Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFNγ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ VĂN THẮNG
TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN
INTERFERON GAMMA NGƯỜI TRONG HỆ THỐNG
BIỂU HIỆN E. coli Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH
MÃ SỐ: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN HOÀNG CHƯƠNG
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iv
LỜI MỞ ĐẦU vi
1.1 Giới thiệu chung về IFN 1
1.1.1 Lịch sử phát hiện 1
1.1.2 Đặc điểm chung 2
1.1.3 Phân loại và nguồn gốc 4
1.2 Interferon gamma (IFN-γ) 6
1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ 6
1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ 7
1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ 8
1.2.3.1Cấu trúc thụ thể của IFN-γ 8
1.2.3.2Con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ
10
1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ 12
1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của protein IFN-γ 12
1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ trong điều trị bệnh 14

1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E. coli 19
1.4.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 19
1.4.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E. coli 20
1.4.3 Chủng E. coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu
hiện protein 20
1.4.3.1 Chủng E. coli BL21(DE3) Star
20
1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoter
T7 21
2.1 Vật liệu 25
2.1.1 Chủng vi sinh vật 25
2.1.2 Vector 25
2.1.3 Gen IFN-γ 26
2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự 26
2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di 27
2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot 27
2.2 Hóa chất 27
2.2.1 Hóa chất dùng cho điện di DNA 27
2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt 28
2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28
2.2.4 Hóa chất dùng tinh sạch DNA từ gel Agarose 28
2.2.5 Hóa chất dùng biến nạp plasmid 28
2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein 28
2.2.7 Hóa chất dùng cho western blot 28
2.2.8 Hóa chất dùng biểu hiện protein mục tiêu 29
2.2.9 Hóa chất dùng cho ELISA 29
2.2.10 Hóa chất dùng hòa tan IFN-γ từ tế bào E. coli
29
2.2.11 Hóa chất dùng cho tinh chế protein tái tổ hợp
30

2.3 Dụng cụ và thiết bị 30
2.4 Phương pháp 30
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 30
2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả nạp 31
2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII 31
2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 31
2.4.5 PCR khuẩn lạc 32
2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ sinh tổng
hợp protein IFN-γ ở quy mô phòng thí nghiệm 33
2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE 34
2.4.8 Phương pháp lai western blot 34
2.4.9 Phương pháp ELISA 35
2.4.10 Thu nhận protein IFN-γ từ tế bào E. coli 36
2.4.11 Tinh sạch protein IFN-γ 37
2.4.12 Sắc ký HPLC 39
2.5 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm 40
2.5.1 Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện protein IFN-γ 40
2.5.2 Quy trình lên men thu nhận protein IFN-γ 41
2.5.3 Quy trình tinh chế thu nhận protein IFN-γ 42
3.1 Tạo dòng vi khuẩn E. coli biểu hiện protein IFN-γ 43
3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ 43
3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ 44
3.1.3 Tạo dòng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein IFN-γ
46 3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E. coli BL21(DE3) Star/
pNanogenIFN-γ trên môi trường LB 47
3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu hiện protein IFN-γ 48
3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu hiện IFN-γ 48
3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG 50
3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng 51
3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein

IFN-γ 53
3.3 Nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein
IFN-γ trên môi trường LB ở quy mô 500 ml trong điều kiện tối ưu
54
3.4 Tinh sạch protein IFN-γ 55
3.4.1 Tách chiết protein IFN-γ 55
3.4.2 Tinh sạch protein IFN-γ 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
DANH MỤC CÁC BẢNG PHỤ LỤC 74


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các kí hiệu, chữ
viết tắt
Thuật ngữ tiếng Anh
Thuật ngữ tương đương
tiếng Việt
Amp Ampicillin Kháng sinh ampicillin
Amp
r
Ampicillin resistance Kháng ampicillin
APC Antigen presenting cell
Tế bào trình diện kháng
nguyên
bp base pair Cặp base
DNA Deoxyribonucleic Acid -
dNTP
deoxyribonucleotide

Triphosphate
-
dsRNA
double strand Ribonucleic
Acid
RNA sợi đôi
E. coli Escherichia coli Chủng vi khuẩn E. coli
IFN Interferon -
IFN-γ Interferon-γ -
IFNGR1
IFN Gamma Receptor-α
chain
Thụ thể chuỗi alfa của
IFN-γ
IFNGR2
IFN Gamma Receptor-β
chain
Thụ thể chuỗi beta của
IFN-γ
IFN-α Interferon-α -
IFN-β Interferon-β -
IL- 4, 10, 12 Interleukin 4, 10, 12 -
IPTG
Isopropyl-β-D-
Thiogalactoside
Chất cảm ứng
Jak Janus tyrosin kinase -
Kan Kanamycin Kháng sinh kanamycin
Kan
r

Kan resistance Kháng kanamycin
kb kilobase Đơn vị đo base của DNA
kDa kiloDaltone
Đơn vị đo trọng lượng
phân tử protein
LB Luria-Bertani medium Môi trường LB
LB
Kan
Luria-Bertani Kanamycin
Môi trường LB bổ sung
kanamycin
MAF
Macrophage Activated
Factor
Nhân tố hoạt hóa đại thực
bào

MCS Multicloning site
Vị trí gắn chèn gen trên
vector
MHC (I, II)
Major Histocompatibility
Complex
Phức hợp mô (I, II)
mRNA
Messenger Ribonucleic
Acid
RNA thông tin
NK Natural Killer cell Tế bào giết tự nhiên
NKT Natural Killer T cell Tế bào T giết tự nhiên

PCR
Polymerase Chain
Reacton
Phản ứng khuếch đại DNA
PKR
Protein kinase dsRNA-
Regulated
Protein điều hòa
P
T7
Promoter T7 -
RNA Ribonucleic Acid -
Rnase Ribonuclease Enzyme phân hủy RNA
rpm round pump minute Tốc độ lắc (vòng/phút)
SDS Sodium Dodecyl Sulfate -
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide
Gel Electrophoresis
Phương pháp điện di
TEMED
N, N, N, N-
TetramethylEthylenediamine
-
TNF-α
Tumor Necrosis factor alpha
Nhân tố gây hoại tử khối u
v/p vòng/phút

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự protein IFN-γ công bố trên dược điển châu Âu và trình tự gen
IFN-γ được tổng hợp 26
Bảng 2.2: Các mồi dùng trong giải trình tự gen
27
Bảng 2.3: Thành phần môi trường LB 28
Bảng 3.1: Kết quả đo OD
600
trên môi trường LB, kết quả lặp lại 3 lần
47
Bảng 3.2: Hàm lượng protein IFN-γ tại thời điểm cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần.
49
Bảng 3.3: Hàm lượng protein IFN-γ tại các nồng độ IPTG, kết quả lặp lại 6 lần.
51
Bảng 3.4: Hàm lượng protein IFN-γ tại các nhiệt độ, kết quả lặp lại 6 lần
52
Bảng 3.5: Hàm lượng protein IFN-γ theo thời gian cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần.
54

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sự hình thành IFN 4
Hình 1.2: Mô hình cấu trúc IFN-α ở người
5
Hình 1.3: Mô hình cấu trúc IFN-β ở người
5
Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ ở người 5
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc monomer IFN-γ ở người
7
Hình 1.6: Mô hình cấu trúc dimer của IFN-γ ở người
7
Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ bởi tế bào T/NK
8
Hình 1.8: Cấu tạo thụ thể của protein IFN-γ
10
Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu của protein IFN-γ
11
Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới
13
Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ
14
Hình 1.12: Cơ chế kháng virut của protein IFN-γ
16
Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac

22
Hình 1.14: Cơ chế kiểm soát âm và dương ở operon lac
24
Hình 2.1: Vector pNanogenIFN-γ 25
Hình 2.2: Các thang chuẩn dùng trong kỹ thuật điện di
27
Hình 2.3: Điều kiện phản ứng PCR 33
Hình 3.1: Kết quả thu nhận đoạn gen IFN-γ
43
Hình 3.2: Vector pNanogenIFN-γ 44
Hình 3.3: Kết quả PCR khuẩn lạc để sàng lọc dòng tái tổ hợp
45
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra vector pNanogenIFN-γ bằng phản ứng cắt với enzyme
NdeI/HindIII 46
Hình 3.5: Đường cong tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3) Star mang
vector
tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 48
Hình 3.6: Khảo sát thời điểm cảm ứng IPTG 49
Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG
50
Hình 3.8: Kết quả khảo sát theo nhiệt độ cảm ứng
52
Hình 3.9: Khảo sát biểu hiện IFN-γ theo thời gian
53 Hình 3.10: Kết quả lên men 500 ml trong chai
Schott 54
Hình 3.11: SDS-PAGE công đoạn tách chiết protein IFN-γ 55
Hình 3.12: Phổ đồ phương pháp lọc gel lần 1
56
Hình 3.13: SDS-PAGE phương pháp lọc gel lần 1 57
Hình 3.14: Phổ đồ giai đoạn cation 58

Hình 3.15: Kết quả SDS-PAGE công đoạn cation
58
Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần 2 59
Hình 3.17: Kết quả SDS-PAGE công đoạn lọc gel lần 2
60
Hình 3.18: SDS-PAGE (A) và western blot (B) các giai đoạn tinh chế
60
Hình 3.19:Phổ đồ kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế IFN-γ bằng HPLC
61





PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về IFN
1.1.1 Lịch sử phát hiện
Đầu những năm 1920, người ta đã nhận thấy khi các tế bào bị nhiễm virut thì các
tế bào đó và các tế bào lân cận không bị nhiễm tiếp bởi chính các virut ấy và các
virut khác. Năm 1937, Findlay và Mac Callum đã nhận thấy nếu nhiễm virut Rift
vào khỉ, sau đó nhiễm tiếp liều gây chết virut sốt vàng thì khỉ không bị bệnh sốt
vàng. Hai ông gọi hiện tượng này là sự can thiệp (interference) của virut [1].
Năm 1957, Alick Isaac và Jean Lindenman ở Viện nghiên cứu Y học Quốc gia
Luân Đôn đã tiến hành một thí nghiệm quan trọng mang tính lịch sử. Họ nhận
thấy rằng khi nhiễm virut cúm sống vào phôi gà đang phát triển mà trước đó đã
nhiễm virut cúm bất hoạt bằng nhiệt thì virut mới không thể nhân lên được. Nếu
nghiền phôi thành dịch rồi tiêm truyền vào phôi gà khác thì cũng ngăn cản sự nhân
lên của các virut trong phôi gà. Hai ông cho rằng hiện tượng này có liên quan đến
sự tạo thành một chất đặc biệt trong tế bào nhiễm virut và đặt tên cho nó là

interferon viết tắt là IFN [1], [39].
Vào năm 1965, 8 năm sau khi phát hiện ra IFN, Wheelock đã trình bày sự xuất
hiện của một chất có khả năng kháng lại vi sinh vật giống như IFN trong dịch nổi
của môi trường nuôi các tế bào bạch cầu của người sau khi chúng được ủ với
lectin phytohemagglutinin thực vật (PHA) [76].
Năm 1966, Glasgow có giả thuyết rằng sản phẩm IFN có vai trò không chỉ trong
thời gian đầu của quá trình xâm nhiễm virut mà còn có vai trò trong giai đoạn sau
khi đã xâm nhiễm. Để chứng minh quan điểm của mình, ông đã gây miễn dịch
chuột với virut Chikungunya và kiểm tra sản phẩm IFN thu được trong in vitro với
loại virut tương tự. Kết quả là hoạt tính của tế bào bạch cầu thu được từ chuột đã
được gây miễn dịch cao gấp 4 lần so với chuột ban đầu. Tuy nhiên tại thời điểm
đó, ông không giải thích được sự tồn tại của IFN-γ trong thí nghiệm quan sát. Mặc
dù vậy, trong phần thảo luận của mình ông cũng biện luận rằng: “sản phẩm IFN
tạo ra bởi tế bào bạch cầu sau khi đã bị xâm nhiễm virut có vai trò trong quá trình
miễn dịch của mô hay tế bào” [26].
Vào cuối những năm 1960, định nghĩa về “cảm ứng miễn dịch” của IFN đã được
xác định một cách tương đối rõ ràng. Năm 1972 và 1973, người ta thừa nhận rằng
IFN cảm ứng miễn dịch có sự khác nhau về đặc tính sinh hóa so với IFN cảm ứng
bởi virut. Rebecca Falcoff đã mô tả đặc điểm của IFN cảm ứng bởi kháng thể
kháng bạch cầu và cho thấy rằng nó dễ bị biến tính với axit và khả năng di chuyển
khác so với IFN cảm ứng bởi virut trên sắc ký DEAE-cellulose và lọc gel. Dựa
vào những kết quả nghiên cứu được, tác giả đã kết luận: “IFN được tổng hợp bởi
các tế bào của hệ miễn dịch dưới tác động của tác nhân gây miễn dịch được gọi là
IFN miễn dịch”. Trong một nghiên cứu quan trọng khác, Youngner và Salvin đã
cho thấy rằng, chuột bị nhiễm BCG (một dạng của vi khuẩn lao) khi được tiêm với
một vi khuẩn cổ Tuberculin thì thấy có sự ức chế mạnh mẽ quá trình phát triển của
vi khuẩn. Sự ức chế này là đặc tính của IFN, nhưng IFN này lại có sự khác nhau
so với IFN cảm ứng bởi virut. Dựa vào đó, tác giả đã kết luận rằng: “IFN tạo ra
bởi vi khuẩn cổ Tuberculin trong chuột đã gây miễn dịch với BCG là một loại
phân tử có khả năng ức chế vi sinh vật và được xác định là lớp II của IFN”. Trong

khi đó năm 1979, trình tự axit amin đầu của IFN ở tế bào bạch cầu và tế bào sợi ở
người đã được khám phá, và cho thấy có sự tồn tại của phân tử IFN tương đồng
trong chuột. Vào đầu những năm 1980, Committee đã đồng ý với đề xuất về thuật
ngữ IFN-α và IFN-β về một lớp của IFN, cả hai loại đều tồn tại ở trạng thái ban
đầu và xuất hiện sự đồng nhất. Mặc dù IFN cảm ứng miễn dịch không tồn tại ở
trạng thái ban đầu nhưng Committee đã nhận ra thành phần chính của nó rất khác
so với IFN-α và IFN-β, và đặt tên cho nó là IFN-γ, qua đó giải quyết được những
tranh luận về lựa chọn giữa “type II IFN” và “IFN miễn dịch”. Năm 1990, lần đầu
tiên Sydney Peska đã thành công trong việc tạo dòng và sản xuất chế phẩm từ
interferon (được tổ chức FDA của Mỹ cấp giấy chứng nhận) đó là interferon alfa
có khả năng điều trị viêm gan siêu vi B và C [1], [2], [21], [65], [81].
1.1.2 Đặc điểm chung
IFN là một nhóm các protein tự nhiên được tạo ra do các tế bào của hệ miễn dịch
ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virut, vi khuẩn,
kí sinh trùng và tế bào ung thư. Nó chỉ được tổng hợp khi có mặt các chất sinh
IFN (còn gọi là IFNogen). IFN thuộc một lớp glycoprotein được biết đến dưới cái
tên cytokine (chất hoạt hoá tế bào). IFN đóng vai trò quan trọng trong hệ thống
miễn dịch, nó là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virut và sự phát
triển bất thường của tế bào. IFN là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc
hiệu (non-specific immune system) và được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá
trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu (specific immune system) có thời
gian để phản ứng. Cần phân biệt IFN nội sinh được sinh ra trong cơ thể và IFN
ngoại sinh do nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể [18].
IFN có phân tử lượng thấp, khoảng 15 kDa (kiloDaltone) đến 25 kDa, dễ bị phân
giải bởi các enzyme như trypsin, pepsin. IFN khá bền nhiệt, hoạt tính chỉ bị mất
khi đun nóng ở 65-70
o
C trong một giờ hoặc 100
o
C trong 5 phút. Ở 4

o
C có thể bảo
quản IFN trong nhiều tháng. IFN cũng bền với axit, ở giá trị pH thấp (pH=2) hoạt
tính hầu như không bị mất.
IFN có tính kháng nguyên yếu. Chúng xuất hiện sau khi tế bào bị kích thích và tồn
tại trong máu một vài ngày đến một vài tuần. Đặc tính sinh học quan trọng của
IFN là không có tác dụng đặc hiệu đối với virut mà chỉ cảm ứng trạng thái kháng
virut của tế bào, IFN không phải chỉ được sinh ra trong các tế bào bị nhiễm virut
mà IFN còn được tạo thành khi tế bào bị kích thích bởi một số chất lạ khác như:
axit nucleic, vi khuẩn , độc tố của vi khuẩn, nguyên sinh động vật Vì vậy sự hình
thành IFN là do sự kích thích của nguồn thông tin lạ hay dưới tác động của bất cứ
nguồn thông tin ngoại lai nào.
Trong các tế bào không bị nhiễm virut, các gen cấu trúc chịu trách nhiệm tổng hợp
IFN luôn ở trạng thái không hoạt động, do đó ở tế bào bình thường không tạo nên
IFN. Khi virut xâm nhập hoặc các chất kích thích ngoại lai khác vào tế bào, chúng
giải tỏa sự kìm hãm và hoạt hóa các gen cấu trúc này. Thông tin từ gen cấu trúc
này được sao chép thành mARN tương ứng của tế bào và chính mARN này điều
khiển việc tổng hợp IFN. IFN sau khi sinh ra, một phần ở lại trong tế bào, còn
phần lớn ngấm qua vách tế bào ra ngoài để ngấm vào các tế bào khác (Hình 1.1).

Virut
Virut
m
ớ
i
T
ế
b
à
o

ch
ủ
1
T
ế
b
à
o
ch
ủ
1

Hình 1.
1
:
S
ự h
ình thành
IFN

1. Virut xâm nhiễm vào tế bào.
2. Dưới tác động của virut, các nhân tố trong tế bào sẽ di chuyển vào nhân và kích
thích các gen của IFN tạo mRNA.
3. mRNA di chuyển ra khỏi nhân và được dịch mã tạo ra interferon.
4. IFN được tổng hợp sẽ ở lại một phần trong tế bào và phần lớn sẽ di chuyển sang
các tế bào bên cạnh và kích hoạt trạng thái kháng virut ở các tế bào đó.
5. IFN chuyển sang các tế bào bên cạnh sẽ di chuyển vào nhân và kích thích tế bào
tiết ra các protein có khả năng kháng lại virut.
Các tế bào chịu tác động của IFN sẽ ức chế sự tổng hợp RNA hoặc DNA virut. Do
vậy, IFN được sử dụng như chất điều trị không đặc hiệu cho mọi nhiễm trùng

virut. Trạng thái kháng virut có thể nhanh chóng lan truyền từ tế bào này sang tế
bào khác, điều này giải thích tại sao cơ thể động vật có thể hoạt động nhanh như
vậy để chống lại virut ở tất cả các cơ quan được cảm ứng [23], [51], [81].
1.1.3 Phân loại và nguồn gốc
IFN là những protein được sinh ra bởi những tế bào bạch huyết hay tế bào sợi.
Chúng có vai trò chống lại khối u, kháng virut hay gây đáp ứng miễn dịch… Dựa
vào những đặc điểm như kháng nguyên, hoạt tính sinh học hay các thụ thể mà
người ta chia IFN thành 3 lớp:
Lớp I: Bao gồm IFN-α (Hình 1.2) và IFN-β (Hình 1.3). IFN-α có ít nhất 15 nhóm
phụ có khối lượng phân tử khoảng 18 kDa. Nguồn tế bào chính sản xuất IFNα là
bạch cầu đơn nhân. IFN-β là glycoprotein với khối lượng phân tử khoảng 20 kDa,
tế bào chủ yếu sản xuất IFN-β là nguyên bào sợi [1], [2].
Lớp II: IFN-γ là thành phần duy nhất của IFN lớp II, có cấu trúc khác hoàn toàn so
với IFN lớp I (Hình 1.4), bám vào các thụ thể khác nhau và được mã hóa bởi
nhiễm sắc thể khác nhau. IFN-γ hay còn gọi là IFN miễn dịch vì được tế bào T đã
hoạt hóa tạo thành nên thực chất cũng là một tế bào miễn dịch. IFN-γ là
glycoprotein gồm 2 chuỗi giống nhau với khối lượng phân tử từ 15 tới 24 kDa
được mã hóa bởi các gen giống nhau, các gen này có vị trí nằm trên nhiễm sắc thể
số 12 và bao gồm 3 đoạn intron. IFN-γ được sản xuất bởi các tế bào T, B, tế bào
trình diện kháng nguyên, tế bào giết tự nhiên…[3], [10], [79].
Lớp III: Thành phần duy nhất mới được khám phá hiện nay là IFN-λ với những
nghiên cứu còn tương đối hạn chế và đang được tiến hành nghiên cứu nhiều
hơn n
ữa
.

Hình 1.
2
:
Mô hình c

ấu trúc IFN
-
α
ở
Hình 1.
3
:
Mô hình c
ấu trúc IFN
-
β
ở ng
ư
ời

người



Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ ở người


1.2 Interferon gamma (IFN-γ)
1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ
Protein IFN-γ đã được nghiên cứu rất rộng rãi. Ở người, protein IFN-γ được dịch
mã từ một đoạn mRNA dài khoảng 1,2 kb tạo thành một chuỗi polypeptide chứa
khoảng 166 axit amin (Hình 1.5). Vị trí đầu amio axit ở axit amin thứ 23 tạo thành
cấu trúc kỵ nước đặc biệt, đây là cấu trúc mà khi bị ly giải sẽ tạo thành phân tử
protein IFN-γ hoàn chỉnh với 143 axit amin và có trọng lượng phân tử khoảng 17
kDa. Ở chuột, bản sao mRNA được dịch mã thành chuỗi polypeptide chứa 134

axit amin, chuỗi polypeptide này có thể bị phân giải tại 2 vị trí đầu N để tạo nên
phân tử có kích thước từ 15, 20 và 25 kDa. Quá trình thủy giải không làm ảnh
hưởng tới hoạt tính hay chức năng của IFN-γ nhưng nó lại gây ảnh hưởng tới
trạng thái tồn tại cũng như độ bền của phân tử. Protein IFN-γ trưởng thành ở
người và chuột chỉ có khoảng 36% trình tự chuỗi polypeptide giống nhau [3],
[29], [44].
Về mặt sinh lý học, hai chuỗi polypeptide của IFN-γ có thể kết hợp với nhau để
tạo thành một cấu trúc homodimer (Hình 1.6). Cấu trúc homodimer của IFN-γ
không bền, chúng có thể bị biến tính bởi nhiệt độ (t
o
> 65
o
C) hoặc pH (pH < 4, pH
> 9). Cấu trúc homodimer này có thể được xác định ở cấu trúc tinh thể của IFN-γ
ở người, thỏ và bò. Cấu trúc này nói lên rằng cấu trúc đầu tiên của IFN-γ có dạng
xoắn ốc với mỗi monomer có chứa 6 xoắn alfa (A-F hay 1-6) được nối với nhau
bởi những liên kết ngắn. Dạng dimer được hình thành thông qua sự tương tác của
những chuỗi xoắn alfa giữa các monomer. Hai đầu carboxyl của các chuỗi xoắn
E, F (5-6) từ mỗi chuỗi sẽ kết hợp với các cấu trúc xoắn A, B, C và D (1, 2, 3 và
4) để tạo thành từng cặp (Hình 1.6) [11], [20], [48], [77].

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc monomer Hình 1.6: Mô hình cấu trúc dimer của
IFN-γ
IFN-γ ở người ở người
Cấu trúc tinh thể của IFN-γ người bám vào thụ quan vùng ngoại bào cũng đã được
xác định. Khi bám vào thụ quan, các phân tử của IFN-γ kết hợp với nhau tạo cấu
trúc giống chữ V, nó được tạo thành bởi 2 cấu trúc xoắn theo trục đối xứng vuông
góc với màng nguyên sinh chất. Cấu trúc liên kết này đã được thấy trong cấu trúc
tinh thể của các cytokine liên quan như IL-10. Đặc biệt, các phân tử IFN-γ bám
vào hai thụ quan giống nhau để cảm ứng các phản ứng sinh học. Những nghiên

cứu sử dụng protein IFN-γ đột biến và chuỗi polypeptide nhân tạo đã phát hiện ra
vai trò của His 111, axit amin trong liên kết nối xoắn α giữa A và B (AB loop), và
phần còn lại ở đầu C trong vùng bám trung gian giữa IFN-γ và thụ thể của nó [29],
[48], [77].
1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ
Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) là nguồn sản sinh IFN-γ chủ yếu, nhất là
ở giai đoạn miễn dịch tự nhiên (miễn dịch bẩm sinh). Không giống như tế bào T
hay B, tế bào NK không sử dụng hệ thống thụ thể của kháng nguyên. Thay vào đó,
chúng sử dụng cả hai cách thức hoạt hóa và kiềm chế các thụ thể để nhận biết các
mục tiêu của chúng. Sự tăng nhanh về số lượng và chức năng cảm ứng của IFN-γ
bị ảnh hưởng bởi sự cân bằng của quá trình truyền tín hiệu thông qua hoạt hóa hay
ức chế tyrosin trên vùng bên trong tế bào của các thụ thể [24], [79].
Sự vắng mặt của phức hợp mô gắn màng (MHC) nhóm I có thể làm tăng sự kích
thích thông qua quá trình hoạt hóa các thụ quan, hoặc làm giảm tín hiệu thông qua
ức chế thụ quan, kết quả là sự biểu hiện chức năng của tế bào NK, bao gồm cả sự
sản xuất IFN-γ. Các cytokine cung cấp hai cơ chế mà qua đó tế bào NK có thể tiết
ra IFN-γ. Trong lúc phản ứng với các sản phẩm nhiễm từ vi sinh vật, các đại thực
bào tiết ra một lượng thấp TNF-α và các tiểu phần p40, p35 của IL-12. Chính
những cytokine này sẽ kích thích tế bào NK/T tiết ra một lượng thấp IFN-γ. IFN-γ
bắt nguồn từ tế bào NK sẽ kích thích lại các đại thực bào và làm tăng hàm lượng
các TNF-α và IL-12, các cytokine này sẽ bắt đầu cho việc tổng hợp IFN-γ với số
lượng lớn bởi tế bào NK. Chính sự tác động kích thích qua lại này đã tạo ra được
một lượng lớn IFN-γ và một lượng lớn các đại thực bào đã được hoạt hóa. Bên
cạnh đó, một lượng IFN-γ cũng tham gia kích thích, hoạt hóa các tế bào T và NK
(Hình 1.7) [6], [33], [75].

Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ bởi tế bào T/NK
Sản phẩm IFN-γ được điều hoà âm bởi IL-4, IL-10. Chức năng chủ yếu của IL-10
là ngăn cản đại thực bào tiết ra TNF-α và IL-12 bởi cơ chế làm giảm quá trình tạo
bản sao của nhân tố Stat3 (nhân tố đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của

tế bào) [62], [69].
1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của IFN-γ
1.2.3.1 Cấu trúc thụ thể của IFN-γ
Tất cả các tế bào, trừ các hồng cầu trưởng thành, đều biểu hiện các thụ thể bề mặt
của cả 2 loại IFN nhóm I và II. Số lượng các thụ thể này thay đổi từ 100 tới 2000
trên một tế bào. Các thụ thể này là các glycoprotein xuyên màng, các vùng ngoại
bào của nó bám vào IFN và các vùng trong tế bào chất thì bám với Jak (Janus
tyrosin kinase), Stat và các protein tín hiệu khác.
Các thụ thể của IFN-γ gồm 2 tiểu đơn vị khác nhau. Một đơn vị lớn là IFNGR1
(IFN-γ receptor α, IFN-γ-R1 hoặc CDw119), có vị trí rất quan trọng của các
ligand. Một đơn vị nhỏ hơn là IFNGR2 (IFN-γ receptor β, IFN-γ-R2 hoặc nhân tố
phụ-1), cần cho quá trình chuyền tín hiệu của IFN-γ.
IFNGR1 được mã hoá bởi đoạn gen khoảng 30 kb trên nhiễm sắc thể số 6 ở người
và ở chuột đó là đoạn gen khoảng 22 kb nằm trên nhiễm sắc thể 10.
Cả hai gen đều có cấu trúc giống nhau và bao gồm 7 exon. Exon từ 1-7 của gen ở
người được mã hoá cho vùng bên ngoài tế bào, exon 6 mã hoá là vùng xuyên
màng và exon 7 mã hoá cho phần lớn vùng bên trong tế bào. Quá trình phiên mã
của gen ở mỗi loài tạo ra một đoạn mRNA khoảng 2,3 kb (kilobase). Phân tử
protein trưởng thành ở người có khoảng 472 axit amin và ở chuột là 451 axit
amin, cả hai đều có cách thức sắp xếp giống nhau trên màng tế bào. Ở cả người và
chuột thì vùng ngoài của tế bào có chứa 228 axit amin bao gồm 10 cystein và 5 vị
trí thuỷ giải liên kết với đầu N. Cấu trúc lõi của ligand bám vào vùng ngoài của
IFNGR1 là một phân tử giống như roi, chúng được cuộn lại thành hai vùng D1
(vùng ngoài màng) và D2 (vùng gần màng) [3], [12], [22].
Vùng bên trong của IFNGR1 bao gồm các motif gắn với Jak1, các nhân tố trong tế
bào chất, tín hiệu vận chuyển và nhân tố hoạt hoá Stat1. Ở người, Jak1 bám vào
vùng LPKS là một trình tự gần màng có vị trí axit amin từ 266-299. Trong khi đó
vị trí bám của Stat1 là YDKPH ở vị trí axit amin từ 440-444, chính motif này có
chứa vị trí Y
440

có khả năng bị phosphoryl hoá trong quá trình vận chuyển tín hiệu
để cho phép phân tử Stat1 đến được với thụ thể của nó. Phần còn lại
441
DKPH
444
là
những vị trí chịu trách nhiệm cho khả năng gắn đặc hiệu của Stat1 vào IFNGR1
(Hình 1.8) [20], [44], [76].
1.2.3.2 Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ
Sự kiện cốt yếu trong truyền tín hiệu ở cả IFN nhóm I và IFN nhóm II là sự dimer
hóa của các thụ thể. Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ cần ít nhất 5 protein: 2
tiểu đơn vị của thụ thể, protein tyrosine kinase Jak1 và Jak2, và Stat1.
Trong tế bào không được kích thích, các tiểu đơn vị của thụ thể IFN-γ kết hợp lại
với nhau ở vùng bên trong tế bào tạo thành trạng thái không hoạt động của Jak1 và
Jak2. Jak1 bám vào IFNGR1 cần 4 trình tự axit amin (LPKS), ở vùng gần màng
bên trong tế bào của IFNGR1, trong khi đó Jak2 kết hợp với 12 axit amin
(PPSIPLQIEEYL) bên trong tế bào của IFNGR2. Tín hiệu vận chuyển được bắt
đầu khi phân tử IFN-γ bám vào thụ thể của nó và cảm ứng Jak bởi sự phosphoryl
hóa (Hình 1.8). Các enzyme phosphoryl hóa (kinase) được hoạt hóa, khi đó nó sẽ
phosphoryl hóa lại phần tyrosin ở vùng axit amin YDKPH gần đầu C của chuỗi
IFNGR1, bằng cách đó nó sẽ hình thành nên một vùng trình tự được phosphoryl
hóa trên các thụ thể, đây là điểm nhận diện của vùng SH2 của Stat1. Hai phân tử
Stat1 khi đó sẽ bám vào hai vị trí đã được hoạt hóa trên thụ thể và và chúng sẽ tự
phosphoryl hóa ở vị trí Tyrosin (Y701) gần đầu C của chúng bởi sự kết hợp và
hoạt hóa tyrosin kinase. Hai phân tử protein Stat1 được phosphoryl hóa khi đó sẽ
tách ra từ đơn vị IFNGR1 và hình thành một dimer thông qua sự tương tác lẫn
nhau giữa phosphotyrosine và vùng SH2. Trong quá trình hoạt hóa, phân tử Stat2
cũng được phosphoryl hóa ở phần serine (S727) thông qua cơ chế khác biệt của
kinase từ Jak. Homodimer Stat1 được hoạt hóa sẽ kết hợp với một thụ quan liên
quan tới nhân là NPI-1 (importin-α) qua một tín hiệu với cấu thể mới là vùng giàu

Arginin/lysine trong nhân, tín hiệu này được tạo ra bởi hai phân tử Stat1 bám trên
DNA ở vùng dimer. Cùng với Importin p97, kết hợp với NPI-1, phân tử Stat1 sẽ di
chuyển qua vùng lõi nhân nhờ quá trình hoạt hóa sự thủy giải của GTP. Ở bên
trong nhân, homodimer Stat1 sẽ được hoạt hóa, người ta gọi là nhân tố được hoạt
hóa bởi gamma (GAF-γ-activated factor), bám vào yếu tố GAS và gây tác động
đến bản sao
của gen gây cảm ứng bởi IFN-γ (Hình 1.9) [4], [12], [29], [54], [57], [69].

Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu của protein IFN-γ

1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ
1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của IFN-γ
Gan là một trong những cơ quan đóng vai trò sống còn trong cơ thể con người.
Gan là cơ quan giúp loại bỏ các độc chất, vi khuẩn khỏi máu và là nơi dự trữ năng
lượng, các men và hormon quan trọng trong cơ thể [85].
Xơ gan là một bệnh gan mạn tính được đặc trưng bởi sự thay thế mô gan bằng mô
xơ, sẹo và sự thành lập các nốt tân sinh dẫn đến mất chức năng gan. Các nguyên
nhân thường gây ra xơ gan bao gồm nghiện rượu, viêm gan siêu vi, và bệnh gan
nhiễm mỡ. Bệnh gan mãn tính và xơ gan là những nguyên nhân gây tử hàng đầu.
Tỉ lệ tử vong của người mắc bệnh xơ gan là 34-66% trong vòng 10 năm, phần lớn
phụ thuộc vào nguyên nhân gây xơ gan. Có ít thông tin về các tác nhân điều biến
của nguy cơ xơ gan, một phần từ các bệnh khác gây tổn thương gan như kết hợp
giữa bệnh gan liên quan đến rượu và viêm gan mãn tính do siêu vi, chúng có thể
đóng vai trò kết hợp dẫn đến xơ gan [85], [86].
Xơ gan là một bệnh nguy hiểm và thường gặp ở nước ta. Đây là một bệnh mạn
tính kéo dài có ảnh hưởng xấu và có tỷ lệ tử vong cao bởi cho đến nay trên thế
giới cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và
Đông y). Một trong số nguyên nhân hàng đầu dẫn đến xơ gan là do viêm gan virut
(nhất là viêm gan virut B và C). Xơ gan sau khi bị viêm gan do virut là do tế bào
gan bị hoại tử bởi sự tấn công của virut viêm gan, nên người ta còn gọi là xơ gan

hoại tử. Ở nước ta, xơ gan do virut chiếm một tỷ lệ đáng kể (khoảng 40%). Khi bị
nhiễm virut viêm gan B có thể trở thành viêm gan B mạn tính hoặc người lành
mang virut viêm gan B. Người ta thấy rằng đối với viêm gan B mạn tính thì loại
viêm gan B thể hoạt động là đáng lo ngại nhất bởi vì chúng rất dễ dẫn đến xơ gan.
Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính có tính chất địa lý khác nhau (Hình 1.10).
Khu vực Đông Nam châu Á, trong đó Việt Nam, Trung Quốc, một số nước Trung
Á, Ả rập, khu vực Trung và Nam châu Phi, khu vực Bắc Nam Mỹ, Alaska và Bắc
Canada là những vùng đại dịch nhiễm virut viêm gan B mạn tính, với tỷ lệ người
nhiễm virut mạn tính trên 8% dân số, có khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc
đang nhiễm virut viêm gan B và 350 triệu người mang virut này mãn tính và dẫn
tới xơ gan. Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính tại Việt Nam trên 8% dân số và
một số tỉnh có thể lên đến 15-20%, ước tính hiện nay tại Việt Nam có khoảng 12-
14 triệu người nhiễm virut viêm gan B và dẫn tới xơ gan [85].
Xơ gan sau viêm gan B mạn tính có ảnh hưởng xấu nhất bởi vì có khoảng 75%
bệnh nhân tử vong trong vòng từ 1-5 năm do chảy máu đường tiêu hoá hoặc ung
thư hoá. Xơ gan là một bệnh nặng mà hậu quả xấu nhất là khi xơ gan đã có cổ
chướng (báng nước) hoặc hoàng đản (vàng da). Có khoảng gần 70% bệnh nhân tử
vong trong năm đầu và khoảng 85% sau 2 năm bị xơ gan. Tuy vậy bệnh tiến triển
như thế nào còn tùy thuộc vào chế độ dinh dưỡng, chế độ sinh hoạt, làm việc cũng
như việc phòng tránh các bệnh nhiễm khuẩn khác tốt hay không. Hậu quả của xơ
gan có thể bị chảy máu tiêu hoá, điển hình là vỡ tĩnh mạch thực quản gây chảy
máu ồ ạt đưa đến tình trạng sốc do trụy tim mạch rất khó cứu chữa. Hầu hết các
trường hợp khác có thể hôn mê dẫn đến tử vong hoặc bị ung thư hoá [35], [36],
[68], [72], [84].

Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới

Phương pháp điều trị xơ gan bằng IFN-γ
Hiện nay trên thế giới cũng như tại Việt Nam chưa có thuốc điều trị đặc hiệu đối
với xơ gan. Việc điều trị chủ yếu là nhằm vào việc loại bỏ hay kìm hãm các tác

nhân gây xơ gan. Việc điều trị bằng protein IFN-γ hằm loại bỏ các virut gây viêm
gan thông qua những tác động đa dạng như: Kích thích tế bào kháng lại virus, có
những cơ chế điều biến miễn dịch đa dạng [35], [36]…
Phương pháp điều trị xơ gan bằng tế bào gốc kết hợp với protein IFN-γ
Hiện nay, phương pháp cấy ghép tế bào gốc kết hợp với protein IFN-γ trong
điều trị xơ gan là công nghệ trị liệu đạt hiệu quả cao. Đầu tiên tách tế bào của
bệnh nhân trong máu, tủy xương bằng các dụng cụ chuyên dụng, sau đó đưa vào
phòng thí nghiệm vô trùng, tiến hành tinh chế, chia tách, kiểm định và nuôi
dưỡng. Cuối cùng thông qua phương pháp truyền dịch để đưa tế bào gốc vào gan
qua động mạch, sau khi tế bào gốc được nuôi cấy trong cơ thể bệnh nhân sẽ tiếp
tục phân hóa trong gan, nhằm thay thế các tế bào bị tổn hại, nhiễm độc khiến gan
bị mờ và suy yếu, giúp phục hồi chức năng gan và đạt được hiệu quả điều trị bệnh.
Trong khi đó, protein IFN-γ được dùng như một chất gây kích thích hệ miễn dịch
chống nhiễm khuẩn, loại bỏ các virut [89].
1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ trong điều trị bệnh
Ho
ạ
t
h
ó
a
Ho
ạ
t
h
ó
a
Ho
ạ
t

h
ó
a
Tăng
ho
ạ
t
t
í
nh
t
ế
b
à
o
NK
T
á
c
đ
ộ
ng
t
ớ
i
MHC
nh
ó
m
I

ho
ặ
c
II
Ho
ạ
t
h
ó
a
t
ế
b
à
o
T
D
ừ
ng
chu
tr
ì
nh
phân
chia
t
ế
b
à
o

Kh
á
ng
virut
Gây
appoptosis

Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ
Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm I
IFN-γ làm tăng số lượng và độ đa dạng của các đoạn polypeptide được trình diện
trên MHC nhóm I. Sự tăng cường trình diện MHC I bởi IFN-γ đóng vai trò quan
trọng trong đáp ứng của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh nội bào, vì nó làm
tăng khả năng nhận diện của tế bào T độc với các chuỗi polypeptide lạ, do đó thúc
đẩy sự cảm ứng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. IFN-γ kích thích cảm
ứng sự thay thế các tiểu phần của proteasome bằng các tiểu phần
immunoproteasome tạo thành các loại proteasome mới và cắt các đoạn
polypeptide lạ, từ đó làm tăng số lượng các chuỗi polypeptide được trình diện và
làm tăng khả năng phân giải các chuỗi polypeptide lạ. Ngoài việc tăng về số lượng
các chuỗi polypeptide được cắt thì immunoproteasome còn góp phần tạo ra các
đoạn polypeptide có khả năng liên kết với MHC tốt hơn, giúp cho việc trình diện
kháng nguyên hiệu quả hơn. IFN-γ còn cảm ứng sự biểu hiện của protein hoạt hóa
proteasome như PA28, protein vận chuyển TAP vận chuyển các đoạn polypeptide
từ tế bào chất vào lưới nội chất [7], [15], [30], [31], [32], [63].
Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm II
IFN-γ cảm ứng làm tăng sự biểu hiện của các tiểu phần trong phức hợp MHC
nhóm II, qua đó tăng khả năng trình diện các đoạn polypeptide lạ cho các tế bào T-
CD4. IFN-γ cũng cảm ứng sự biểu hiện chuỗi Ii, là chaperon có vai trò trong sự
trình diện kháng nguyên của MHC II. DM, một protein có chức năng loại bỏ các
đoạn CLIP (là phần còn lại của chuỗi Ii trong endosome, có chức năng che vùng