Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD

MỞ ĐẦU
Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế
giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều
kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước. Đã từ
lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và
xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu
tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12].
Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng
lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là
một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm
mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể
giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc
hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi
trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là
có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau
đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có
độc tính cao hơn phát triển [10].
Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn
giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng
cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các
gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những nguồn gen
quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di
truyền [4], [10].
Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có
hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên
cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan
tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ
thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng
rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có

thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và chính
xác. Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá thể và
1
có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử dụng các
đoạn mồi ngẫu nhiên. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề
tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh
bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu: đánh
giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi
khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn tạo
giống lúa kháng bệnh.
2
Chơng 1. TổNG QUAN TàI LIệU
1.1. giới thiệu về cây lúa
Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae), thân bụi, lá mềm. Lúa trồng thuộc chi
Oryzae với nhiều loài khác nhau. Trong số 23 loài đã đợc phân loại thì chỉ có hai
loài là O. glaberrima và O. sativa đợc trồng cấy. Loài O. glaberrima đợc trồng chủ
yếu ở một số nớc miền Tây châu Phi. Còn loài O. sativa có ở khắp thế giới và tập
trung phần lớn ở châu á. Loài O. sativa đợc chia làm 3 loài phụ: Indica, Japonica,
Javanica. Lúa Indica đợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; Japonica đợc
trồng chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận ôn đới; Javanica chỉ đợc trồng ở một vài nơi
thuộc Indonesia (Khush, 1997).
Loài Oryza sativa có số nhiễm sắc thể là 2n = 24. Tám trong số 23 loài lúa
dại có bộ gen ở thể tứ bội, còn lại đa số các loại lúa dại và lúa trồng hiện nay có bộ
gen là thể lỡng bội (Khush, 1997) [7], [21].
Lúa phân bố khắp thế giới, trải từ vĩ độ 55
0
Bắc thuộc Trung Quốc đến 36
0

Nam thuộc Chi Lê. Theo FAO (1999) diện tích đất canh tác lúa trên toàn thế giới
khoảng 150 triệu ha. Riêng Trung Quốc và ấn độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng
lúa và 56% sản lợng lúa toàn cầu. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích
trồng lúa của Việt Nam, nhng sản lợng lúa lại thấp hơn từ 2 đến 3 lần [2], [7].
1.2. Bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa (Xanthomonas oryzae)
Bệnh bạc lá (còn gọi là bệnh cháy bìa lá) là
một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae gây nên. là một trong những
bệnh hại lúa nguy hiểm. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên
ở Nhật Bản năm 1884. Năm 1960, bệnh lan truyền
sang, sau nguồn bệnh đợc tìm thấy ở các vùng khác ở
châu Phi, Australia, Mỹ và một số nớc Mỹ La Tinh.
ở Việt Nam, bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng
lúa trong cả nớc, từ vùng núi cao đến ven biển. Bệnh
có thể làm giảm năng suất từ 6 - 60%. Bệnh phá hại
trong cả vụ Đđông xuân, hè Hè thu và vụ mMùa.,
đặc biệt, bệnh gây hại nặng trong các tháng nhiệt độ cao. Ma bão là điều kiện để
Hình1: Triệu chứng của bệnh
bạc lá lúa vi khuẩn do
Xathomonas oryzae gây ra
3
bệnh lây lan và phát triển mạnh. Trong những năm 1970 - 1975, bệnh phát triển và
gây thiệt hại nặng cho ở lúa ở khắp các tỉnh phía Bắc [2].
1.2.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (Xanthomonas aryzae)
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn
Gram (-) và không hình thành bào tử. Các tế bào vi khuẩn đợc bọc trong màng nhầy
và liên kết với nhau thành một khối tơng đối vững chắc ngay cả trong nớc. Trên môi
trờng nhân tạo, khuẩn lạc có màu vàng nhạt và có thể sống trong phạm vi pH 4,0 -

8,8. Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trởng là 26
0
C - 30
0
C, nhiệt độ tối
thiểu là 55
0
C - 10
0
C và nhiệt độ tối đa là 40
0
C [9], [11].
Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động và có thể xâm nhiễm qua thủy
khổng, lỗ khí ở trên mép lá, đặc biệt qua vết thơng xây xát trên lá. Khi đã tiếp xúc
với bề mặt có màng nớc, vi khuẩn dễ dàng di động và xâm nhập vào bên trong qua
các lỗ khí, qua vết thơng để nhân lên về mặt số lợng, sau đó theo các bó mạch dẫn
lan rộng đi. Trong điều kiện ma ẩm, trên bề mặt vết bệnh sẽ tiết ra những giọt dịch
vi khuẩn và thông qua sự va chạm giữa các lá lúa, bệnh có thể lan truyền từ lá này
sang lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong thời kỳ sinh trởng của
cây lúa [6], [9].
Hiện nay, có rất nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá, phân bố ở nhiều nớc trên
thế giới. Các nhà khoa học có thể phân loại các nòi X. oryzae theo tính gây bệnh của
chúng. Nhìn chung, các nòi vi khuẩn khá khác nhau về tính gây bệnh và trở nên độc hơn
khi truyền lặp đi lặp lại qua các thế hệ của giống kháng bệnh, nhng tính gây bệnh vẫn
không thay đổi hoặc giảm đi khi xâm nhiễm qua các giống lúa mẫn cảm [11].
1.2.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá vi khuẩn
Bệnh bạc lá vi khuẩn thờng phát sinh dới dạng các sọc vàng kéo dài từ mép lá
cách đỉnh vài cm. Trên phiến lá, vết bệnh lan rộng theo cả chiều dài và rộng, có mép
viền hình sóng rồi trở nên vàng sau vài ngày. Khi bệnh tiến triển, vết bệnh lan rộng
phủ kín cả mặt lá, chuyển từ trắng sang xám nhạt do sự sinh trởng của các nấm hoại

sinh. Đối với các giống cảm nhiễm, vết bệnh lan rộng tới bẹ lá và có thể phát triển
xuống tận phần dới của bẹ lá, làm phiến lá bị héo và cuộn lại trong khi lá vẫn còn
xanh, sau đó toàn bộ phiến lá có thể bị héo rồi khô đi.
ở các ruộng lúa bị bệnh nghiêm trọng, hạt cũng có thể bị nhiễm bệnh. Trên
vỏ hạt xuất hiện các đốm màu nhạt, xung quanh có mép viền dạng giọt dầu. Khi hạt
4
còn non và xanh các vết bệnh lộ rõ, khi bông chín vết bệnh sẽ có màu xám,, hoặc
trắng hoặc vàng nhạt [6], [19].
1.2.3. các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển của bệnh
Trong dự báo bệnh bạc lá, yếu tố khí hậu là đối tợng để phân tích. Các nhà
khoa học phát hiện thấy rằng mức độ nhiễm bệnh tơng quan với tổng lợng ma, mức
độ ngập lụt, gió mạnh và độ sâu nớc tới. Nhiệt độ tơng đối cao trong thời kỳ lúa sinh
trởng có thể làm tăng bệnh, song mùa hè quá nóng và khô là điều kiện hạn chế bệnh.
Kỹ thuật trồng trọt cũng là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hởng
đến sự phát sinh, phát triển bệnh, song cũng rất phức tạp vì một mặt nó ảnh hởng tới
sự phát sinh phát triển của cây lúa - làm tăng hay làm giảm tính chống chịu, mặt
khác nó ảnh hởng tới tiểu khí hậu đồng ruộng. Trong các yếu tố kỹ thuật chăm sóc
thì phân bón có ảnh hởng rõ rệt nhất tới sự phát sinh, phát triển của bệnh. Cụ thể là
bón đạm quá nhiều, bón thúc muộn, thiếu lân, kali và magie đều làm tăng bệnh. ở
những nơi đất chua, úng ngập đặc biệt ở những vùng đất nhiều mùn, hàng lúa bị
chắn nắng thì bệnh bạc lá có thể phát triển mạnh hơn [6].
Trong tất cả các giai đoạn sinh trởng, cây đều có thể bị nhiễm bệnh nhng ở
mức độ khác nhau tuỳ từng giai đoạn sinh trởng. Nói chung, từ thời kì mạ đến khi
lúa đẻ nhánh là thời kỳ bệnh tơng đối ít hơn so với giai đoạn cuối đẻ nhánh. Giai
đoạn lúa làm đòng - trỗ - chín sữa là giai đoạn rất mẫn cảm với bệnh, hiện tợng này
thể hiện khá rõ nét trên các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, có năng suất cao, cấy
trong vụ Chiêm xuân và vụ Mùa [11].
1.2.4. Tác hại của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn
Bệnh bạc lá vi khuẩn đã làm giảm năng suất lúa gạo hằng năm ở Châu á
xuống 60%. Ví dụ ở Nhật những năm gần đây, có khoảng 300.000 - 400.000 hecta

lúa bị ảnh hởng bởi bệnh này và năng suất giảm 20 - 50%. ở những cánh đồng
nhiễm bệnh ngiêm trọng ở Indonesia, sản lợng lúa còn thấp hơn so với ở Nhật; còn
ở ấn độ, hàng triệu hecta lúa nhiễm bệnh nghiêm trọng làm cho năng suất giảm từ 6
- 60%. ở Việt Nam, bệnh bạc lá đợc phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, đặc
biệt từ năm 1965 trở lại đây bệnh thờng xuyên phá hoại nghiêm trọng ở các vùng
trồng lúa [6], [19].thì sao?
1.2.5. Các biện pháp phòng trừ
5
Căn cứ vào đặc điểm sinh học của vi khuẩn gây bệnh, các nhà khoa học đã đa
ra những biện pháp phòng trừ tổng hợp nh: xử lý hạt giống trớc khi gieo nếu lô hạt
bị nhiễm bệnh, bón phân đúng kỹ thuật và đúng giai đoạn, ruộng lúa cần điều chỉnh
mức nớc thích hợp, chú ý vệ sinh đồng ruộng hoặc có thể sử dụng thuốc hóa học để
hạn chế sự phát sinh, phát triển của bệnh... [6].
Cho đến nay, việc sử dụng giống chống chịu bệnh vẫn là biện pháp có hiệu
quả nhất vì giảm đợc chi phí do sử dụng thuốc hóa học và bảo vệ môi trờng tốt hơn.
Chính vì vậy, việc chọn tạo ra những giống lúa kháng bệnh bạc lá luôn là mục tiêu
hàng đầu của các nhà tạo giống trên thế giới cũng nh ở Việt Nam [24], [30].
Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại các nhà nghiên cứu tìm thấy
khoảng 24 gen kháng bệnh bạc lá ở nhiều loài lúa hoang dại và các giống lúa địa ph-
ơng. Gen kháng đợc thống nhất có tên là Xa + số thứ tự, ví dụ nh Xa1, Xa2... Trong
số đó, Xa21 có phổ kháng rộng và đợc chú ý nhiều trong công nghệ chuyển gen
hiện nay [20], [27].
1.2.6. Một số thành tựu trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn
Trong 50 năm gần đây, các nhà khoa học đã phát triển nhiều kỹ thuật thanh
lọc ngân hàng gen đối với tính trạng chống chịu vi khuẩn, côn trùng gây hại cây
trồng, xác định nguồn cung cấp gen kháng. Với phơng pháp chọn giống truyền
thống, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều giống cây trồng kháng bệnh bạc lá và đợc
gieo trồng với diện tích hàng triệu ha. Và c họn giống ngoài đồng ruộng, khảo
nghiệm và tạo các giống lúa chống chịu bệnh từ lâu đã đ ợc thực hiện ở nhiều n ớc
trên thế giới. Không hiểu ý câu này?

ở Nhật Bản, gần đây các nhà khoa học đã chọn đợc nhiều giống lúa kháng
bệnh đợc sử dụng để lai tạo ra các giống mới nh giống Sengoku 4, Magatama,
Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiên, kết quả kiểm tra ngoài đồng ruộng cho thấy cha
chọn đợc giống có tính chống chịu cao với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá mới đợc
giám định gần đây.
Năm 1968, Sakaguchi và CS đã khảo nghiệm 863 giống lúa đợc trồng phổ
biến ở nhiều nơi trên thế giới và phát hiện giống lúa Lead của Miến Điện, TKM6 và
Nigeria 5 chống chịu khá với hầu hết các nhóm vi khuẩn gây bệnh bạc lá thuộc các
nòi khác nhau [9], [11].
ở việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu để chọn tạo giống lúa mang gen kháng
bệnh bạc lá. Nh ở Viện Lúa Đồng bằng sông Ccửu lLong, bằng phơng pháp đánh
giá kiểu gen nhờ chỉ thị phân tử đối với 148 giống lúa địa phơng có nguồn gốc
6
Duyên hải Trung Bộ cho thấy các giống lúa: Cà Đung, Ba Túc, Thơm Lung, Vệ
Phích, Lúa Trắng, Nếp Hoa Vàng, Lúa Thớc, Quinkes 85 và Seraup kechil 30 có gen
kháng Xa13; gen kháng Xa5 đợc tìm thấy trên giống Nàng Tri, Trắng Lùn, Be Ren,
Giàu Dumont; giống Lúa Sóc, Lúa Mùa 2, Trắng Quãng, Trắng Phớc, Tàu Hơng,
Nàng Sậu có gen kháng Xa4 [4].
1.3. ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hình ADN
1.3.1. Phản ứng PCR
Kỹ thuật nhân bản ADN đặc hiệu dựa vào phản ứng chuỗi trùng hợp
(Polymerase Chain Reaction) đợc Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80
đã góp phần tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật PCR là
một phơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen. Sử dụng
kỹ thuật PCR có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp
mà không phải tách và nhân dòng. Thực chất PCR là một phơng pháp in vitro
vi tro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lợng
mẫu ban đầu hạn chế [8], [5]. Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu
kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1 (Biến biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 95

0
C trong
thời gian khoảng 1 phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN kép tách thành hai
sợi đơn.
+ Giai đoạn 2 (Ggắn mồi): ở nhiệt độ từ 30
0
C đến 65
0
C trong khoảng 30 giây
đến 1 phút thì các mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai
đầu đoạn ADN cần nhân. Nhiệt độ của bớc gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ
thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi [3], [5].
Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm = 81,5 + 16,6(log
10
{J
+
}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)
Trong đó: {J
+
}: nồng độ của các cation hóa trị I
FA: chất dùng để gây biến tính ADN
I: chiều dài của mồi
+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): ở nhiệt độ khoảng 72
0
C, trong khoảng thời
gian từ 30 giây đến nhiều phút (tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần tổng hợp),
khi đó, enzym Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp ADN diễn ra trên
những đoạn giữa cặp mồi theo chiều từ 5- 3.
7

Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lần làm
tăng gấp đôi số mẫu lần trớc. Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nên sau n chu
kì số mẫu thu đợc là:
A = x.2
n
Trong đó A: Tổng số bản sao ADN
x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu
n: Số chu kỳ
Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn
mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn hợp bốn tiền
chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóa trị 1, ion Mg
2+
và dung
môi (nớc khử ion khử trùng).
- Enzym Taq polymerase:
Enzym Taq polymerase là enzym chịu nhiệt, đợc tách từ vi khuẩn suối nớc
nóng Thermus aquaticus. Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa và không mất
hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN, nhng hoạt tính của
enzym Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt độ 92,5
0
C; sau 40 phút ở nhiệt độ 95
0
C
và sau 5 - 6 phút ở nhiệt độ 97
0
C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 95
0
C trong 20 giây để
biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì
phản ứng.

Nồng độ enzym Taq tối u cho phản ứng PCR là 0,5 - 2,5 đơn vị; nhng nếu
nồng độ enzym quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất xúc tác của phản ứng. Ngoài ra, nồng
độ Mg
2+
và dNTP cũng ảnh hởng đến hoạt tính của enzym. Hiện nay, có nhiều loại
polymerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện hơn nh Tth
polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nh một
enzym phiên mã ngợc khi có mặt của ARN khuôn và ion Mn
2+
.
- ADN khuôn (template):
ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi phải có độ
tinh sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN hayARN
đợc biết trớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thờng, nồng độ của ADN
khuôn đợc đa vào phản ứng PCR khoảng 10 - 500 ng.
- Đoạn mồi (primer):
8
Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4 - 10 bazơ (đối với
mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12 - 24 bazơ (đối với mồi đặc trng). Nồng độ mồi
thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1 - 0,5 àM. Lợng mồi đa vào phản ứng
PCR phải phù hợp với lợng ADN cần tổng hợp (thờng 10
6
phân tử ADN cần 10
8
phân tử primer). Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trớc khi số chu kì kết
thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu.
Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng.
Mồi phải đợc thiết kế sao cho không đợc bổ trợ lẫn nhau, số lợng 4 loại bazơ nitơ
trong mồi nên xấp xỉ nhau, lợng G - C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh những
vùng trình tự không bình thờng nh polypurin hoặc polyprimidine hay các trình tự

lặp.
- Các nucleotit (dNTPs):
Là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm
nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các
nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm
biotin hoặc digoxigenin... Nồng độ phản ứng của các dNTP thờng dùng vào khoảng
200 mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10 - 100 mM) Taq ADN
polymerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố nh:
+ Nồng độ Mg
2+

+ Nồng độ chất mồi
+ Độ dài của sản phẩm đợc khuyếch đại
+ Số chu kỳ của phản ứng
- Dung dịch đệm (buffer)
Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzym polymerase đợc sử
dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Ion Mg
2+
làm tăng nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành
cơ chất mà enzym polymerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình
liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg
2+
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ
0,5 - 5,0 mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ ion Mg
2+
quá

thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzym polymerase, còn nếu nồng độ quá
cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu.
9
Nhìn chung nồng độ MgCl
2
có ảnh hởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù
của phản ứng. Ngoài Mg
2+
còn một số chất khác trong dung dịch đệm nh AMSO,
DMSO, formamide đợc thêm vào nh các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm
PCR có kính thớc lớn [3].
Kỹ thuật PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen của sinh
vật vì nó có khả năng tạo ra một lợng lớn trình tự ANDN đặc hiệu từ bất cứ cơ thể
nào. PCR đợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau nh: xác định trình tự trực tiếp
từ đoạn đợc nhân, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định các trình tự
đặc hiệu từ cADN hay th viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, tạo đột biến định
hớng [1].
1.3.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng
Trong những năm gần đây, nhiều kỹ thuật mới ra đời dựa trên nguyên tắc của
PCR cho phép ta xác định đợc tính đa dạng của hệ gen với nhiều u điểm nh kỹ thuật
AFLP, SSR, RFLP, RAPD.....
- Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phép ta
phát hiện đợc tính đa dạng về chiều dài các đoạn ADN đợc nhân bản chọn lọc - cắt
ra bởi enzym giới hạn. Sử dụng kỹ thuật này có thể nhân cùng một lúc một cách đặc
trng với số lợng lớn các đoạn ADN có kích thớc giới hạn. Kỹ thuật AFLP kết hợp đ-
ợc những u điểm của RFLP và RAPD nên nó có hiệu quả trong việc phát hiện đa
hình ADN. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể phân tích tính đa hình một cách nhanh
chóng, ổn định và đáng tin cậy [3].
- Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - đa hình
về chiều dài của các đoạn ADN đợc cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn): Sử

dụng kỹ thuật RFLP có thể tạo nên các đoạn cắt khác nhau đợc phân biệt bằng ph-
ơng pháp điện di. Nhợc điểm của kỹ thuật này là quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó
tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời
thao tác [3], [8].
- Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là vi vệ tinh
(microsatellites), là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tự nucleotit đơn giản
nào đó. Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hình về độ dài các trật tự
nucleotit đơn giản. Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của, công sức
trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình (để xây dựng các cặp
mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen
chứa đoạn lặp lại) [8], [3].
10
- Kỹ thuật RAPD (còn đợc gọi là kỹ thuật phân loại phân tử): đợc sử dụng để
phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng hay giữa các
cá thể, phục vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại. Ưu điểm của kỹ thuật này
là nhanh, rẻ, đơn giản và giúp xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc di truyền
của các giống động vật, thực vật, vi sinh vật.
Năm 1990, William và CS đã phát triển kỹ thuật RAPD (Random Amplified
Polymorphic ADN) trên cơ sở PCR. Về cơ bản, kỹ thuật này sử dụng những đoạn
mồi ngắn khoảng 4 - 10 nucleotit không đặc trng để tiến hành phản ứng PCR. Nhng
đối với mỗi đối tợng, ta phải tiến hành sàng lọc để chọn lọc đợc một số mồi thích
hợp [1]. Sản phẩm PCR khi dùng với mồi ngẫu nhiên thờng đa dạng, có chiều dài từ
100 - 5000 nucleotit và khi điện di trên gel agarose đợc phân tách thành các phân
đoạn khác nhau. Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vì khi có
sự thay đổi một bazơ nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp hợp của mồi với ADN
khuôn. sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen
vào một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản. mỗi
đoạn mồi có thể tạo ra một hoặc một vài sự đa dạng, có thể phát hiện đợc và cho ra
phổ điện di đặc trng. Kỹ thuật RADP đợc sự dụng trong các mục đích nghiên cứu đa
hình di truyền, lập bản đồ gen liên kết và phân tích con lai F1.

u điểm của kỹ thuật RADP là không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên
cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lợng nhỏ ADN khuôn. Bên cạnh đó, chỉ
cần một bộ mồi ta có thể sử dụng đợc với các loài khác nhau trong khi các mẫu dò
RFLP chỉ có thể dùng đợc cho các loài có quan hệ gần gũi nhau. Tính đa dạng thu
đợc từ các chỉ thị RAPD đợc đánh giá cao hơn so với kỹ thuật RFLP và cho phép
phát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các đoạn chứa các trật tự nucleotit lặp lại.
Nhợc điểm của chỉ thị này là: chỉ thị RAPD có tính chất trội do đó những gen điều
khiển tính trạng nào đó có tính lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di. Hơn
nữa, RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích điện di để tìm liên kết
gen thờng không thống nhất [3].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy RAPD là một kỹ thuật có hiệu quả trong
việc xác dịnh kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền
loài và lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để nhận biết và phân loại
các giống cây khác nhau, sự đa dạng di truyền giữa lúa Indica và Japonica, xác định
sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào
trần...
11
Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có độ dài 10 bp để nghiên cứu sự
khác biệt của 23 giống cần tây và chúng đợc chia thành 3 nhóm. Kết quả này cũng
phù hợp khi dùng 6 chỉ thị protein để phân loại các giống cần tây trên (Yang và
Quiros, 1993). Tơng tự nh vậy, nhiều tác giả đã dùng RAPD để lập cây chủng loại
phát sinh (phylogenic tree) của các loài cây nh ngô, đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh
lăng [26], [31].
Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản
phẩm RAPD đợc quan sát thấy ở các cá thể khác nhau và đợc đánh giá theo qui ớc 1
= xuất hiện và 0 = biến mất. Một bảng gồm các giá trị 0 và 1 đợc thiết lập từ các cá
thể nghiên cứu sẽ cho phép tính ra hệ số tơng đồng di truyền của các cặp theo Nei và
Li.
Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài, một số
tác giả (Apostol và CS, 1993) đã xây dựng kỹ thuật phân nhóm thông qua các biểu

đồ RAPD (RAPDLOT). Thực chất kỹ thuật này gồm 3 bớc:
+ Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toán
khoảng cách quan hệ giữa chúng
+ Bớc 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán đợc trớc đó
+ Bớc 3: Giải ma trận và biễu diễn thành một biểu đồ đặc trng [17]
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự
động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng
nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn đợc nhân bản của các cá thể.
NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một chơng
trình thuộc kiểu trên để lập ra biểu đồ hình cây. Biểu đồ hình cây thu đợc sẽ thể hiện
mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa
các cá thể đợc nghiên cứu. Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu
và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ
thuật RAPD.


12
Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tợng nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu tính đa dạng ADN là 36 giống lúa có nguồn gốc, tính
kháng khác nhau với kháng bệnh bạc lá vi khuẩn có nguồn gốc và tính kháng bệnh
khác nhau do do Bộ môn Di truyền Miễn dịch, Viện Khoa học Kkỹ thuật Nnông
nghiệp Việt Nam cung cấp (trình bày nh trong bảng 1, điểm đánh giá tính khángchỉ
mới d/nhiễm của các giống lúa chỉ với một nòi vi khuẩn phổ biến ở vùng Đồng bằng
sông Hồng).
Bảng 1. Danh sách tập đoàn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn
STT Tên giống Nguồn gốc Điểm
1 OM3499-5 Việt Nam 4,0
2 OM3242-50 Việt Nam 5,0

3 OM3496-9 Việt Nam 5,0
4 NTCD1-12 Việt Nam 5,0
5 NTCD1-16 Việt Nam 5,0
6 Tám tiêu Việt Nam 5,5
7 Tám Xuân Bắc Việt Nam 5,5
8 Nếp đen Việt Nam 3,3
9 Nếp cái hoa
vàng
Việt Nam 5,5
10 Nếp sớm Việt Nam 3,3
11 HT1 Trung Quốc 7,7
12 N87 Đài Loan 7,7
13 DV85 IRRI 1,0
14 IRRI1545 IRRI 3,0
15 IRRI20 IRRI 5,0
16 IRRI8 IRRI 5,0
17 KUNTLAN Đài Loan 57,0
18 ZENITH Đài Loan 57,0
STT Tên giống Nguồn gốc Điểm
19 IRRI346 IRRI 7,70
20 MILYANG23 Hàn Quốc 7,0
21 MILYANG42 Hàn Quốc 3,0
22 SUWION290 Hàn Quốc 9,0
23 BJ1
ấn độ
7,70
24 Tẻ tép Việt Nam 7,70
25 BL89 Việt Nam 3,0
26 BL28 Việt Nam 3,0
27 BL31-97

ấn độ
1,0
28 BBL72-99
ấn độ
3,0
29 KBL75-99
ấn độ
3,0
30 KBL53-99
ấn độ
5,0
31 Khang dân Trung Quốc 57,0
32 Chiêm hơng Trung Quốc 9,0
33 Q5 Trung Quốc 7,70
34 DÔ115 Việt Nam 57,0
35 KB1 Việt Nam 7,70
36 TN1 Việt Nam 7,70
Ghi chú 1: Kháng cao 3: Kháng 5: Kháng vừa 7: Nhiễm vừa 9: Nhiễm nặng
13
2.1.2. Hoá chất và thiết bị sử dụng:
- Hoá chất và thiết bị máy móc: Hoá chất và thiết bị sử dụng đợc ghi kèm tên hãng
sản xuất cho tiện theo dõi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); Máy tổng hợp
oligonucleotit tự động - Gene Assemble (Pharmacia, Thụy Điển); Máy đo quang
phổ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mỹ); Máy ly tâm
Avanti
TM
30 (Beckman, Mỹ)
- Các mồi sử dụng trong phản ứng RAPD: Các mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc
phân tích genom của 36 giống lúa kháng bệnh bạc lá lúa vi khuẩn do Phòng Công
nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Trình tự các mồi dài 10

nucleotit đợc thiết kế theo Monna và CS (1994).
Bảng 2: Danh sách 21 mồi ngẫu nhiên dùng trong phân tích tập đoàn 36 giống lúa
kháng bệnh bạc lá vi khuẩn.
Máy ly tâm lạnh (Sigma), máy PCR (Thermal Cycler PTC 100 hãng MJ), máy điện
di (Biorad), máy đo quang phổ Model 8425A (Hewlett Packard), máy chụp ảnh Gel
Doc (Pharmacia) .
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Kỹ thuật tạo cây con và thu lá (theo phơng pháp của phòng Công nghệ tế bào thực
vật)Đinh Thị Phòng, (2001) [7].(Luậna
1. Mồi RA31 5AACCGACGGG 3
2. Mồi RA32 5GGGGGTCGTT 3
3. Mồi RA36 5TACCACCCCG 3
4. Mồi RA40 5GGCGGACTGT 3
5. Mồi RA45 5TACCACCCCG 3
6. Mồi RA46 5CCAGACCCTG 3
7. Mồi RA50 5 GCTGTGCAG 3
8. Mồi RA142 5CAATCGCCGT 3
9. Mồi RA143 5TCGGCGATAG 3
10. Mồi RA159 5GTCCACACGG 3
11. Mồi OPA13 5CAG CAC CCAC 3
12. Mồi OPP19 5GGGAAGGACA 3
13. Mồi UBC391 5GCGAACCTCG 3
14. Mồi V8 5GGACGGCGTT 3
15. Mồi Q14 5GGACGCTTCA 3
16. Mồi GN38
17. Mồi C19 5GTTGCCAGCC 3
18. Mồi O10 5TCAGAGCGCC 3
19. MồiO13 5GTCAGAGTCC 3
20. Mồi O18 5CTCGCTATCC 3
21. Mồi I13 5CTGGGGCTGA 3

14