu và
CSY có bổ sung 5% máu bò hoặc cừu, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn
lạc riêng rẽ, hình tròn, mặt lồi, có màu từ trắng đến xám, và có đường kính
khoảng từ 1 mm đến 3 mm. Những loài tạo giáp mô khó khăn thường sinh
khuẩn lạc nhầy. Khi mới phân lập từ các mẫu bệnh phẩm nhiều chủng vi
khuẩn P. multocida có khả năng tạo giáp mô. Nhưng tính chất này mất dần đi
qua những lần cấy chuyền tiếp theo.
Cũng theo De Alwis (1999), các chủng vi khuẩn P. multocida hình
thành các dạng khuẩn lạc khác nhau, vi khuẩn thuộc type A sinh khuẩn lạc
lớn nhất, khuẩn lạc có màu từ trắng đến hơi xám, nhầy. Khuẩn lạc có dạng
tròn, lồi, mọc riêng rẽ, và thường ướt. Khuẩn lạc thuộc type D thường nhầy.
Hình thái của khuẩn lạc của type B, type E cũng phụ thuộc vào lớp vỏ, có
kích thước không đồng nhất, và có màu xám hơn khuẩn lạc khác.
Theo nhiều tác giả thì trên môi trường thạch máu vi khuẩn không gây
dung huyết (De Alwis, 1999; Hagan và Bruner, 2001; Trương Văn Dung và
cộng sự, 1998).
1.2.2.3. Trên môi trường thạch huyết thanh
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch huyết thanh, quan sát độ phóng đại
thấp giáp mô của khuẩn lạc, De Alwis (1999)[27] đã kết luận:
Các khuẩn lạc thuộc type D, type F, và những khuẩn lạc tròn thuộc type
A có nhiều màu giống như ngọc trai.
Các khuẩn lạc của vi khuẩn type B, type E trong môi trường thạch
huyết thanh có kích thước nhỏ hơn, màu hơi vàng hoặc hơi xanh, cũng
nhiều màu như ngọc trai.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
10
Vi khuẩn P. multocida miêu tả bởi Malcolm De Alwis là khuẩn lạc có
dung quang sắc cầu vồng (Irrodescent), những khuẩn lạc này tạo giáp mô và
độc lực mạnh.
Còn loại thứ hai là khuẩn lạc có dung quang màu xanh (Blue). Khuẩn
lạc loại này thường ít hoặc không có giáp mô và ít độc hoặc không độc.
Khuẩn lạc có dung quang màu xanh là dạng R (Theo Rimler, 1992 và Carter,
1955).
Theo Carter (1955); Namioka và Murata (1961), P. multocida phát
triển trên môi trường thạch có 3 dạng khuẩn lạc cơ bản: dạng nhầy M (M-
mucoid), dạng nhẵn bóng S (S-smooth) và dạng xù xì R (R-rough). Khuẩn lạc
dạng nhầy có kích thước to nhất, màu trắng trong và có rìa nhẵn, bề mặt
khuẩn lạc ẩm ướt và có dung quang yếu. Khuẩn lạc dạng S có kích thước nhỏ
hơn dạng M, rìa nhẵn, mặt lồi và có dung quang mạnh. Vi khuẩn dạng này
thường tạo lớp giác mô nhiều hơn loại khuẩn lạc xù xì. Dạng khuẩn lạc R
thường dẹt và rìa xù xì. Khuẩn lạc R có thể tạo thành trong môi trường nuôi
cấy lâu ngày (De Alwis, 1999).
1.2.2.4. Trên môi trường thạch MacConkey
Khi cấy vi khuẩn P. multocida phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bò
trong môi trường thạch MacConkey thì vi khuẩn không phát triển được. Ở gà,
vi khuẩn có thể được phân lập từ phân gà bị tiêu chảy, nên nuôi cấy vi khuẩn
trên môi trường MacConkey được coi là một đặc tính sinh hoá để phân biệt
giữa P. multocida với các vi khuẩn đường ruột gram âm khác. Vì trong môi
trường có thành phần muối mật, muối này hầu như ức chế vi khuẩn gram
dương và chỉ cho phép một số vi khuẩn đường ruột gram âm phát triển (ví dụ
như E.coli) [25].
Trên môi trường Gelatin thì vi khuẩn cũng không làm phân hủy Gelatin
để tạo thành cơ chất.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
11
1.2.3. Đặc tính sinh hóa của P. multocida
Khi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường 3 ống
nghiệm để kiểm tra đặc tính sinh hóa, rồi đem ủ ở nhiệt độ 37
0
C, ta có thể đọc
kết quả sau 18 giờ đến 24 giờ.
Khi nuôi cấy nếu vi khuẩn sử dụng đường để phát triển sẽ sinh acid, do
đó làm biến đổi pH môi trường, Nghiên cứu đầu tiên của Lignieres (1900) về
tính chất sinh hóa của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn làm tan chảy Gelatin, không
lên men đường Lactose, không sinh Urease, nhưng sinh Indol. Tác giả đã chia
P. multocida thành 3 nhóm:
Nhóm 1: Gồm các vi khuẩn lên men đường Lactose, Maltose, Glucose,
Manồngl, không gây dung huyết.
Nhóm 2: Các vi khuẩn lên men đường Glucose, Saccharose, Mannitol,
không lên men đường Lactose, Maltose, không dung huyết.
Nhóm 3: Các vi khuẩn lên men đường Glucose, Saccharose, Mannit,
không lên men đường Lactose, Maltose, không dung huyết.
Carter (1955), cho rằng các chủng P. multocida type A lên men đường
Arabinose và Dulose, không lên men đường Xylose. Các chủng thuộc type B
và C lên men đường Xylose nhưng không lên men đường Arabinose và
Dulcitol. Chúng còn lên men đường Glucose, Maltose, Inositol, Dextrin và
tinh bột. Một số chủng lên men đường yếu Sorbitol, Glycorol và Fructose tạo
thành Acid.
Vi khuẩn P. multocida còn có các đặc tính sinh hóa như sau: dương
tính với phản ứng Oxidase, dương tính với phản ứng Catalase, dương tính với
Decarboxylase Ornithine, âm tính với Urease, khử Indole và sinh H
2
S trong
môi trường TSI, khử Nitrat thành Nitrit (Carter 1990)[24].
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
12
1.3. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida
Những kỹ thuật chẩn đoán quan trọng như sử dụng kính hiển vi điện tử,
sử dụng các phương pháp phân tích DNA của vi khuẩn đã làm sáng tỏ những
tác nhân gây độc của P. multocida. Các yếu tố gây độc chủ yếu của vi khuẩn
P. multocida là: Polysaccharide vỏ, Endotoxin hoặc Lipopolysaccharide,
Protein ngoài màng (OMP-Outermembraine Proteins), tiêm mao và tiên mao
(fimbria and adhesins), Exotoxines và các Enzym ngoại bào (extracellular)
(Ragy S. Seleim, 2005)[30].
Lớp vỏ P. multocida đóng vai trò chủ yếu trong việc định type vi
khuẩn. Thành phần chính của lớp vỏ là polysaccharides, một số vi khuẩn có
cả lipoproteins. Nhưng vỏ của vi khuẩn type A còn có thành phần acid
hyaluronic và cả những đường đa khác (thành phần đường đa này bị thuỷ
phân bởi enzym hyaluronidase) (Carter, 1953). Type F có thành phần
choadroitin và được tìm thấy chủ yếu ở gà tây ( Champlin và cộng sự, 2002;
De-Angelis và cộng sự, 2002)[30].
Tiêm mao: Bằng kính hiển vi điện tử có thể quan sát được tiêm mao
của P. multocida phân lập từ lợn, thỏ, trâu bò. Khả năng dính bám của tiêm
mao vi khuẩn vào bề mặt tế bào vật chủ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, môi
trường acid. Tiêm mao vi khuẩn đóng vai trò giúp vi khuẩn xâm nhập vào tế
bào vật chủ. Kháng thể kháng tiêm mao của tế bào vật chủ có thể ức chế khả
năng dính bám của vi khuẩn lên bề mặt tế bào (Seleim, 1993; Esslinger và
cộng sự, 1994).
Protein màng ngoài: P. multocida phân lập từ các trường hợp tụ huyết
trùng trâu, bò có khoảng hơn 40 chuỗi protein ngoài màng. Protein liên kết
được với hemoglobin là một protein ngoài màng gây độc chủ yếu (chuỗi
protein này đóng vai trò như một thụ thể đặc hiệu của hemoglobin) (Johnson
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
13
và cộng sự, 1991, Seleim, 1993; Seleim, 1996; Bosch và cộng sự, 2002). Từ
các trường hợp lợn mắc bệnh viêm teo mũi đã xác định được 3 chuỗi protein
màng ký hiệu là I, II, III. Những chuỗi protein I, II, III có trọng lượng phân tử
trong khoảng 28 kDa đến 40 kDa, và có thể phân biệt do trọng lượng khác
nhau của các chuỗi protein. Protein H của P. multocida giống với protein của
Enterobacteriaceae về khả năng kháng trypsine, kháng dung dịch SDS, liên
kết với peptidoglucane. Tuy nhiên, protein H tạo một phức hệ miễn dịch với
polysaccharide. Mặt khác protein màng được tách từ P. multocida gây bệnh
trên gà có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa có thể ức chế hoạt động của
đại thực bào (Seleim, 1995)[7].
Lipopolysaccharide endotoxines: LPS là yếu tố gây độc chính đối với
bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò. LPS của P. multocida cũng tương tự với LPS
của Enterobacteriae. LPS là thành phần của các kháng nguyên thân, có trọng
lượng phân tử thấp. LPS của P. multocida ngắn hơn LPS của các
Enterobacteriae (ví dụ như E.coli, S. typhimurium) (Horadagoda và cộng sự,
2001)[30].
Exotoxin: Là ngoại độc tố sản sinh bởi vi khuẩn P. multocida. Những
chủng vi khuẩn type D sẽ tạo độc tố gây hoại tử da (dermonecrotic toxin-
DNT). DNT là một phân tử protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 112
kDa đến 160 kDa (thành phần protein DNT tăng cường nội độc tố của tế bào,
gây hoại tử da và và làm teo xương) (Chanter and Rutter, 1989; Ghoshal và
Niyo, 1993; Lichtenster và cộng sự, 1996).
1.3.2. Phân loại kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô
Kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô là hai kháng nguyên
được nghiên cứu nhiều của P. multocida (Seleim, 1995).
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
14
1.3.2.1 Phân loại kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ)
Phân loại kháng nguyên vi khuẩn P. multocida được thực hiện đầu tiên
bởi Cornelius (1929), Yusef (1935), Little và Lyon (1943). Roberts (1947) đã
sử dụng kháng huyết thanh lấy từ thỏ tiêm cho chuột, giúp chuột kháng lại với
một phổ rộng các chủng vi khuẩn. Trên cơ sở thí nghiệm này, tác giả đã phân
loại vi khuẩn P. multocida thuộc 4 type, đặt tên lần lượt là I, II, III, IV. Sự
phân loại của Roberts đối với P. multocida ban đầu chưa được nhiều người
đồng quan điểm. Nhưng khi tất cả các chủng gây bệnh tụ huyết trùng được
xác định thuộc Roberts type I, hệ thống phân loại này mới được công bố và sử
dụng rộng rãi.
Các type huyết thanh I, II, III, IV có vai trò nhất định tới việc gây ra
bệnh ở vật nuôi. Ví dụ như bệnh tụ huyết trùng chỉ do type 1 và type này
không xuất hiện ở Mỹ, cũng như không phổ biến ở Bắc Mỹ (Theo Kyaw,
1942). Type 1 có thể phân lập được ở Châu Á, nhất là Nam Á, còn type 2 chủ
yếu gây bệnh cho gia súc ở Châu Âu và Tây bán cầu. Hudson (1954), tiến
hành nghiên cứu 58 chủng phân lập từ trâu, bò tại Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan,
Kenya đều thuộc type 1.
Carter (1955) [9], định type vi khuẩn P. multocida bằng phương pháp
ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect haemagglutination) đã xác định được 4
type vi khuẩn P. multocida. Carter đã ký hiệu các type bằng chữ (4 type tương
ứng là A, B, C, D).
Sau đó, Carter xác định được chủng P. multocida gây bệnh tụ huyết
trùng ở trâu, bò tại Châu Phi không thuộc vào type nào trong số các type đã
được phân loại, mặc dù tác giả cho rằng chủng vi khuẩn P. multocida gây
bệnh tại Châu Phi có mối liên hệ với type B. Vì vậy chủng vi khuẩn được ký
hiệu tên mới: type E (Carter, 1961). Tuy nhiên, cũng chính Carter đã nhận
thấy rằng type C không tồn tại cố định và tác giả đã bỏ đi type C trong hệ
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
15
thống định type P. multocida (Carter, 1963). Hệ thống phân loại kháng
nguyên của Carter đối với P. multocida được sử dụng cho đến ngày nay [27].
P. multocida type F được xác định bởi Rimler và Rhoades (1987), tên
được đặt theo phân loại của Carter. Như vậy P. multocida có 5 loại kháng
nguyên giáp mô, ký hiệu là A, B, D, F, E (theo phân loại của Carter, 1957).
1.3.2.2. Kháng nguyên thân
Theo Namioka và Murata (1961)[27], đã miêu tả phương pháp định
type kháng nguyên vỏ bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Tác
giả sử dụng môi trường nuôi cấy mẫu tươi để ngưng kết với kháng huyết
thanh tối miễn dịch của thỏ. Namioka và Murata (1964) và Namioka và
Brunner (1963) cũng đã miêu tả phương pháp xác định kháng nguyên thân
trên cơ sở phản ứng ngưng kết nhanh giữa tế bào vi khuẩn P. multocida được
xử lý bằng HCl với kháng huyết thanh của thỏ. Bằng phương pháp này, tác
giả đã xác định được 11 type kháng nguyên thân.
Heddleston và cộng sự (1972)[27], sử dụng phương pháp phản ứng kết
tủa trên thạch để phát hiện kháng nguyên thân. Vi khuẩn đun ở 100
0
C trong 1
giờ, ly tâm để tách lấy phần dịch nổi chứa kháng nguyên. Kháng huyết thanh
được lấy từ gà bằng cách gây miễn dịch với kháng nguyên thân. Heddleston
xác định được các kháng nguyên thân khác nhau của P. multocida ký hiệu từ
1 đến 16. Phương pháp này được sử dụng để định type kháng nguyên thân
đầu tiên ở chủng vi khuẩn gây bệnh trên gà. Nhưng ngày nay phương pháp
được dùng định type cho tất cả các vi khuẩn từ các vật chủ khác, và kết hợp
các loại kháng nguyên này có thể phân các vi khuẩn này thành các dạng huyết
thanh khác nhau.
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
16
Bảng 1.1: Hệ thống định type và các type huyết thanh của vi khuẩn P.
multocida hiện nay
Tác giả
Phương pháp
Type kháng
nguyên
Carter, 1955
Ngưng kết hồng cầu
gián tiếp (IHA)
A, B, C, D
Carter, 1961
IHA
E
Carter, 1963
IHA
Loại bỏ type C
Namioka và Murata, 1961
Ngưng kết nhanh
kháng nguyên trên
phiến kính.
A, B, D, E
Kháng
Nguyên
Vỏ
Rimler và Rhoades, 1987
IHA
F
Namioka và Murata, 1961
Namioka và Brunner,
1963
Namioka và Murata, 1964
Phản ứng ngưng kết
nhanh của kháng
nguyên xử lý HCl
trên phiến kính
1 – 11
Kháng
Nguyên
Thân
Heddleston và cộng sự,
1972
Phản ứng kết tủa trên
thạch
1 – 16
Màng ngoài và toàn bộ thành phần protein của P. multocida là cơ sở để
định type vi khuẩn (Dabo và cộng sự, 1999; Davies và cộng sự, 2003).
1.3.3. Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P.
multocida
1.3.3.1. Type A
Cho đến nay, mới chỉ có lớp vỏ của các vi khuẩn P. multocida thuộc
type A là được xác định khá đầy đủ về thành phần cấu tạo. Vỏ của chủng type
A có thành phần acid hyaluronic (hyaluronan)(Carter và cộng sự, 1953,
1985). Hyaluronic acid là thành phần polysaccharide quan trọng của lớp vỏ
(Rosner và cộng sự, 1992). Hyaluronic acid Type A của P. multocida không
có tác động vào hoạt động ức chế thực bào vì nó không có vai trò trong hệ
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
17
thống miễn dịch, nhưng việc tách vỏ của P. multocida type A thì lại có liên
quan tới một yếu tố protein (khoảng 300kDa), mà protein này lại làm ức chế
hoạt động thực bào ở bò (Selein, 1993). Các phân tử protein tham gia vào cấu
trúc của type A của bò là giống nhau ở tất cả các vi khuẩn phân lập được
(Seleim, 1996; Gadliero và cộng sự, 1998).
1.3.3.2. Type B
Type B có bản chất chủ yếu là Lipopolysaccharide (LPS), chính thành
phần này là nguyên nhân chủ yếu gây nên bệnh tụ huyết trùng. LPS được cho
là có tác động kích thích TNF (Tumor necrosis factor – đây là một cytokine
có vai trò ức chế các tế bào u, được tạo ra từ các đại thực bào của bò) và giải
phóng interleukines-cũng là một cytokine (Beinhoff và cộng sự, 1992;
Horadagoda và cộng sự, 2001; Lax và Thomas 2002) [30].
Khi phân tích thành phần đường của lớp vỏ P. multocida type B, kết
quả cho thấy mỗi chuỗi polysaccharide gồm Arabinose, Mannose và
Galactose với tỉ lệ 0,5 :2,0 :0,8 (N. Muniandy, J. Edgar, J. B. Woolcock và T.
K. S. Mukkur, Int. Workshop Pasteurellosis Prod. Anim, 1992).
Theo Rimler và Rhoader (1989), mới chỉ một vài lần P. multocida type
B được xác định là sinh độc tố protein (DNT), song không nêu rõ đặc tính.
1.3.3.3. Type D của vi khuẩn P. multocida
Cấu tạo lớp vỏ của P. multocida type D, F được xác định đầu tiên thông
qua thành phần mucosaccharides. Khi loại bỏ lớp vỏ bằng enzym, kết quả cho
thấy vỏ vi khuẩn có thành phần heparin và chondroitin (theo Rimler và cộng
sự, 1994) [18].
Các protein I, II, III thuộc thành phần cấu tạo của type D, trong đó
chủng OMP type I sinh độc tố mạnh hơn hai OMP type II, III. Các protein
này là nguyên nhân gây nên bệnh viêm teo mũi cấp tính ở lợn (cả 3 protein
đều tham gia vào thành phần của DNT) (Seleim, 1995)[30].
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
18
1.4. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P. multocida
1.4.1. Đối tượng gây bệnh
Mặc dù việc ứng dụng những kỹ thuật chẩn đoán và những nghiên cứu
về bệnh ở cả động vật và vi khuẩn dễ dàng, nhưng việc nhiễm P. multocida
vẫn diễn ra ở các loài vật nuôi (ở hầu hết các động vật có vú, chim), thậm chí
vi khuẩn còn sinh độc tố gây độc cho chính con người (Adlam và Rutter,
1989). Đối tượng gây bệnh của P. multocida là rất rộng và các type của vi
khuẩn P. multocida gây bệnh đặc trưng cho một vật chủ nhất định (Quinn và
cộng sự, 1994; Boyce và cộng sự, 2000).
Type A, D được tìm thấy trong hầu hết các loài vật nuôi trong gia đình
(Confer, 1993; Quinn và cộng sự, 1994).
Trong khi đó Type B, E chủ yếu tìm thấy ở các loài vật nuôi sinh sống
ở khu vực nhiệt đới, gây bệnh tụ huyết trùng ở gia súc và động vật
hoang dã (Carter, 1961; Penn và Nagy, 1976; Townsend và cộng sự,
1997). Bệnh do P. multocida có thể xuất hiện nhiều ở các địa phương
có khí hậu nóng ẩm như châu Phi, châu Á, Ấn Độ (Carter và cộng sự,
1989)[3]. P. multocida type B gây nên bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò
(Bain và cộng sự, 1982).
Các chủng type A có thể được phân lập từ phổi của lợn mắc bệnh viêm
phổi (Baekbo, 1988), trong khi đó thì type D được phân lập từ phổi ít
hơn mà chủ yếu là từ mũi lợn.
P. multocida cũng được phân lập từ bò sữa (Tucker, 1953; Tunnicliff,
1949), từ chó (Rogers và Elder, 1967), từ ngựa và lừa (Pavri và Apte,
1967)[9].
Type F lần đầu tiên được phân lập từ gà tây ở Mỹ (Rimler và Rhoades,
1987), và chim ở khu vực Bắc Mỹ (Rhoades và Rimler, 1987; Wilson
và cộng sự, 1993). Type F hầu như không tìm thấy ở các chủng vi
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
Click to buy NOW!
P
D
F
-
X
C
h
a
n
g
e
V
i
e
w
e
r
w
w
w
.
d
o
c
u
-
t
r
a
c
k
.
c
o
m
