Luận văn thạc sĩ phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn pasteurella multocidagây bệnh tụ huyết trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại vườn thú hà nội

B GIO DC V O TO
TRNG I HC NễNG NGHIP H NI



U XUN TUN


Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học
của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết
trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại Vờn Thú Hà Nội
nhằm chọn chủng chế vacxin phòng bệnh


LUN VN THC S NễNG NGHIP


Chuyờn ngnh : TH Y
Mó s : 60.62.50
Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS. C HU PH


H NI - 2010
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp………… .
i

Lêi cam ®oan

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố
trong bất kì công trình nào khác.

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã
ñược chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn.

Tác giả luận văn


Âu Xuân Tuấn














Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp………… .
ii

Lêi c¶m ¬n

ðể hoàn thành luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi luôn
nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ của nhà trường, bạn bè ñồng nghiệp.
Trước tiên tôi xin chân thành cám ơn sự giúp ñỡ quý báu của các thầy cô giáo
bộ môn Bệnh lý, các thầy cô giáo khoa Thú y, Viện sau ðại học- Trường ðại

học Nông nghiệp Hà Nội ñã dành nhiều thời gian và công sức giúp ñỡ tôi
trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS Cù Hữu Phú
PGS.TS Nguyễn Hữu Nam
ðã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong qua trình thực hiện và hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc Viện Thú y, anh chị em Bộ
môn Vi trùng- Viện Thú y cùng bạn bè ñồng nghiệp và gia ñình ñã giúp ñỡ
ñộng viên tôi hoàn thành chương trình học tập cao học và hoàn thành Luận
văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2010
Tác giả luận văn


Âu Xuân Tuấn



Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
iii

Mục lục

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu v

Danh mục bảng vi
Danh mục ảnh viii
1 Mở đầu i
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 2
1.3 ý nghĩa khoa học và thực tế của đề tài 2
2 Tổng quan tài liệu 3
2.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm
trên thế giới và trong nớc 3
2.2 Một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida 6
2.3 Dịch tễ học và con đờng truyền bệnh 22
2.4 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 23
2.5 Tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Pasteurella
multocida 25
2.6 Vacxin phòng bệnh 26
3 Đối tợng - nội dung- nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 30
3.1 Đối tợng nghiên cứu 30
3.2 Nội dung nghiên cứu 30
3.3 Nguyên liệu 30
3.4 Phơng pháp nghiên cứu 33
4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 44
4.1 Tình hình nhiễm bệnh và tỉ lệ chết của chim, gà cảnh do vi khuẩn
Pasteurella multocida 44
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
iv

4.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi. 47
4.3 Kết quả phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây
bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim, gà tại Vờn Thú Hà Nội 49
4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh: 49

4.3.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn Pasteurella phân lập đợc. 51
4.3.3 Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh hóa của của vi khuẩn 52
4.4 Kết quả định type các chủng Pasteurella multocida phân lập
đợc tại Vờn Thú Hà Nội 56
4.5 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida
phân lập đợc. 58
4.6 Kết quả xác định LD50 trên chuột bạch (liều gây chết 50% động
vật thí nghiệm 60
4.7 Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân
lập đợc trên đàn chim, gà nuôi tại Vờn thú hà nội. 62
4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng
chim, gà cảnh nuôi tại Vờn Thú Hà Nội. 65
4.8.1 Chế tạo thử nghiệm vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng
bệnh Tụ huyết trùng cho chim, gà cảnh tại Vờn thú Hà nội. 65
4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên động vật thí
nghiệm. 66
4.8.3 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên gà thả vờn. 68
4.7.4 Kết quả thử hiệu lực của Vacxin trên chim, gà tại vờn thú Hà
Nội bằng phơng pháp bảo hộ thụ động trên chuột (Passive
mouse protection test- PMPT) 71
5 Kết luận và đề nghị 74
5.1 Kết luận 74
5.2 Đề nghị 75
Tài liệu tham khảo 76
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp………… .
v

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vµ ký hiÖu

P. multocida: Pasteurella multocida

LPS Lypopolysaccharides
CPS Polysaccharide
SDS- PAGE Nadodelcyl sulphate- polyacrylamide
gel electrophoresis
DNA Deoxyribonucleic Acid
BHI Brain Heart Infusion
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
ELISA Enzyme – linked Immunosorbant assay
IHA Indirect Haemagglutination test
LPS Lypopolysaccaride
MR Methyl red
PBS Phosphat buffur solution
PCR Polymerase Chain Reaction
LD
50
Lethal dosis 50 (Liều g©y chết 50%)
MLD: Minimal lethal Dosis (Liều chÝ tử tối thiểu)
PMPT Passive mouse protection test
NCCLS National Commitee of Clinical Laboratory Standards


Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
vi

Danh mục bảng

STT Tờn bng Trang

2.1 Các phản ứng sinh hoá học của Pasteurella multocida 11
2-2. Đặc điểm phân biệt các Pasteurella khác nhau 12

2.3 Kết quả định type Pasteurella multocida theo Carter (1955) -
Namioka (1961) 20
2.4 Kết quả định type P multocida 21
3.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng một số loại
kháng sinh 43
4.1 Tình hình nhiễm bệnh và tỉ lệ chết do tụ huyết trùng của chim, gà
cảnh tại Vờn Thú Hà Nội 45
4.2 Tỉ lệ chim, gà chết do Tụ huyết trùng theo tuổi ở Vờn Thú Hà Nội 47
4.3 Kết quả phân lập Pasteurella multocida gây bệnh từ chim, gà tại
Vờn Thú Hà Nội từ năm 2008- 2010. 50
4.4 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng
vi khuẩn Pasteurella phân lập đợc 53
4.5 Kết quả kiểm tra khả năng lên men đờng của các chủng vi
khuẩn P. multocida phân lập đợc từ Vờn Thú Hà Nội. 54
4.6 So sánh các đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn gây
bệnh phân lập đợc với các tác giả khác. 55
4.7 Kết quả định type các chủng P. multocida phân lập đợc 57
48 Tổng hợp kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella
multocida phân lập đợc trên chuột bạch (n= 25). 59
4.9 Kết quả xác định liều LD
50
trên chuột bạch của chủng Pas.1VT
phân lập đợc từ Vờn Thú Hà nội 61
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
vii

4.10 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng P.multocida phân lập đợc
từ Vờn Thú Hà Nội. 63
4.11 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu của lô vacxin 66
4.12 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột 67

4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột bạch 67
4.14 Kết quả thử hiệu lực vacxin Tụ huyết trùng trên gà thả vờn. 69
4.15 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin sau khi tiêm 21 ngày bằng phản
ứng bảo hộ thụ động trên chuột 72


Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
viii

Danh mục hình

STT Tên hình Trang

1 Bệnh tích gà cảnh nuôi tại vờn thú chết do mắc bệnh tụ huyết
trùng 46

2 Tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim, gà cảnh theo lứa
tuổi tại Vờn thú Hà nội 47

3 Hình thái vi khuẩn P. multocida chụp dới kính hiển vi (độ phóng
đại 1000 lần) 52

4 Vi khuẩn Pasteurella multocida nuôi cấy trên môi trờng thạch máu 52

5 Phản ứng Indol dơng tính 56

6 Phản ứng lên men đờng của vi khuẩn P. multocida 56

7 Các sản phẩm của phản ứng PCR. 58
8 Kết quả thử kháng sinh đồ của các chủng P.multocida phân lập

đợc 65




Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
1

1. Mở đầu

1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Vờn Thú Hà Nội là một cơ sở nuôi dỡng và trng bày động vật phục
vụ khách tham quan nâng cao dân trí. Đây còn là cơ sở để nghiên cứu khoa
học về động vật, là nơi bảo tồn và nhân nuôi, phát triển nguồn gen quý của
nớc ta. Trong số 96 loài và phân loài động vật đang đợc nuôi dỡng tại đây
có 35 loài thuộc diện quý hiếm và đặc hữu đợc ghi trong sách đỏ Việt Nam.
Trong nhiều năm qua vờn thú đ tập trung nghiên cứu bảo tồn đàn chim, thú
đặc biệt là các loài chim và gà cảnh. Tuy nhiên một trong những khó khăn
hiện nay là dịch bệnh còn rải rác xảy ra quanh năm và làm thế nào để phòng
chống dịch bệnh có hiệu quả trong điều kiện chăn nuôi của vờn thú.
Loài chim và gà cảnh đợc đa vào nuôi nhốt trong một không gian chật
hẹp, chúng luôn bị tác động bởi các yếu tố stress nh: Thời tiết, khí hậu, thức ăn
và các hoạt động x hội của con ngời làm thay đổi các tập tính tự nhiên, ảnh
hởng đến sức khoẻ, trạng thái sinh lý, dễ mắc các bệnh truyền nhiễm, dinh
dỡng, nội khoa .v.v dẫn đến tử vong. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm các giải
pháp và phòng trị bệnh cho các loài này trong điều kiện nuôi nhốt là cần thiết.
Một trong những bệnh truyền nhiễm xảy ra với chim và gà cảnh đó là
bệnh Tụ huyết trùng (Pasteurellosis). Bệnh đ gây chết chim và gà cảnh đặc
biệt trên các loài quý hiếm nh gà lôi lam mào trắng, gà lôi lam đuôi trắng, trĩ
khoang, công, trĩ sao và đ làm ảnh hởng lớn đến việc bảo tồn của loài này.

Vì vậy việc sử dụng vacxin tiêm phòng tạo miễn dịch chủ động là biện pháp
quan trọng để phòng bệnh cho đàn chim, gà cảnh.
ở nớc ta cũng nh nhiều nớc trên thế giới đ ứng dụng nhiều phơng
pháp chế tạo vacxin và việc chế vacxin đ có nhiều cải tiến. Nhng cho đến
nay việc dùng vacxin Tụ huyết trùng gia cầm phòng bệnh cho đàn chim, gà
cảnh vẫn cha cho kết quả phòng bệnh nh mong muốn. Nguyên nhân chủ
yếu là do vi khuẩn Pasteurella có cấu trúc kháng nguyên phức tạp, độc lực
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
2

thay đổi theo cơ thể động vật và điều kiện môi trờng. Đây là đặc điểm sinh
học quan trọng của mầm bệnh.
Vì vậy sử dụng vacxin tự chế (Autovacxin) để nâng cao hiệu lực phòng
bệnh của vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella gây ra
trên đàn chim, gà cảnh nuôi tại vờn thú Hà Nội là một trong những giải pháp
tốt để bảo vệ cho đàn chim, gà nuôi tại Vờn thú Hà Nội. Dựa trên các cơ sở
khoa học và đòi hỏi của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài:
Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn
Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại
Vờn Thú Hà Nội nhằm chọn chủng chế vacxin phòng bệnh"
1.2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, xác định một số đặc tính vi sinh vật học quan trọng của các
chủng vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho chim và
gà cảnh nuôi tại Vờn thú Hà Nội.
- Chọn chủng vi khuẩn Pasteurella multocida sử dụng chế vacxin
phòng bệnh cho đàn chim, gà cảnh nuôi tại Vờn thú Hà Nội.
1.3. ý nghĩa khoa học và thực tế của đề tài
- Xác định đợc đặc tính vi sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella
multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho đàn chim và gà cảnh nuôi tại Vờn
thú Hà Nội.

- Xác lập cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp về bệnh Tụ huyết
trùng ở loài chim, gà cảnh đặc hữu của Việt Nam góp phần trong công tác bảo
tồn nguồn gen của loài này.
- Đáp ứng yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết của Vờn Thú Hà Nội về phòng
trị bệnh Tụ huyết trùng của đàn chim và gà cảnh.

Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
3

2. Tổng quan tài liệu

2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm trên
thế giới và trong nớc
Theo De Alwis (1992)[35], ngời đâu tiên phát hiện mầm bệnh gây Tụ
huyết trùng gà (Fowl cholera) là Louis Pasteur từ những năm 1880. Sau khi
phân lập đợc mầm bệnh từ xác gà chết, ông đ nuôi cấy trên môi trờng nớc
thịt rồi làm giảm độc lực để chế vacxin phòng bệnh.
Năm 1886 nhà giải phẫu học ngời Đức Hueppe nhận thấy những nét
tơng đồng của một loại bệnh ở các loài động vật khác nhau đợc gây ra do
cùng một loại vi khuẩn và Trevisan (1887) đ đề nghị đặt tên vi khuẩn là
Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur.
Vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc giống (Genus): Pasteurella, loài
(Type species): Pasteurella multocida (Bergeys manual of Determinative
bacteriology- 1994). Trớc đây vi khuẩn Pasteurella sp. đợc gọi bằng nhiều
tên khác nhau nh Micrococcus gallicium (1883), Octopsis cholerae
gallinarrum (1885), Pasteurella cholerae gallinarum (1887), Pasteurella
avicida (1889), Bacterium bipolar multicidum (1893), Bacterium avicepticus
(1912). Đến năm 1939, Rosenbusch và Merchant [61] đặt tên vi khuẩn là
Pasteurella multocida và đợc thế giới chính thức công nhận.
Từ đó đến nay nhiều loại Pasteurella mới đợc liên tục đợc xác định:

P. haemolytica (1932); P. pneumotropica (1950); P. gallinarum (1955);
P. uerae (1962) nay gọi là Actinobacillus ureae và loại vi khuẩn sinh khí
P. aeroganis (1974).
Bệnh Tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra là bệnh
truyền nhiễm cấp tính, xảy ra ở tất cả các loại gia cầm, các loại chim, gia cầm
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
4

và có mặt khắp thế giới. Bệnh thờng xảy ra ở thể nhiễm trùng máu với tỉ lệ
chết cao. Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, theo đánh giá ở Mỹ chỉ riêng bệnh
Tụ huyết trùng gia cầm đ thiệt hại 200 triệu đô la vào năm 1986 (Ratafia).
Bệnh còn là mối đe doạ tới sự tồn tại của các loài chim hoang d đang dần bị
tiệt chủng.
Từ những năm 1870, bệnh thờng đợc gọi Avian cholera khi nó có
liên quan đến chim hoang d ngoài ra bệnh còn đợc gọi là Avian cholera,
Avian pasteurellosis, Avian hemorraghic septicemia, Pasteurella avicida và
Bird cholera.
Bệnh Tụ huyết trùng đ đợc Chabert nghiên cứu lần đầu tiên ở Pháp
vào năm 1780, theo thông báo bệnh này hoành hành ở phía Đông ấn độ vào
năm 1817 và xảy ra liên tục ở Pháp vào giữa những năm 1825 và 1900. Năm
1836 Maillet đ đặt tên là Fowl cholera.
Năm 1932 Devolt và Davis lần đầu tiên miêu tả bệnh Tụ huyết trùng ở gà
tây. Theo nghiên cứu của Anonymous (1867)[17], Salmon (1899) [64] và Gray
(1913)[39] tất cả các chim hoang d là những nguồn lây nhiễm cho gà nhà.
ở Việt nam, theo tác giả Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958)
bệnh Tụ huyết trùng trâu bò đợc phát hiện vào năm 1868 bởi Coudaminae ở
Bà Rịa, Long Thành.
Năm 1869, Gemai đ phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersin (1869) phát
hiện bệnh ở các tỉnh Trung bộ. Năm 1901 Shesin đ xác nhận có bệnh này ở
Tây Ninh. Những năm sau này Nguyễn Vĩnh Phớc (1978)[10], Hoàng Đạo

Phấn (1986) [9] đ nghiên cứu về đặc tính của Pasteurella multocida và typ
huyết thanh học của chúng.
Theo Nguyễn Xuân Bình (1995)[1] bệnh Tụ huyết trùng ở Long An trên
gà 30 ngày tuổi tỉ lệ mắc thấp là 0,97%; giai đoạn 31- 60 ngày tuổi mắc cao
nhất 8,44%; giai đoạn trên 60 ngày tuổi mắc thấp hơn (5,08%).
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
5

Theo Lê Lập (1996) [5] tỷ lệ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
trên gia cầm ở một số tỉnh miền Trung trung bình là 12,5%.
Dơng Thế Long và Lê Văn Tạo,(1995)[6] nghiên cứu phân lập đợc
các chủng P. multocida M
35
; M
36
, Q
16
ở Sơn La đ có kết luận M
35
, Q
16
, thuộc
type A, M
36
thuộc type D.
Để nâng cao hiệu lực của vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng, Phan
Thanh Phợng (1993)[12] đ nghiên cứu chế tạo vacxin Tụ huyết trùng gia cầm
từ chủng N
41
, tác giả Lê lập (1996)[5] nghiên cứu một số đặc tính sinh học và

miễn dịch của vacxin N
41
và các chủng của Pasteurella multocida phân lập ở gia
cầm ở một số tỉnh miền Trung, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng vacxin.
Bệnh tụ huyết trùng gia súc, gia cầm là những đề tài đ đợc nghiên
cứu từ rất sớm, Phan Thanh Phợng (1989)[11] nghiên cứu về cơ sở miễn dịch
và dịch tễ điều khiển phòng chống đặc hiệu bệnh Tụ huyết trùng gia súc và gia
cầm ở Việt nam, Nguyễn Ng (1994)[7] nghiên cứu về tính kháng nguyên và
độc lực vi trùng ở khu vực miền Trung. Nguyễn Thiên Thu (1996)[14] nghiên
cứu về khả năng mang khuẩn tụ huyết trùng ở trâu bò miền trung. Qua kết quả
nghiên cứu đ đa ra đợc nhiều những thành tựu mang ý nghĩa khoa học,
thực tiễn. Song do bản chất phức tạp về dịch tễ, cấu trúc kháng nguyên của vi
khuẩn Pasteurella multocida và độ mẫn cảm theo từng loài nên cho đến nay
bệnh Tụ huyết trùng vẫn là bệnh gây thiệt hại về kinh tế cho ngành chăn nuôi.
Đối với các loài gà cảnh và chim hoang việc nghiên cứu các bệnh gây
hại cho các loài này ngoài thiên nhiên, cũng nh nuôi nhốt trong các vờn thú
còn ít hoặc không có sẵn những thông tin trên thế giới, vì loài này là một loài
đặc hữu của Việt Nam. Theo Đặng Gia Tùng và cs (1998)[16], qua kết quả
điều tra từ năm 1997 đến nay thấy rằng bệnh Tụ huyết trùng xảy ra rải rác
quanh năm, song tập trung vào tháng 6- 8 chiếm 52,5% so với tổng số ca mắc
bệnh Tụ huyết trùng trong cả năm. Hầu hết các cá thể trong loài đều rất mẫn
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
6

cảm với bệnh này. Bệnh gây thiệt hại về kinh tế cũng nh làm giảm số lợng
cá thể loài dẫn đến nguy cơ tiệt chủng của các loài gà cảnh, chim quý hiếm
đặc hữu của nớc ta, gây ảnh trực tiếp đến công tác bảo tồn các loài này.
2.2. Một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida
2.2.1. Hình thái vi khuẩn và hình dạng khuẩn lạc
Pasteurella sp là loại cầu trực khuẩn ngắn gram âm, bắt màu rõ ở hai

đầu, không di động, không hình thành nha bào. Kích thớc vi khuẩn từ 0,6-
2,5à x 0,2- 0,4à, vi khuẩn thờng đứng riêng lẻ, đôi khi ghép đôi hoặc tạo
thành chuỗi ngắn (Pasteur, 1880)[71]; (Breed và cộng sự, 1952)[23].
Kích thớc và hình thái vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của
chúng (Smith,1959)[65]. Theo một số tác giả khác nh Carter, 1967[29];
Rhoades và Rimler, 1992 [53], Rhoades, Rimler và Sandhu, 1992 [54], hình
thái vi khuẩn có xu hớng không ổn định trong quá trình nuôi cấy, nếu nuôi
cấy trong điều kiện không thuận lợi, hoặc cấy truyền nhiều lần, vi khuẩn có
hình sợi chỉ mặt khác, hình thái vi khuẩn còn thay đổi tuỳ theo sự hình thành
giáp mô của nó. Các vi khuẩn có giáp mô thờng lớn hơn các vi khuẩn không
có giáp mô.
Vi khuẩn Pasteurella trong các bệnh phẩm máu, các tổ chức của gia
súc, gia cầm bị bệnh, các canh khuẩn mới phân lập từ gia cầm mắc bệnh hoặc
chết trong các ổ dịch, đợc nhuộm bằng thuốc nhuộm Anilin thờng bắt màu
lỡng cực rõ rệt, nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm. Tính bắt màu lỡng
cực của vi khuẩn là do tế bào đang trong thời kỳ sinh sản, trớc khi phân chia
có sự tích tụ vật chất trong nguyên sinh chất tập trung ở 2 đầu, nên khi nhuộm
bằng Giemsa hoặc các thuốc nhuộm Anilin hoà tan khác tế bào vi khuẩn sẽ
bắt màu rõ ở hai đầu, còn phần giữa vi khuẩn không bắt màu.
Theo Wei và Carter, 1978 [67] tính bắt màu lỡng cực liên quan đến vị
trí của thể Chromatin trong vi khuẩn P. multocida.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
7

Hình thái khuẩn lạc: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trờng thạch Dextrose
Starch agar (DSA) ở nhiệt độ 37
0
C, sau 24 giờ hình thành các khuẩn lạc hình
tròn, trơn, láng, đờng kình từ 1- 3mm, canh khuẩn có mùi đặc trng
(Rhoades và cộng sự, 1992)[53].

Trên môi trờng có bổ xung 10% máu cừu, vi khuẩn mọc thành khuẩn
lạc to hơn, để vài ngày trong phòng vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc từ 1-
2mm.
Theo Rhoades và Rimler, 1992 [53], nếu nuôi cấy lâu ngày, khuẩn lạc
sẽ to, nhớt và dính. Khi cấy chuyển liên tục, giáp mô bị mất, khuẩn lạc nhỏ
hơn, không mầu và trong suốt.
Theo Hoàng Đạo Phấn,1986 [9] khi nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella
mutocia trên môi trờng thạch đĩa ngày đầu vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc
nhỏ dạng lồi, trơn, bóng. Khi nuôi cấy lâu ngày thì khuẩn lạc trở nên trắng
hơn, bám sâu vào mặt thạch, kích thớc khuẩn lạc từ 1,0- 2,0 mm.
Hình dạng kích thớc của khuẩn lạc còn phụ thuộc vào thành phần của
môi trờng nuôi cấy. Một số chủng vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc xù xì,
nhng nuôi cấy trên môi trờng có thêm huyết thanh thì có thể tạo ra khuẩn
lạc trơn, bóng láng và có dung quang sắc cầu vồng.
Nghiên cứu khuẩn lạc P. multocida, Carter, 1958 [26], Namioka và
Murata, 1961 [50], Heddleston, 1975 [44] đ phân biệt ba dạng khuẩn lạc cơ
bản là:
- Dạng S (Smooth): Khuẩn lạc trơn, láng, lóng lánh, có dung quang sắc
cầu vồng (Iridescence)
- Dạng M (Mucoid): Khuẩn lạc nhầy, ớt có dung quang sắc cầu vồng
yếu hơn
- Dạng R (Rough): Khuẩn lạc xù xì thờng có dung quang màu xanh
Heddleston và cộng sự, 1964 [46] cho thấy, những khuẩn lạc có dung
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
8

quang của vi khuẩn mới phân lập đợc, thờng đồng đều phát quang, có xu
hớng dính vào nhau. Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ thể bệnh mn tính
thờng có dung quang mầu xanh.
Theo Rimler, 1992 [59] khuẩn lạc vi khuẩn P. multocida chủ yếu ở 2

dạng là khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc có dung quang
mầu xanh (Blue). Những khuẩn lạc có dung quang mầu xanh thờng không có
hoặc có ít giáp mô, không có độc lực hoặc có ít độc lực, khuẩn lạc dạng R có
dung quang màu xanh lơ.
Hughes (1930) nghiên cứu hình thái khuẩn lạc của 210 chủng P.
multocida phân lập từ gà, tác giả chia làm 3 type: Type thứ nhất có dung
quang, gây bệnh cấp tính, với tỷ lệ chết cao, type thứ 2, các khuẩn lạc có ánh
xanh, độc lực thấp, gây bệnh nhẹ. Type thứ ba có tính chất trung gian giữa 2
type trên về dung quang và độc lực.
Rosenbusch và Merchant, 1939 [62] cho biết, vi khuẩn P. multocida
nuôi cấy trên thạch máu hay tiêm truyền qua động vật, thấy khuẩn lạc tăng
cờng độ dung quang. Các chủng cờng độc, mới phân lập có dung quang
mạnh. Tác giả cho rằng hiện tợng dung quang của khuẩn lạc liên quan tới
tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng có bớc
sóng nhất định có trong vi khuẩn. Hiện tợng sắc cầu vồng có liên quan tới
khả năng tạo giáp mô vi khuẩn.
2.2.2 Đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella multocida
2.2.2.1. Đặc tính nuôi cấy và môi trờng dinh dỡng vi khuẩn
Pasteurella multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện,
nhng thích hợp ở môi trờng hiếu khí hơn, đặc biệt cộng thêm 5% Carbon
dioxide- CO
2
(Carter, 1984) [32]. Vi khuẩn mọc tốt ở nhiệt độ 37- 38
0
C,

pH
hơi kiềm từ 7,2 đến 7,4. Vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn nếu bổ xung thêm 10%
huyết thanh động vật. Môi trờng tốt nhất để nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .

9

multocida là thạch Hottinger với 10% máu cừu, 10% chiết xuất ngô.
Theo Hoàng Đạo Phấn, 1986 [9] vi khuẩn Pasteurella multocida mọc tốt
trong môi trờng nớc thịt pepton, sau một ngày đêm vi khuẩn làm đục môi
trờng vài ngày sau nớc thịt trở nên trong, đáy có cặn nhày lắc khó tan, trên
mặt môi trờng có một lớp màng mỏng khi lắc lớp màng này vỡ ra. Tác giả còn
cho thấy rằng: Vi khuẩn mới đợc phân lập mọc tốt trong các môi trờng thông
thờng, nhng khi nuôi cấy tiếp tục sẽ mọc yếu, vì vậy phải cho thêm vào môi
trờng nuôi cấy huyết thanh, điều này giải thích sự cần thiết của việc cấy
chuyển vi khuẩn qua thạch máu khi giữ giống tơi.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn ở môi trờng lỏng có thể dùng
phơng pháp sục khí để tăng cờng sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella
multocida. Khi so sánh phơng pháp nuôi cấy tĩnh và phơng pháp sục khí
thấy lợng vi khuẩn tăng 20 lần ở cùng loại môi trờng. Ngời ta đ áp dụng
phơng pháp nuôi cấy này để tăng số lợng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn
nhằm rút ngắn thời gian nuôi cấy và giảm liều lợng tiêm vacxin trong sản
xuất vacxin.
2.2.2.2. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Vi khuẩn thực hiện qúa trình trao đổi chất với môi trờng dinh dỡng
nhờ các phản ứng sinh hoá học xảy ra trong tế bào. Các sản phẩm trung gian
đợc tạo thành làm thay đổi độ pH của môi trờng. Phản ứng sinh hoá mang
tính đặc trng cho mỗi giống, loại vi khuẩn. Do đó phản ứng sinh hoá đợc
dùng để định danh vi khuẩn
Đặc tính sinh hoá học của Pasteurella multocida đ đợc nhiều tác giả
nghiên cứu. Lignieres, (1900)[70] cho biết Pasteurella multocida không làm
tan chảy Gelatin, không phân giải Lactose, không sinh Indol.
Rosenbusch và Merchant, 1939 [62] nghiên cứu sự lên men đờng đ
chia P. multocida thành 3 nhóm.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .

10

- Nhóm 1: gồm các chủng P. multocida phân giải Arabinose và
Dulcitol, không phân giải Xylose.
- Nhóm 2: gồm các chủng phân giải Xylose, không phân giải Arabinose
và Dulcitol.
- Nhóm 3: gồm tất cả các chủng phân giải cả Arabinose, Dulcitol và
Xylose.
Tác giả còn cho thấy khi nuôi cấy lâu trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn
mất khả năng phân giải Arabinose và Xylose. Tất cả các chủng nghiên cứu trên
đều sinh Indol, không di động, không dung huyết và không phân giải Urea.
Dorsey, 1963 [37] nghiên cứu 409 mẫu P. multocida phân lập từ gia
cầm cho thấy 81,42% thuộc nhóm I; 16,87% thuộc nhóm II; 1,71% thuộc
nhóm III. Ngoài ra có 23 mẫu phân lập không thể xếp loại.
Theo Carter, 1984 [32] Vi khuẩn Pasteurella multocida dơng tính
trong các phản ứng Nitrat, Indol, Oxydaza, Catalaza. Âm tính trong các phản
ứng dung huyết, di động, Gelatin, MacConkey, không lên men các loại đờng
Lactoza, Mantoza, Arbinoza, Dulcitol. Khả năng lên men Saccaroza và
Mannit, không lên men Lactoza là rất quan trọng để phân biệt Pasteurella
multocida với Salmonella (không lên men Saccaroza) và với Ecoli,
P.haemolytica (lên men Lactoza). Heddleston và cộng sự, 1972 [44] nghiên
cứu 948 mẫu P. multocida phân lập từ gia cầm, kết quả phản ứng sinh hoá học
nh bảng trang sau:
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
11

Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá học của Pasteurella multocida
TT

Phản ứng % (+) TT Phản ứng % (+)

1 Arabinose 7,4 16 Sorbitol 97,6
2 Dextrin 0,6 17

Sucrose 100
3 Dulcitol 2,6 18 Trehalose 4,1
4 Fructose 100 19 Xylose 77,4
5 Galactose 99,8 20 Glyceral 93,3
6 Gelatin 0 21 Heamolysis 0
7 Glucose 100 22 Hydrogensulfit 97,5
8 Inulin 0 23 Indol 96,6
9 Lactose 1,6 24 Inositol 0
10

Maltose 0 25 Sữa Bismus 0,7
11

Mannitol 99,5 26 Thạch MacConkey

0,1
12

Mannose 99,6 27 Di động 0
13

Raffinose 2,7 28 Khử Nitrat 100
14

Rhamnose 0 29 Urease 0
15

Salicin 0
Heddleston và cộng sự, (1972)[44]; Rhoades và cộng sự (1992)[53] căn
cứ vào tính chất sinh hoá để phân biệt các loài vi khuẩn thuộc giống
Pasteurella theo bảng sau:
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
12

Bảng 2-2. Đặc điểm phân biệt các Pasteurella khác nhau
Pasreurella
Phản ứng
multocida haemolytica

anatipestifer

gallinarum
Dung huyết - + - -
Macconkey - + - -
Indol + - - -
Di động - - - -
Catalase + + + -
Oxidaza + + + +
Urease - - biến động -
Glucose + + - +
Maltose - - - +
Lactose - + - -
Sucrose + + - +
Gelatin - - - -

2.2.3. Kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida
Pasteurella là loại vi khuẩn sinh giáp mô, đó chính là yếu tố độc lực

của chúng. Theo Carter, 1967 [29], đa số các trờng hợp vi khuẩn phân lập từ
động vật mắc bệnh cấp tính có giáp mô và có độc lực. Khi nuôi cấy những vi
khuẩn này trong môi trờng thông thờng, để lâu vi khuẩn sẽ mất giáp mô và
mất độc lực. Những vi khuẩn mất giáp mô đợc nuôi cấy trên môi trờng có
thêm máu, hoặc tiêm truyền qua động vật, có thể tái tạo lại giáp mô và biểu
hiện độc lực
Carter, 1955 [25] cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 37
0
C trên môi
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
13

trờng nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn hình thành giáp mô, sau đó mất
dần đi chứng tỏ giáp mô chỉ có ở canh khuẩn mới nuôi cấy.
Bain và De Alwis, 1982 [19] nhận thấy có thể phân lập cả vi khuẩn có
giáp mô và không có giáp mô từ cơ thể động vật mắc bệnh Tụ huyết trùng.
Nếu nuôi cấy ở 37
0
C với môi trờng cơ bản có chứa 0,05% Glucose, thì giáp
mô phát triển tốt. Ngợc lại nếu môi trờng chứa nhiều Glucose và ở nhiệt độ
28
0
C thì không hình thành giáp mô.
Theo Manninger, 1919 [48] độc lực P. multocida rất phức tạp và không
ổn định, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn cũng nh loài vật cảm thụ bệnh. Tác
giả khẳng định vi khuẩn xâm nhập vào ký chủ và phát triển trong ký chủ là
nhờ có giáp mô. Vi khuẩn mất khả năng tái tạo giáp mô sẽ không còn độc lực.
Mặt khác, tác giả nhận thấy một số chủng vi khuẩn có giáp mô nhng độc lực
yếu, vì độc lực vi khuẩn có thể còn phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp
mô và kháng nguyên thân. Giáp mô của P. multocida là Polysaccharicde,

Lipopolysaccharide và một phức hợp Protein (Rimler và Rhoades, 1989) [58]
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên giáp mô, bằng phản ứng
ngng kết gián tiếp hồng cầu, Carter, 1955 [25], Rimler và Rhoades, 1987
[57] đ phân chia P. multocida thành 5 Serotype kháng nguyên giáp mô khác
nhau là Serotype A, B, D, E và F.
Woolcock, 1992 [68] cho rằng giáp mô của P. multocida type A cấu tạo
bởi Acid Hyaluronic có liên kết mật thiết với các thành phần khác nh
Polysaccharide, Protein và Lypit.
Acid Hyaluronic không gây hoạt hóa kháng thực bào nhng chất tiết
giáp mô có thể ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân bò (Ryu và cộng sự,
1984)[63]. Nếu tách Acid Hyaluronic khỏi giáp mô sẽ tăng khả năng bám
dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào động vật và tăng tính mẫn cảm của vi
khuẩn đối với đại thực bào.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
14

Theo nghiên cứu của Bain, 1954 [18] thì thành phần giáp mô có chứa
Acid Hyaluronic và một lớp Polysaccharide giáp mô là yếu tố bề mặt quan
trọng không chỉ đối với P. multocida mà còn đối với một số vi khuẩn gram âm
gây độc khác. Nhng nếu chiết tách Polysaccharide tinh khiết thì không gây
độc và không bảo vệ đợc chuột hay thỏ.
Theo Esslinger và cộng sự, 1992 [38], các chủng P. multocida Serotype
A đều có tính bám dính mạnh đối với tế bào Hela, trong khi đó các Serotype
B,D,E có độ bám dính thấp hơn nhiều
Theo Snipes và Hirsh, 1986 [66], giáp mô vi khuẩn P. multocida có khả
năng hoạt hoá bổ thể, sự hoạt hoá bổ thể không ảnh hởng đến vai trò của các
tế bào đại thực bào đối với vi khuẩn
Để quan sát giáp mô ngời ta nhuộm vi khuẩn bằng mực ấn Độ, hoặc
dùng phơng pháp nhuộm Hiss. Có thể nhận dạng giáp mô bằng quan sát
dung quang khuẩn lạc, theo Rimler, 1992 [59] nếu các khuẩn lạc có dung

quang sắc cầu vồng (Iridescence) thì vi khuẩn có giáp mô.
Kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida và vai trò của nó
trong đáp ứng miễn dịch:
Cấu trúc kháng nguyên của Pasteurella multocida phức tạp và hay thay
đổi, cho đến nay ngời ta đ xác định kháng nguyên của Pasteurella
multocida bao gồm có hai loại chính:
- Kháng nguyên vỏ (K) (capsule)
- Kháng nguyên thân (O) (Somatic)
Để nhận biết một cách đầy đủ về kháng nguyên Pasteurella multocida cần
phải khái quát đầy đủ các mặt nh: Số lợng kháng nguyên, loại, tính chất. Từ đó
chọn lựa phơng pháp chẩn đoán huyết thanh học và nghiên cứu vai trò sinh
miễn dịch từng loại kháng nguyên, phơng pháp chế tạo vacxin phòng bệnh.
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
15

a. Số lợng kháng nguyên:
Trong những công trình nghiên cứu trớc đây, với phản ứng khuyếch
tán trên thạch có sử dụng kháng nguyên xử lý axit toàn bộ tế bào vi khuẩn đ
thấy đợc 12 kháng nguyên.
Năm 1966 Price và Smith, [52] đ dùng phơng pháp miễn dịch điện di
bằng máy lắc Mikle tách đợc 16 kháng nguyên kí tự từ a-n. Hai kháng
nguyên giáp mô là và và một kháng nguyên thứ ba đợc coi là kháng
nguyên thân. Phản ứng huyết thanh chéo giữa Pasteurella và các vi khuẩn
gram âm khác đ đợc làm sáng tỏ bởi Prince và Smith (1966) [52], theo các
tác giả thì thì phản ứng chéo không chỉ do kháng nguyên, mà còn do lớp
kháng nguyên nằm sâu hơn a-n. Tác giả cũng cho rằng tất cả 16 kháng nguyên
hoà tan của Pasteurella multocida mà nằm sâu hơn trong vi khuẩn là có liên
quan đến các chủng của bò và gia cầm.
b. Cấu trúc kháng nguyên:
Với những phơng pháp khác nhau các nhà khoa học đ xác định cấu

trúc của các loại kháng nguyên: Polysaccharide (CPS), Lypopolysaccharide
(LPS

), kháng nguyên Protein, Acid amin.
+ Lypopolysaccharides (LPS): LPS của vi khuẩn Pasteurella multocida
có tính chất về hoá học và sinh học giống nh trong nhiều loài vi khuẩn gram
âm nh những kháng nguyên LPS đ có liên quan đến sự tạo kháng thể bảo vệ
cho động vật và cũng đ đợc dùng nh cơ sở hoá học cho hệ thống phân loại
kháng nguyên thân. LPS thì đ đợc chiết tách từ nhiều chủng khác nhau của
vi khuẩn Pasteurella multocida, tơng tự nh vậy thì LPS cũng đợc chiết
tách từ những vi khuẩn cùng họ, những phân tích về hoá học thấy thành phần
LPS từ Pasteurella multocida bao gồm lipid A, 2-keto-3-deoxyoctonate
(KDO), l- glycero-D-mannoheptose, glucose và glucosamine ( Rimler và cộng
sự 1987 [55]).
Trng i hc nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip .
16

Những loại đờng khác nh Galactose, Rhamnose, D-glycero-D-
mannoheptose và Galactosamine cũng thờng thấy trong LPS của những
chủng Pasteurella khác nhau. Ngoài ra còn có 4 typ đờng khác đ đợc nhận
diện bởi Erler và cộng sự (1977).
Rimler và Rhoades, (1989)[58] cho rằng: LPS tinh khiết không gây
đợc miễn dịch tạo kháng thể ở chuột, trâu bò và thỏ, nhng là chất gây miễn
dịch chính chống lại bệnh Tụ huyết trùng của gà tây là phức hợp kháng
nguyên Protein - Lypopolysaccharide
+ Polysaccharide tinh khiết (CPS ):
CPS tinh khiết của vi khuẩn Pasteurella multocida là một kháng nguyên
và nó có thể phản ứng kích thích taọ kháng thể chống lại toàn bộ vi khuẩn. Riêng
một mìmh CPS tinh khiết sản sinh ra một ít hay không có hoạt động sinh miễn
dịch bảo vệ cho chuột (Bainvà Knox, 1961; Reber và Heddleston 1974; Schmerr

và Rebers, 1979) hay trâu, bò chống lại những vi khuẩn đồng typ.
ở gia cầm, LPS từ một vài serotyp có khả năng sản sinh ra kháng thể
trong khi một số serotype khác không sản sinh kháng thể. CPS tinh khiết đợc
chiết tách từ chủng phân lập từ chim đ bảo vệ đợc gà chống lại thử thách
với vi khuẩn đồng chủng (Rimler, 1987 [55]).
Vị trí và phơng pháp tiêm đóng một vai trò quan trọng cho sự sản sinh
kháng thể ở gà chống lại Polysaccharide tinh khiết (Rimler, 1984; Rimler và
Brown, 1982; Rimler và Phillips, 1986). việc tiêm truyền LPS vào tĩnh mạch
đ tạo đợc miễn dịch, trong khi đó bằng những đờng khác thì không tạo
đợc miễn dịch, mặt khác khi dùng nguyên CPS một mình thì không thành
công trong quá trình tiêm truyền mà kết hợp CPS-sensitized erythrocytes hay
phức hợp CPS với methylated albumin hay Ribosomes hay protein ribosome
thì đ có kết quả trong việc sản sinh kháng thể (Rimler và cộng sự, 1986 [55]).
Nh vậy tính chất tạo kháng thể của CPS đặc biệt có khả năng liên quan tới