Luận văn thạc sĩ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Cry1Ac CHO CÂY KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



LÊ THỊ VÂN



NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Cry1Ac
CHO CÂY KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 60.62.05



Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH



HÀ NỘI, 2011
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được
công bố trong bất cứ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan các tài liệu trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn
gốc.

Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011
Tác giả luận văn


Lê Thị Vân

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii
LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại viện sinh học nông nghiệp trường Đại học
Nông Nghiệp Hà Nội, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô
giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của viện, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản
thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.
TS Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự dạy bảo và những ý kiến đóng góp của
các thầy cô trong bộ mộ Di truyền –chọn giống, các thầy cô trong khoa, trong

trường và các thầy cô trong viện đào tạo sau đại học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Ths. Nguyễn Thị
Thanh Phương, đã trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận
văn.
Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu
phòng Sinh học phân tử và chọn tạo giống cây trồng, cùng toàn thể cán bộ nghiên
cứu của Viện Sinh học Nông Nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi
thực hiện đề tài vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn
bè đã tạo điều kiện tinh thần tốt nhất và luôn ủng hộ cho tôi trong quá trình thực
hiện và hoàn thành luân văn này.
Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011
Tác giả luận văn

Lê Thị Vân

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC

lời cam đoan i
lời cảm ơn ii
mục lục iii
danh mục các chữ viết tắt vi
danh mục bảng vii
danh mục hình ix
1. MỞ ðẦU 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 4
2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở thế giới và Việt Nam 5
2.3 Chuyển gen ở thực vật 6
2.5 Các nghiên cứu về tái sinh invitro và chuyển gen ở cây khoai tây 18
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
4.1. Nghiên cứu tái sinh invitro cho cây khoai tây Atlantic. 36
4.1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại đường (manitol, glucose
và saccarose) đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 36
4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng kinetin đến
khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 39
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv
4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc
nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. 41
4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng
phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 44
4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy 46
4.2 Các thí nghiệm tiền đề cho chuyển gen 50
4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn
cefotaxime đến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây 50
4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống
của vi khuẩn A. tumefaciens. 54

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến tỷ lệ sống của
mô nuôi cấy 56
4.3 Nghiên cứu xác định một số thông số kỹ thuật trong chuyển gen 58
4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển
gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 58
4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 63
4.3.3 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 66
4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 70
4.3.5 Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả
năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 76
4.3. Kết quả đánh giá cây khoai tây Atlantic chuyển gen bằng PCR 80
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

4.4. So sánh và thảo luận kết quả đề tài với các kết quả nghiên cứu
chuyển gen ở cây khoai tây đã được công bố ở Việt Nam. 83
5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 85
5.1 Kết luận 85
5.2 Đề nghị 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO 87
PHỤ LỤC 96

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D Dichlorophenoxyacetic acid
BA Benzyl adenin
αNAA α-Naphthylacetic acid
IAA Indol acetic acid
MS Murashige and Skoog, 1962
ĐC Đối chứng
ĐNC Đồng nuôi cấy
AS Acetosyringone
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
DNA DNA- Ribonucleic acid
Gus Β- Glucuronidase
PPT DL- photphinothricin
Ka Kanamycin
Kb Kilo base
kDa Kilo Dalton
PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi trùng hợp
DK Diệt khuẩn
CT Công thức


Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang

4.1. Ảnh hưởng của một số loại đường (manitol, glucose và
saccarose) đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

(Sau 8 tuần nuôi cấy)
37
4.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy)
40
4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm
cytokinin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau
8 tuần nuôi cấy).
42
4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy)
45
4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA tới khả năng phát inh hình thái
mô nuôi cấy (sau 8 tuần nuôi cấy)
47
4.6 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đến khả
năng sống và tái sinh của cây khoai tây (Sau 8 tuần nuôi cấy)
51
4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống
của vi khuẩn A. tumefaciens.
55
4.8 Ảnh hưởng của PPT đến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy (sau 6 tuần
nuôi cấy)
56
4.9a Đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển
gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant và
Atlantic.
59
4.9b Đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển
gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua biểu hiện của

gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần)
61
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii
4.10a Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant
và Atlantic.
63
4.10b Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen
của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen
Gus (8 tuần)
64
4.11a Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến khả năng chuyển
gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Diamant và
Atlantic.
67
4.11b Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả
năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của
gen Bar và gen Gus (8 tuần)
69
4.12a Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen
của vi khuẩn Agrobacterim trên hai giống Diamant và Atlantic
71
4.12 b Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới khả năng
chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen
Bar và gen Gus (8 tuần)
73
4.13a Đánh giá tác động tổ hợp của các công thức tối ưu tới khả năng
chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens trên hai giống khoai tây

Atlantic và Diamant
76
4.13b Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả
năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua
sự biểu hiện của gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần)
77

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 Sơ đồ cấu trúc plasmid ITB2c. 25
4.1 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy 41
4.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm
cytokinin đến khả năng tạo chồi của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần
nuôi cấy) 44
4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 46
4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy 49
4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy 49
4.6 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đến khả
năng sống và tái sinh của cây khoai tây 53
4.7 Kết quả tái sinh của các loại mẫu trên môi trường MS3 +

300mg/L cefotaxime (A: Đoạn thân không mang mắt ngủ, B:
callus) 54
4.9 Đoạn thân không mang mắt ngủ và callus ở nồng độ 1,0 mg/L
PPT (Sau 6 tuần nuôi cấy) 57
4.10 Hình ảnh mẫu đồng nuôi cấy 3 ngày 60
4.11 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng chuyển gen của vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens 62
4.12 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen
của vi khuẩn A.tumefaciens 66
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

x

4.13: Sự biểu hiện của gen Gus. 66
4.14 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả năng chuyển
gen của vi khuẩn A.tumefaciens 70
4.15: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen
của vi khuẩn A.tumefaciens 74
4.16: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới sự nhiễm khuẩn 75
4.17 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh 75
4.18 Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới tốc độ
sinh trưởng của hai giống Atlantic và Diamant (8 tuần) 78
4.19 Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả
năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 78
4.20 Đánh giá tác động của công thức tối ưu tới tỷ lệ mẫu sống sau
chọn lọc. 79
4.21: Sự biểu hiện tạm thời của gen Gus A trên các loại mẫu cấy thu
được ở công thức 6 79
4.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR 81

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

1. MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi
Andes, Nam Mỹ. Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm
quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô (Steveson, Loria, Frane và
Weingartner, 2001).
Ở Việt Nam, khoai tây là nhóm cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau
lúa và ngô. Tuy nhiên, những năm gần đây, diện tích trồng khoai tây chỉ dao động
trong khoảng 30.000 - 35.000 ha với năng suất bình quân khoảng từ 10 - 11 tấn/ha.
Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất thấp và diện tích trồng
giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt, củ giống trồng phổ biến là loại củ giống
chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp). Do
đó, việc nghiên cứu cải tiến các đặc tính nông sinh học và khả năng chống chịu của
khoai tây là rất cần thiết.
Qua nhiều năm các nhà nông nghiệp và nhà chọn giống thực vật đã đặc biệt
thành công trong việc tối ưu hóa các đặc tính có lợi như hàm lượng protein, tinh
bột. và tăng năng suất. tuy nhiên với cách tiếp cận truyền thống đã gặp phải rất
nhiều khó khăn. Đặc biệt trong lai xa, và trong tạo giống kháng bệnh ở khoai tây.
Vì vậy, sự ra đời của công nghệ sinh học trở thành một công cụ mới hữu hiệu, góp
phần cùng với phương pháp chọn giống truyền thống đạt được nhiều kết quả khả
quan. Hiện nay, việc cải tiến và tạo giống cây trồng mới bằng kỹ thuật chuyển gen
đã trên nên rất phổ biến trên thế giới (Clive, 2008).
Trên thế giới , đã có nhiều nghiên cứu về xây dựng hệ thống tái sinh và
chuyển gen thành công vào cây khoai tây. Các nghiên cứu chuyển gen nhờ

Agrobacterium tumefaciens, một số tác giả như Vazquez Rovere C và cs. (2001),
Bendahmane và cs (1995, 2000), Li và cs. (1999), Vidal và cs (2002) đã biến nạp
thành công vào cây khoai tây các gen kháng sâu, bệnh.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

Tuy nhiên nước ta, các nghiên cứu về chuyển gen trên cây khoai tây còn hết
sức hạn chế, mới chỉ có nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên giống
khoai tây Diamant và một số giống nhị bội của Đinh Trường Sơn và cs., (2007).

Chính từ vấn đề đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
chuyển gen Cry1Ac cho cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.”
1.2 Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
- Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro cho cây khoai tây
- Xác định được các thông số kỹ thuật cho các bước trong quy trình chuyển
gen mục tiêu vào cây khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, làm cơ
sở cho việc tao cây chuyển gen mang những đặc tính mong muốn.
1.2.1 Yêu cầu.
- Xác định được thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tái sinh chồi từ
mô lá, thân không mang mắt ngủ bao gồm:
+ Xác định nồng độ đường tối ưu.
+ Xác định nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin,
cytokinin tối ưu bổ sung trong môi trường tái sinh.
- Tái sinh được cây khoai tây Atlantic hoàn chỉnh
- Xác định được nồng độ kháng sinh cefotaxime hợp thích hợp ảnh hưởng
tới sự tái sinh và sinh trưởng của mẫu cấy.
-

Xác định được nồng độ PPT tới hạn ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.

- Xác định được vật liệu lây nhiễm phù hợp.
- Xác định được phương pháp lây nhiễm vi khuẩn phù hợp.
- Xác định được thời gian tiền nuôi cấy thích hợp.
- Xác định được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp.
- Đánh giá được sự có mặt của gen chuyển nạp trong mẫu đã chuyển gen.
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu xây dựng được quy trình chuyển gen và xác định được
các thông số kỹ thuật và xây dựng được quy trình chung cho chuyển gen vào cây
khoai tây. Từ đó, làm cơ sở cho việc chuyển các gen mong muốn vào cây khoai tây.
Góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu bệnh.
Từ kết quả nghiên cứu làm cơ sở thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học
trong cải tiến và chọn tạo giống cây trồng. Đưa kỹ thuật chuyển gen trở thành công
cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền thống. Tạo các giống cây trồng
chuyển gen mang các đặc tính mong muốn.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp vật liệu cho chọn tạo giống
khoai tây kháng sâu, nhằm giảm thiểu rủi ro, chi phí sản xuất và bảo vệ môi trường.

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây
Khoai tây là một cây trồng cổ đại. Các bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và
ngôn ngữ học cũng như thực vật học đều chứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc
từ Nam Mỹ. Nhiều loại khoai tây hoang dại còn tồn tại đến ngày nay, đặc biệt ở dãy
Andes thuộc peru, Bolivia, ngoài ra các loại hoang dại cũng xuất hiện ở Mexico và
Trung Mỹ, nhưng dạng Solanum tuberosum được đưa vào Tây Ban Nha từ Nam Mỹ
năm 1570 và lan rộng ra các nước và gần 100 năm sau có mặt ở hầu hết các nước
châu Âu. Khoai tây thực sự được trồng trọt trên quy mô lớn sau khoảng 1870 và
mãi tới thế kỷ 19 mới thực sự phổ biến trên các châu lục.
Ở Việt Nam, khoai tây được người Pháp đưa vào trồng trọt năm 1890 tại một
số vùng : Tú Sơn- Hải Phòng (1901), Trà Lĩnh- Cao Bằng (1907), Thường Tín- Hà
Tây (1917). Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung ở vùng đồng bằng thuộc châu
thổ Sông Hồng, Đà Lạt. Gần đây khoai tây được trồng ở một số vùng núi phía bắc
như Sapa- Lào Cai, Hòa An- Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu cho thấy khoai tây
trồng ở độ cao so với mặt nước biển sẽ cho năng suất cao, chất lượng tốt, thích ứng
cao, ít sâu bệnh.[5]
Khoai tây thuộc họ cà (Solanaceae), chi Solanum là một chi rất lớn với trên
2000 loài được phân bố hầu khắp trên thế giới. Sự đa dạng về loài, giống tập trung
chủ yếu ở Trung- Nam Mỹ và Australia. Cùng với các loài S.tuberosum có khoảng
7 loài trồng trọt khác.
Theo J. G. Hawkerkks (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó
có 68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, được chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa
vào số lượng NST. [5]
Khoai tây thuộc nhóm cây thực phẩm cao cấp. Hàm lượng dinh dưỡng trong
củ đa dạng phong phú, bao gồm tinh bột, protein, lipit, gluxit, các loại vitamin:
carotene, B1, B2, B3, B6, PP, C. Thành phần khoáng của khoai tây chủ yếu là P,
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

Ca, Fe, Mg, K. Trong khoai tây còn chứa một số axit amin tự do, vì vậy giá trị dinh
dưỡng ở khoai tây được khẳng định là rất quan trọng với con người.
Trong củ khoai tây chứa 78% nước, gần 1% chất béo. Hàm lượng chất khô
biến động từ 18.3- 22.0% trong đó 82% của chất khô là cacbon hydrat, tinh bột, một
số chất xơ và lượng nhỏ đường đơn. Hàm lượng protein ở khoai tây tươi là 0.6-
1.2%. Trong 100g tươi, có các loại vitamin chủ yếu như: B1 (0.1- 0.15mg%), B2
(0.05mg%), C (20-30mg%). Các chất khoáng cơ bản là P (50mg%), Ca (10mg%),
Fe (1.2mg%). Ngoài ra còn có 0.05- 0.07mg% riboflavin. Khoai tây chứa 12 loại
vitamin và muối khoáng, ngoài ra còn có thiamin, sắt, folic axit. Khoai tây được
nhận định là có giá trị dinh dưỡng tốt hơn ngũ cốc và đậu tương. Khoai tây cũng là
cây lương thực giữ vai trò chủ yếu của nhiều nước trên thế giới. [5]
2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở thế giới và Việt Nam
2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới
Theo thống kê của FAO (2004- 2005), diện tích trồng khoai tây toàn thế giới có
xu hướng giảm dần, từ 20.028.896 ha xuống 18.652.381 ha. Năng suất tăng rõ vào
2004, 2005 nhưng không tăng nhiều. Do đó, tổng sản lượng tăng không đáng kể. [5]
Do điều kiện sinh thái, mức độ thâm canh và trình độ sản xuất khác nhau nên
năng suất khoai tây chênh lệch rất lớn, từ 7 đến 65 tấn/ha. Tính đến năm 2005 hàng
năm trên thế giới sản xuất được khoai tây với diện tích 18,89 triệu ha, sản lượng đạt
320,98 triệu tấn (FAO, 2006) [64]
Châu Âu có nền sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, tuy nhiên trong những
năm gần đây vị trí cây khoai tây có phần giảm về cả diện tích và sản lượng. Về diện
tích năm 2000 cả Châu lục đạt 9,13 triệu ha, đến năm 2005 chỉ còn 7,59 triệu ha,
giảm 1,54 triệu ha. Để đáp ứng nhu cầu về khoai tây trong điều kiện diện tích giảm,
các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều biện pháp kỹ thuật, đặc biệt là về giống nên
năng suất cây khoai tây không ngừng được nâng cao. Năng suất khoai tây năm 2005
đạt 17,24 tấn/ha, tăng 1,74 tấn/ha so với năm 2001 và 0,94 tấn/ha so với năm 2000.
Mặc dù năng suất tăng nhưng do diện tích giảm nhiều nên sản lượng năm 2005 vẫn
thấp, thấp hơn 6,36 triệu tấn so với năm 2000. [67]

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam
Khoai tây không phải là cây trồng bản địa và đã được trồng ở Việt Nam từ
hơn 100 năm nay, được nhập nội vào nước ta từ Châu Âu do người Pháp mang vào.
Trước năm 1966, diện tích trồng khoai tây chỉ đạt dưới 1 nghìn ha và được trồng rải
rác ở Sa Pa (Lào Cai), Đà Lạt, Cao Bằng, Đông Anh (Hà Nội), Thường Tín (Hà
Tây), Đồ Sơn (Hải Phòng). Năm 1971 có 5 nghìn ha khoai tây, năm 1980 diện tích
trồng khoai tây lên tới 100.000 ha, mỗi năm tăng 12.000 ha (Đào Huy Chiên, 2002)
[6] sau đó giảm xuống còn 28.022 ha năm 2000 và hiện nay đạt 35.000 ha (năm
2005). Cây khoai tây ở nước ta đã và đang phát triển nhưng tốc độ mở rộng diện
tích và tăng năng suất hàng năm không cao. Điều này được giải thích bởi: thiếu bộ
giống thích hợp với điều kiện nóng ẩm , đặc biệt là thiếu giống có chất lượng tốt có
thể trồng được ở nhiều vùng sản xuất . [16]
Mặt khác hầu hết các giống khoai tây trồng trên đồng ruộng đều bị nhiễm
virus với tốc độ tăng dần làm cho giống bị thoái hóa, năng suất và chất lượng giảm
sút (Lê Hưng Quốc, 2006) [23] Thứ hai là do điều kiện khí hậu ở Việt Nam ít thuận
lợi cho khoai tây sinh trưởng và phát triển: Nhiệt độ cao, ngày ngắn và nhiều điều
kiện khí hậu không thích hợp nên khoảng cách giữa năng suất thực tế với tiềm năng
năng suất là rất lớn (chỉ bằng 10%) và thời vụ gieo trồng ngắn, chỉ trồng được 1 đến 2
vụ/năm (Caldiz, D.O.,et al., 2001) (Dẫn theo Lê Sỹ Lợi, 2007) [18]. Thời vụ gieo
trồng ngắn không chỉ trồng được ít vụ mà năng suất cây trồng cũng không cao (Hunt,
1993) [47]. Do điều kiện khí hậu không thuận lợi, giống khoai tây nhập nội khi trồng
ở Việt Nam thời gian sinh trưởng bị rút ngắn, chỉ khoảng 85 – 115 ngày (Nguyễn
Văn Thắng và cs, 1996). [35] Thời gian sinh trưởng ngắn là yếu tố bất lợi, hạn chế
nhiều đến năng suất và phẩm chất khoai tây (Trương Văn Hộ và cs, 1990) [14]
2.3 Chuyển gen ở thực vật
2.3.1 Khái niệm chuyển gen và cây chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế dưới
dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói
chung (vi sinh vật, động vật ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng
hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể
chuyển gen.
Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gen
lạ được lồng vào genom, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định từ thế hệ này
sang thế hệ khác. [30].
2.3.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
2.3.2.1 Giới thiệu về A. tumefaciens và quy trình chung chuyển gen nhờ A.
tumefaciens
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, trong đó, phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được sử dụng khá rộng rãi và đã thành
công trên nhiều đối tượng cây trồng, đặc biệt là thực vật hai lá mầm.
Từ những năm 1960- 1970, các nghiên cứu đã được tiến hành trên vi khuẩn
này, việc phát hiện ra vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu
những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng của
công nghệ sinh học thực vật với nhiều ưu điểm nổi trội như: số bản sao của gen biến
nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp khoảng 1- 2 gen, trong khi sử dụng súng
bắn gen là nhiều hơn. Do vậy, phương pháp này giảm tối thiểu sự không biểu hiện
của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao,
tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm. [29]
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thu được nhiều kết quả ở thuốc lá, cà
chua, khoai tây, đậu tương, ngô, bông. [33]
Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Agrobacterium là

vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm vào
qua vết thương, tạo ra các u sần ảnh hưởng tới sự sinh trưởng bình thường của cây bị
xâm nhiễm [3]
Trong chi Agrobacterium thì A.tumefaciens được sử dụng nhiều nhất trong
chuyển gen.
Phân loại khoa học:
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8

Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Loài: A.tumefaciens
Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens
Quy trình chung chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium:
Bước 1: Thiết kế vector mang gen.
Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.
Bước 3; Chuyển vector mang biến nạp từ E.coli sang A.tumefaciens.
Bước 4: Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens chứa gen biến nạp với tế
bào, mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích.
Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công.
Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh.
Sau đó, từ cây chuyển gen thu được cần đánh giá sự ổn định di truyền qua
các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong
muốn. [30]
2.3.2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens
a) Cơ sở về khả năng tái sinh ở thực vật
Trong kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thì những đối tượng thường được
sử dụng để chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẫu callus hay các tế bào tách rời sau
khi chuyển gen thành công các tế bào này phải được đưa vào các môi trường phù
hợp để tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Về cơ bản, 2 quá trình này là các
quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát
triển cá thể có một số gen được hoạt hóa ( vốn trước đó các gen này bị ức chế) để
cho ta tính trạng mới còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử của DNA của mỗi tế
bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào
xung quanh, khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo
điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [30]
Do đó, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trường nuôi cấy và tế bào thực vật
đóng vai trò quan trọng góp phần quyết định sự thành công của thí nghiệm biến nạp.
Yêu cầu cơ bản đối với hệ thống tái sinh:
- Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng
phân chia invitro nhanh.
- Các mô, tế bào này phải có khả năng nhận gen mới.
- Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào
kiểu gen.
- Cây tái sinh phải có tỉ lệ sống cao khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên, tần số
biến dị thấp và khả năng hữu thụ cao, để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban

đầu tiếp tục tiến hành chuyển gen trong điều kiện invivo sau này.
Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh, hoặc sự tái sinh diễn ra mà
không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp đó không thành công. Vì vậy,
trong chuyển gen, cả giai đoạn biến nạp và giai đoạn tái sinh cây đều có ý nghĩa
quan trọng.
b) Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens
Bước đầu của quá trình nhiễm là A. tumefaciens gắn vào một tế bào của cây
ở vị trí vết thương hở, thường là ở phần gốc của thân cây. Sau bước gắn khởi đầu,
A. tumefaciens sản sinh một mạng lưới các sợi xellulose liên kết chặt vi khuẩn vào
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10
bề mặt tế bào cây. Hiện nay người ta nhận ra rằng các vi khuẩn này đáp ứng với các
hợp chất phenol nhất định của thực vật như axetosyringon và hydroxyaxetosyringon
được tiết ra bởi các cây bị thương mẫn cảm. Các hợp chất đáp ứng vết thương này
tương tự như một số sản phẩm của sự chuyển hóa phenylpropanoit, là con đường
chủ yếu để tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật như lignin và
flavonoit. Các phân tử nhỏ này (như axetosyringon và hydroxyaxetosyringon) gây
cảm ứng các gen độc (vir) được mã hóa trên plasmid Ti. Các gen vir được định vị ở
vùng 35kb của plasmid Ti, nằm ngoài vùng T- ADN. Có 25 gen vir sắp xếp thành 7
operon trên plasmid Ti. Các sản phẩm của các gen vir cần thiết cho sự chuyển và
cài nhập vùng T- ADN vào bộ gen của một số tế bào thực vật.
Sau khi một tế của A. tumefaciens mang plasmid Ti bám vào tế bào thực vật
chủ và các gen vir bị cảm ứng, T- ADN được chuyển hóa bởi một quá trình tương
tự như chuyển plasmid từ tế bào cho sang tế bào nhận trong quá trình tiếp hợp vi
khuẩn. Trong mô hình này, T- ADN được chuyển là một phân tử sợi đơn mạch
thẳng từ plasmid Ti, đi vào tế bào thực vật và cuối cùng được cài nhập vào AND
NST tế bào thực vật. Đầu 5’ của T-ADN sợi đơn mang trình tự bên phải, trình tự
bên trái là ở đầu 3’.
Sự tạo thành sợi đơn của T- ADN được khởi đầu bằng việc cắt đặc hiệu sợi

tại cả hai biên của vùng T- ADN nguyên vẹn. Sự cài nhập T –ADN vào bộ gen thực
vật phụ thuộc vào trình tự đặc hiệu được định vị ở biên phải của T- ADN. Biên này
có một đơn vị lặp lại gồm 25 bp nhưng các nghiên cứu đột biến mất đoạn cho thấy
rằng vùng này không liên quan đến quá trình cài nhập. Trong quá trình chèn T-
ADN vào ADN NST thực vật thường bị mất đi tại các vị trí nối giữa T- ADN và
ADN NST thực vật. Ngoài ra, trong quá trình chèn T- ADN vào ADN thực vật tại
các vị trí ngẫu nhiên, các biên T- ADN biểu hiện một số tương đồng với ADN thực
vật tại vị trí chèn.
Phải 5’- TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN- 3’
Trái 5’- TGGCAGGATATATNNNNNTGATAAN- 3’
Hầu hết các gen được định vị bên trong vùng T- ADN chỉ được hoạt hóa sau
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11
khi T- ADN được chèn vào bộ gen thực vật. Các sản phẩm của gen này chịu trách
nhiệm tạo thành khối u. Vùng T- ADN gồm các gen iaaM và iaaH. Cặp gen này mã
hóa các enzyme tổng hợp hormon thực vật auxin. Đặc biệt, iaaM mã hóa enzyme
tryptophan 2- monooxygenaza, chuyển tryptophan thành indol 3-axetamit, và iaaH
có các thông tin cho indol 3-axetamit hydrolaza, chuyển hóa indol 3- axetamit thành
axit indoleaxetic. Ngoài ra, vùng T- ADN mang gen tmr (còn gọi là ipt) mã hóa
isopentenyltransferaza. Enzym này bổ sung 5’- AMP vào chuỗi bên của isoprenoit
tạo thành các xytokinin isopentenyladenin và isopentenyladenosin. Sự hydroxyl hóa
hai phân tử này bởi các enzyme thực vật tạo ra các xytokinin gọi là transzeatin và
transribosylzeatin tương ứng. cả auxin và Xytokinin đều điều hòa sự sinh trưởng và
phát triển tế bào thực vật. Khi dư thừa, chúng có thể gây cho cây sựu phát triển khối
u như các u sần.
Ngoài các gen sinh tổng hợp auxin và xytokinin, vùng T- ADN của mỗi
plasmid Ti đặc hiệu còn măng một số gen tổng hợp một phân tử gọi là opin. Các
opin là các sản phẩm ngưng tụ không bình thường của một axit amin và một keto
axit hoặc một axit amin và một đường. Ví dụ: sản phẩm ngưng tụ của arginin và

axit pyruvic gọi là octopin, arginin với α-ketoglutaraldehyt là nopalin, và agropin là
dẫn xuất đường vòng đôi của axit glutamic. Các opine được tổng hợp bên trong
khối u rồi được tiết ra. [2]
Như vậy, vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây
bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền.
Quá tình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumefaciens sang tế bào cây chủ
được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F, trong đó vir C và
vir E có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.[34]
c) Đặc điểm ưu việt của phương pháp biến nạp gen ở thực vật so với các
phương pháp truyền thống
Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương
pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra con lai mang
những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12
hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên, phép lai chéo này bị
hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa
những các thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai
được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả
mong muốn và thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong
những loài có họ hàng gần nhau.
Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào
một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác
nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương
pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn
và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Nhìn chung, việc ứng
dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: Tăng sản lượng, cải tiến chất
lượng giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nông nghiệp, cải thiện môi trường.
Đến nay, hơn 140 loài thực vật khác nhau đã được biến đổi di truyền, trên

hơn 50 quốc gia trên thế giới. [2]
Bên cạnh đó cây chuyển gen còn mang lại những lợi ích to lớn với môi
trường như: Chúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sậu được sử dụng, với tỷ
lệ phụ thuộc vào cây trồng và các đặc điểm mới được đưa vào cây trồng đó. Một
nghiên cứu về các tác động của cây trồng CNSH đối với môi trường và kinh tế sau
9 năm được canh tác (1996 – 2004) cho thấy việc ứng dụng CNSH đã là giảm lượng
thuốc trừ sâu cần phải sử dụng khoảng 172 triệu kg, và làm giảm các tác động lên
môi trường khoảng 14%. [65]
2.3.3 Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen
a) Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc
bằng cách ngâm các mảnh lá chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15
giờ ở 37
o
C, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ
không chuyển màu.
- PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi
chuyên biệt, quy trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của
Dellaporta (1983).
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13
- Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c)
qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá
trong đĩa petri. [8]
Một số sản phẩm của gen chỉ thị như β-D-glucuronidaza (GUS), của
luxiferaza đom đóm và vi khuẩn, và protein phát huỳnh quang xanh lá cây. Protein
phát huỳnh quang xanh lá cây (GFP) là một dấu chuẩn invitro lý tưởng để giám sát
cây chuyển gen vì nó phát huỳnh quang màu xanh lá cây khi chiếu tia cực tím hoặc
tia sáng xanh lam mà không đòi hỏi việc bổ sung bất kì cơ chất hay đồng nhân tố
nào. [2]

b) Phương pháp PCR
Có nhiều phương pháp xác định cây mang gen cần chuyển nạp, như phương
pháp PCR, Southern blot, Northern blot, Western blot và các thí nghiện khác được
thực hiện.
Khi có nhiều mẫu khác nhau và có một lượng rất ít DNA thì khuếch đại PCR
là phương pháp được sử dụng. Phương pháp này đặc biệt phù hợp cho việc kiểm tra
và xác định những thay đổi gen của cây trồng. Với kỹ thuật này, các đoạn DNA
được nhân lên gấp hàng triệu lần với tốc độ nhanh và chính xác cao với các cặp mồi
đặc hiệu. Mẫu không mang gen được đưa vào thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình
nhân DNA không xảy ra. Những mẫu mang gen chuyển vào thì cặp mồi bắt cặp và
quá trình nhân DNA diễn ra mạnh mẽ. Sau phản ứng trên máy PCR, thu mẫu và
đem điện di, đánh giá kết quả chuyển nạp.
Phương pháp PCR có ưu điểm phân tích nhanh với số lượng mẫu lớn, nhưng
không thể chứng minh được sự hợp nhất gen lạ vào genome cây được chuyển nạp,
và không thể sử dụng để phát hiện các sự kiện chuyển nạp khác nhau. [4]
2.4 Một số thành tựu và xu thế phát triển của cây trồng biến ñổi gen
2.4.1 Tình hình phát triển cây chuyển gen trên thế giới
Sự phát triển của công nghệ chuyển gen vào tế bào thực vật đã được phát
triển nhanh chóng.

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14
Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào
thực vật nhờ A. tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chưa được thay đổi. Năm 1983,
nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính
kháng một số chất kháng sinh. Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra. DNA ngoại
lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và được biến nạp. Thành công
này nhờ nghiên cứu chính xác con đường lây nhiễm của A.tumefaciens trước đó và
khả năng của hệ thống chọn lọc đối với thực vật.

Từ kết quả thành công đầu tiên này số lượng các loài được biến nạp ngày
càng tăng.
Năm 2009, cây trồng biến đổi gen với 4 loại cây chủ lực là ngô, bông, đậu
tương, cải dầu. Diện tích trồng đậu tương biến đổi gen chiếm trên 75% trong tổng
diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên toàn thế giới. Diện tích ngô biến đổi gen
đạt hơn ¼ trên tổng diện tích 158 triệu ha ngô.
Diện tích trồng cây chuyển gen tiếp tục tăng lên mạnh mẽ vào năm 2010,
tăng lên tới 205 triệu ha. Số nước trồng cây chuyển gen cũng tăng từ 25 nước
(2009) lên 29 nước (2010), với 10 nước trồng nhiều nhất nhiều hơn 1 triệu ha mỗi
nước, đó là Mỹ (66,8 triệu ha), Brazil (25,4), Argentina (22,9), Ấn Độ (9,4), Canada
(8,8) , Trung Quốc (3,5), Paraguay (2,6), Pakistan (2.4), Nam Phi (2,2) và Uruguay
với 1,1 triệu ha.
19 quốc gia còn lại trồng cây CNSH trong năm 2010 trong thứ tự diện tích
giảm dần của là: Bolivia, Australia, Việt Nam, Burkina Faso, Myanmar, Tây Ban
Nha, Mexico, Colombia, Chile, Honduras, Bồ Đào Nha, Cộng hòa Séc, Ba Lan, Ai
Cập, Slovakia, Costa rica, Romania, Thụy điển và Đức. Số lượng cây chuyển gen ở
mỗi nước (>= 50.000 ha) tăng lên 17 nước trong năm 2010 so với 15 nước trong
năm 2009. Sự tăng trưởng mạnh mẽ này góp phần cho sự ổn định và cho tăng
trưởng toàn cầu của cây chuyển gen. [48]
Xu hướng chung trong việc nghiên cứu và phát triển cây trồng chuyển gen
trên thế giới hiện nay chủ yếu tập trung vào một số hướng chính đó là: chuyển gen
tạo cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, cây trống kháng bệnh, tăng chất lượng và chống
chịu lại các điều kiện bất thuận của môi trường. [62]