Enzyme Pectinase trong công nghệt hực phẩm

Chương I : Tổng quan về lý thuyết
1.1Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase hiện nay
1.1.1 Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase trong nước
Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên
cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng
dụng enzym pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.
1.1.2 Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase ngoài nước
Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa
dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc
đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được
tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997),
Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus
stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium
viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng
được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989;
Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000). Ngày nay cùng với sự phát triển
của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy
thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai,
2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym
pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự
thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải
pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các
chủng Aspergillus” .
Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi
trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym
pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng
hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự
tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar,
1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997).Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi
cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90
các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn

cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công
trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp
pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn
cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và
glycerol, gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công
nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho,
2000; Blandino, 2001; Denis, 2002)
1.2 Giới thiệu về Enzyme Pectinase
1.2.1 khái niệm về Enzyme Pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo
thành là acid galacturonic, galactose, metanol.Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật
bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba
lá.Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase.Chúng cũng có thể được chiết xuất
từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “ thao tác trên gen trên chủng
Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng hợp các enzyme phân giải pectine.
1.2.2 Nguồn gốc của Enzyme Pectinase
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin
và cơ chế phân cắt pectin của những enzym này.
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ
biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất
enzym pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có
thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989;
Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997).
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc
tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau
(Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ
được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001).
Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo
thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đây là nhóm enzym thứ ba được ứng
dụng rộng rãi sau amylase và protease.

Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc
cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá.Trong các
loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase.
1.2.3 Cơ chất của Enzyme Pectinase
Pectin là cơ chất của enzym pectinase.Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc
biệt trong giới thực vật.
Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính
của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α - 1,4 glucosid tạo
nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose.
Các nhóm carboxyl
*
của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm
methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na
+
, K
+
hoặc NH4
+
, hay
bị decacboxyl hoá …
Công thức nguyên của acid galacturonic: C
6
H
10
0
7
Công thức cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được
giới thiệu ở hình 1.1.
α-Galacturonic acid
Β-Pectic acid

Hình 1.1 :Cấu tạo của acid α- galacturonic và khung cấu tạo của pectin
Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành
protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986).
 Protopectin
Đây là dạng pectin nguyên thuỷ.Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra
pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp
chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982).
Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết
giữa các tế bào thực vật với nhau.Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym
protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan.
 Acid pectic ( acid polygalacturonic)
Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không
đáng kể.Dạng muối của acid pectic gọi là pectat.
 Acid pectinic
Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao.
Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng
lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số
hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp.
 Pectin
Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau mà trong
đó acid pectic là thành phần chủ yếu.
Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây
Trái cây
Hàm lượng pectin (%
trọng lượng tươi)
Táo 0,71 – 0,84
Chuối 0,59 – 1,28
Cà rốt 1,17 – 2,29
Nho 0,09 – 0,28
Bưởi 3,30 – 4,50

Chanh 2,80 – 2,99
Cam 2,34 – 2,38
Mơ 0,71 – 1,32
1.2.4 Phân loại Enzyme Pectinase
Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia
thành 3 nhóm chính:
 Pectinesterase
 Các emzim khử mạch polymer
 Protopectinase
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ phân loại enzym pectinase
1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzym pectinase
 Trung tâm hoạt động của enzym pectinase
Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về
phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy
rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người
ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đấn khả
năng xúc tác của enzym.
1.2.5.1 Pectinesterase(PE)
Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá
nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với
nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este
hoá.
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE)
1.2.5.2 Protopectinase
Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ
polymer hoá cao.
1.2.5.3 Các enzym khử mạch polymer
Chia làm 2 tiểu nhóm:
a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)
 Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc

hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:
- Endo-PMG: cắt ngẫu phân nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.
Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)
-Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử
của mạch pectin.
Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)
 Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic
(acid polygalacturonic), gồm 2 loại:
- Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ
phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)
- Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác
thuỷ phân lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.
Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)
b. Enzym cắt (Lyase):
Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin
không bằng con đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate
lyase.
Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra
như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu
hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực
hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, để lại một
liên kết đôi giữa C-4 và C-5.
Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin
Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:
 Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid
đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:
- Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu
nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.
- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.

 Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid
pectic. Có 2 loại:
- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu
nhiên liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic.
- Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần
lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.
1.2.6 Thu nhận Pectinase
a) Nguồn thu nhận:
Vi sinh vật tổng hợp Pectinase: Nguồn giàu Enzyme Pectinase là nấm mốc,
nấm men và vi khuẩn.
Nấm mốc: Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P. chrysogenum, P. expanam,
P.cilrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger,…
Nấm men: Saccharomyces fragilis
Vi khuẩn: Bacillius Polymyxa, Flavobacterium pentinovorum,…
Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận
khác của thực vật. Khi quả bị hư hỏng hoặc thực vật chết chúng sẽ cùng các loài
VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật.
Bên cạnh Pectinesterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa
enzyme PE như: cà chua, đậu nành, thịt quả chuối, quả cam, táo,…
Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các
loại nấm và vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ như: Saccharomyces fragilis, aspergillus
niger,…PG còn được tìm thấy ở cà chua.
b) Thu nhận:
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có hai phương pháp sản
xuất:
1. Thu nhận từ canh trường bề mặt:
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải
hoặc thóc mầm. nguồn dinh dưỡng bổ sung thường lá các muối ammonium,
phosphoric…độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60 độ C. nấm mốc A.
awamori thường được nuôi cấy ở 30 độ C trong thời gian 40 giờ, sau đó giảm

xuống 24 độ C và nuôi trong 48 – 52 giờ. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô
thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế. Để thu được Pectinase tinh khiết thì
enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ
(etanol 72,5 – 75% hoặc iso-propanol 55 – 57%) hay muối amoni sunfat có độ bão
hòa 0,79%. Nếu dùng etanol độ tinh khiết của chế phẩm enzyme khoảng 90%, nếu
dùng muối thì khoảng 75%.Nhiệt độ tối ưu của rượu là 2 – 5 độ C, thời gian tiếp
xúc của rượu càng ít càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy
kết tủa trong thiết bị sây chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem đi
bào quản.
2. Thu nhận từ canh trường bề sâu:
 Phương pháp hiếu khí
Sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV
gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho
vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH thích hợp từ 6-7,2, pH kiềm kìm hãm, pH = 4
ức chế hoàn toàn.
Vật kiệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi với hàm lượng 2-
10%. Trong quá trình nuôi cấy hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường
thường giảm từ 6 xuống còn 1,5 – 1,8%. Để thu chế sản phẩm khô cần tách sợi
nấm ra khỏi canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5 – 8% rồi sấy khô
trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt
165 – 180 độ C và đi ra đạt 60 – 70 độ C. Thời gian lưu của chế phẩm enzym
trong thiết bị sấy phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải
không quá 40 độ C. Chế phẩm thu nhận được cần phải được đóng gói kín để tránh
hút ẩm.
Có thể thu bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với etanol
theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối
ammoniumsulfate (50-80%). Nếu kết tủa bằng etanol, hoạt độ pectinase trong kết
tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu.Nếu kết
tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương
pháp thẩm tích, sau đó sấy khô.

 Phương pháp yếm khí
Môi trường: bã củ cải 2%; (NH
4
)
2
HP0
4
0,75%; KH
2
P0
4
0,1%; CaC0
3
0,3%;
nước chiết ngô: 0,5%
Clostridium pectinofermentants có khả năng tổng hợp Pectinase một cách
mạnh mẽ ở pha tang trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời sự tích
lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym tối đa tương ứng với pha ổn định của sinh
trưởng qua 5-60h. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5 – 7,0. Vật liệu
gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy
với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuối cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 đọ
C.
Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu được pectinase
thành phần môi trường có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH
4
)HP0
4
0,4%;
K
2

HP0
4
0,7%; KH
2
P0
4
0,3%, NaCl 0,1%, MgS0
4
0,025%; FeS0
4
dạng vết,
CaC0
4
0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic 0,5%.
Có thể thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với
dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi
hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5 – 6,8. Nếu kết tủa bằng 2 – 2,5 thể
tích aceton thì hoạt độ của enzym trong kết tủa đạt 93 -95% so với hoạt độ ban
đầu.
Phương pháp hiện đại chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường thép các
bước cơ bản sau:
• Khử muối bằng phương pháp lọc gel
• Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion
• Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang
• Tinh sạch bằng FPLC