ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỌ GỪNG (ZINGIBERACEAE) VÙNG BẢY NÚI – AN GIANG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
^ U ]


NGUYỄN LÊ HUYỀN THANH







ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỌ GỪNG
(ZINGIBERACEAE) VÙNG BẢY NÚI – AN GIANG





Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số:
60 42 70






LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN THU HOA









TP. Hồ Chí Minh - năm 2010
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng, tôi xinh gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Trần Thu Hoa,
người thầy hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này.
Xin cảm ơn tất cả các thầy cô trong Khoa đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho
tôi trong suốt những năm đại học và cao học.
Xin cảm ơn PGS.TS.Hồ Huỳnh Thùy Dương, cô đã giới thiệu tôi với PGS. TS. Trần Thu
Hoa.
Xin c
ảm ơn PGS.TS Trần Cát Đông, thầy đã giúp đỡ thiết bị máy móc trong những lúc đề
tài gặp khó khăn.
Cảm ơn các anh, chị, em Phòng thí nghiệm Vi sinh – Công nghệ dược, Bộ môn Vi sinh – Kí
sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và các bạn lớp Di truyền K17
luôn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, TS. Trần Hoàng Dũng đã giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
C
ảm ơn Phân viện Nghiên cứu Khoa học lâm nghiệp Nam Bộ đã tạo điều kiện về thời gian
để tôi có thể tham gia khóa học và hoàn tất luận văn đúng thời hạn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Hữu Vi, gia đình và những người bạn thân đã luôn quan
tâm, chăm sóc, tạo thời gian và động lực cho tôi hoàn tất tốt công việc.
Xin chân thành cảm ơn.
Nguyễn Lê Huyền Thanh

- 1 -

Mở đầu
MỞ ĐẦU
Họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam rất phong phú, có từ 17 đến 20 chi và trên
100 loài [3]. Các cây họ Gừng được sử dụng từ lâu đời, làm gia vị hoặc làm thuốc,
bộ phận dùng thường là thân rễ. Với sự phát triển của khoa học, người ta đã nghiên
cứu và chứng minh được các tác dụng dược lý quý giá của các cây họ Gừng.
Các nghiên cứu ban đầu về cây thuốc có khả năng chữa ung thư ở Việt Nam cho
thấ
y có 50 loài thuộc 36 chi và 24 họ có khả năng chữa ung thư, trong đó
Zingiberaceae là đa dạng nhất (16%) [8]. Ngoài ra, trong một nghiên cứu sàng lọc
tác dụng kháng ung thư trên 77 cây thuốc Việt Nam thu thập từ vùng Bảy Núi, An
Giang và Lâm Đồng cho thấy 15 dịch chiết của 6 cây có khả năng kháng ung thư
trên một số dòng tế bào, trong đó có các loài nằm trong chi Alpinia thuộc họ Gừng
[43].
Ở vùng Bảy Núi, bên cạnh gừng, nghệ, riềng, đồng bào còn trồng và sử dụng m
ột số
cây ngải thuộc họ Gừng để chữa các chứng đau bụng khí, viêm đại tràng, bó chữa
trật chân. Thực tế các loài ngải nói riêng, họ Gừng nói chung rất phong phú, lại có
đặc điểm hình thái khá giống nhau, phân bố ở các vùng khác nhau với tên gọi khác
nhau, nên nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu, hoá học (kiểu hình)
thì chưa đủ để xác định, rất dễ bị nhầm lẫ
n. Để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu
phục vụ công tác bảo tồn nguồn gene cũng như phát triển nguồn dược liệu nhiều

tiềm năng này, chúng tôi tiến hành đề tài khảo sát đa dạng di truyền một số cây
thuốc họ Gừng (Zingiberaceae) ở vùng Bảy Núi – An Giang.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
1. Sử dụng phương pháp PCR – RAPD khảo sát đa dạng di truyền.
2. Xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự DNA vùng ITS, vùng trnK –
matK và kết hợp vùng ITS và trnK – matK.
3. Bước đầu định danh các mẫu ngải dựa vào trình tự ITS và matK.
- i -


MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT III
DANH MỤC BẢNG V
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ VI
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái 2
1.1.2. Phân bố 3
1.1.3. Giá trị sử dụng 3
1.1.4. Phân loại thực vật 4
1.2.1. Marker phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu bộ gene thực vật 6
1.2.2. Ứng dụng marker phân tử trong nghiên cứu cây họ Gừng 8
1.3.1. Trình tự DNA và phân loại thực vật 9
1.3.2. Định danh cây họ Gừng 14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16
2.3.1. Chiết tách và tinh sạch DNA 19
2.3.2. Kiểm tra dịch chiết DNA 20
2.3.3. Điện di 21
2.3.4. PCR-RAPD các mẫu ngải 21

2.3.5. PCR và giải trình tự vùng ITS 24
2.3.6. PCR và giải trình tự vùng trnK 25
2.3.7. Phân tích di truyền 27
1.1. Khái quát về họ Gừng (Zingiberaceae) 2
1.2.
Marker phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền họ Gừng 6
1.3.
Nghiên cứu phát sinh loài họ Gừng 9
2.1. Mẫu nghiên cứu 16
2.2. Thiết bị 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
- ii -


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29
3.1.1. Kết quả PCR-RAPD 29
3.1.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu ngải 29
3.2.1. Phân tích vùng ITS 34
3.2.2 Phân tích vùng trnK - matK 35
3.2.3. Xây dựng cây phát sinh loài 37
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC 57

3.1. Đa dạng di truyền các mẫu ngải bằng kỹ thuật PCR - RAPD 29
3.2. Kết quả phân tích ITS và matK 34
3.3. Định danh khoa học 47
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
4.1. Kết luận 49
4.2. Đề nghị 50

Phụ lục A. Hình ảnh một số mẫu ngải 57
Phụ lục B. Hình PCR-RAPD với các mồi 59
Phụ lục C. Trình tự
ITS các mẫu thực nghiệm 61
Phụ lục D. Trình tự trnK - matK các mẫu thực nghiệm 66
- 2 -

Tổng quan
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về họ Gừng (Zingiberaceae)
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Các cây trong họ Gừng (Zingiberaceae) gồm những cây thân thảo sống lâu năm. Rễ
nhỏ, hình sợi; đôi khi đầu rễ phình to lên thành dạng củ. Thân rễ to, nạc, nằm
ngang, chứa nhiều chất dự trữ, có khi rất ngắn hoặc chỉ mang hoa. Các bẹ lá ôm
chặt lấy nhau tạo thành thân giả, rất ngắn hoặc không có (Distichochlamys,
Kaempferia…) hay cao 1 - 3 m, đôi khi cao tới 4 - 5 m (Alpinia, Amomum…),
không phân nhánh. Cây thường có mùi thơm hoặc mùi hắc như một số loài trong
chi Zingiber. Lá đơn, mọc cách, các lá xếp thành hai hàng, thường hướng lên trên,
đôi khi nằm ngang gần như song song với mặt đất (Kaempferia galanga,
K. pulchra); có khi lá chỉ là bẹ lá dạng vảy. Lá gồm các phần: bẹ lá, cuống lá, lưỡi
lá và phiến lá. Bẹ lá mở đến gốc, phần dưới bẹ lá thường ôm chặt lấy nhau thành
thân giả
. Cuống lá có thể có hay không có, ngắn hay dài (có thể dài tới 25 cm), hình
lòng máng nông hoặc sâu. Lưỡi lá (thìa lá) là phần giữa bẹ lá và cuống lá, từ bẹ lá
kéo dài lên. Lưỡi dày hay mỏng dạng màng, đầu nguyên hay xẻ hai, cụt ngang, dài
1 - 2 mm tới vài cm. Phiến lá: hình mác, hình trứng hẹp, bầu dục, ít khi gần tròn
(K. pulchra), gốc phiến nhọn, hình nêm hay gần tròn; đầu phiến thường nhọn, đôi
khi thót nhỏ thành dạng đuôi, hiếm khi tròn. Thông thường phiến lá màu xanh,
nhưng ở một vài loài trong một số chi m
ặt trên lá có đốm trắng loang lổ

(Stahlianthus) hay dọc gân chính mặt trên nâu đỏ (Curcuma) hoặc mặt dưới nâu đỏ
(Distichochlamys, Stahlianthus, Zingiber). Cụm hoa mọc trên ngọn thân có lá hay
từ thân rễ sát mặt đất, tách biệt với thân có lá, hoặc từ giữa các bẹ lá. Cụm hoa dạng
chùy, chùm hay bông. Cuống cụm hoa mọc từ thân rễ ở một số chi được bao phủ
bởi các bẹ lá dạng vảy thưa hay dày. Cụm hoa thường không phân nhánh, tr
ừ một
số ít loài trong các chi Globba, Alpinia, Elettaria, Elettariopsis [2].
- 3 -

Tổng quan
1.1.2. Phân bố
Họ Gừng phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới. Nó được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới
châu Á, châu Phi và châu Mỹ; đặc biệt phân bố rộng rãi nhất ở vùng Đông Nam Á.
Một chi được tìm thấy ở Trung và Nam Mỹ là Renealmia; bốn chi
Aframomum, Aulotandra, Siphonochilus, và Renealmia được tìm thấy ở Châu Phi;
các chi còn lại phân bố ở vùng Đông Á và các đảo thuộc Thái Bình Dương [23].
Bảng 1.1 trình bày sự phân bố họ Gừng ở châu Á, vùng
Đông Dương có tới 120 loài
(số liệu năm 1998) [40].
Bảng 1.1. Phân bố họ Gừng ở Châu Á [40].
Vùng địa lý Chi Loài
Thế giới (tổng cộng) 52 1500
Trung Quốc 21 200
Ấn Độ 18 120
Đông Dương 14 120
Malaysia 25 650
Nepal 11 35
Philippines 15 103
Thái Lan 20 200
1.1.3. Giá trị sử dụng

Trong bộ Gừng (Zingiberales) ở Việt Nam, họ Gừng (Zingiberaceae) là họ có số
lượng loài nhiều nhất. Đây là một họ có nhiều đại diện có giá trị làm thuốc chữa
bệnh, nhiều loài được sử dụng làm gia vị, làm cảnh
[2].
Các cây thuộc họ Gừng được sử dụng làm thuốc theo các bài thuốc dân gian như
Riềng (Alpinia officinarum Han.) dùng làm gia vị và làm thuốc.
Nghệ (Curcuma
domestica-Val. hay C. Longa L.) có thân rễ làm gia vị, làm thuốc chữa bệnh dạ dày,
bệnh vàng da, dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ.
Gừng (Zingiber officinale Rosc.) có
thân rễ thơm cay, dùng làm gia vị, làm mứt và làm thuốc, có tác dụng hưng phấn, dễ
tiêu.
Gừng gió (Z. zerumbet Sm. ex L.) có thân rễ vị đắng và cay, cũng được dùng
- 4 -

Tổng quan
làm thuốc. Ở rừng Việt Nam, còn gặp một số cây mọc ở tầng thấp như Ré (Alpinia
speciosa K. Chum.) có cánh môi vàng viền đỏ, quả mọng hình cầu, cây dùng lấy
sợi.
Thảo quả (Amomum tsaoko Roxb.) và Sa nhân (A. villosum Lour.) là hai loại
cây dùng làm thuốc, được khai thác nhiều để xuất khẩu, gặp nhiều ở các rừng miền
Bắc Việt Nam.
1.1.4. Phân loại thực vật
Hệ thống phân loại
Giới (Kingdom) Thực vật (Plantae)
Phân giới (Subkingdom) Tracheobionta
Ngành (Division) Magnoliophyta
Lớp (Class) Liliopsida
Phân lớp (Subclass) Zingiberidae
Bộ (Order) Zingiberales

Họ (Family) Zingiberaceae
Tại hội nghị chuyên đề lần III về Zingiberaceae tổ chức tại Thái Lan từ ngày 7 - 12
tháng 7 năm 2002 , Dr. W. John Kress đã đề nghị một cách phân loại họ Gừng mới,
dựa trên những nghiên cứu gần đây, bao gồm các phân tích về đặc điểm phân tử và
hình thái. Ông đã
đề nghị chia họ Gừng thành 4 phân họ lớn, gồm 6 tông và 53 chi,
được thể hiện ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Phân loại họ Gừng theo W. John Kress [23].
Phân họ
Siphonochiloideae
Phân họ
Tami
j
ioideae
Phân họ Alpinioideae Phân họ Zingiberoideae
Tông
Siphonochileae
Tông
Tamijieae
Tông
Alpinieae
Tông
Riedelieae
Tông
Zingibereae
Tông
Globbeae
Siphonochilus Tamijia *Aulotandra Burbidgea Curcuma Globba
Aframomum
P

leuranthodium Smithatris Mantisia
Renealmia Riedelia Hitchenia Gagnepainia
- 5 -

Tổng quan
*Elettaria Siamanthus Stahlianthus Hemiorchis
*Leptosolena *Paracautleya
*Geostachys *Laosanthus
*Geocharis Camptandra
*Cyphostigma Pyrgophyllum
Amomum Hedychium
Paramomum Rhynchanthus
*Elettariopsis Pommereschea
Alpinia *Stadiochilus
Plagiostachys *Nanochilus
Vanoverberghia Cautleya
Etlingera Roscoea
Hornstedtia Haniffia
Siliquamomum (Incertae Sedis) Boesenbergia
Curcumorpha
Kaempferia
*Haplochorema
Zingiber
Distichochlamys
Scaphochlamys
Cornukaempferia
*Parakaempferia

Caulokaempferia (Incertae
Sedis)

* các chi chưa có mẫu được phân tích về phát sinh loài dựa trên các đặc tính phân tử
- 6 -

Tổng quan
Theo các nghiên cứu trong nước gần đây, họ Gừng ở Việt Nam có 19 chi với
khoảng 136 - 145 loài [2]. Sau đây là các chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có ở
Việt Nam [2]:
Chi 1. Alpinia Roxb. – Riềng, Sẹ
Chi 2. Amomum Roxb. nom. cons. – Sa nhân, thảo quả
Chi 3. Boesenbergia Kuntze – Bồng nga truật
Chi 4. Caulokaempferia K. Larsen – Đại bao khương
Chi 5. Cauley (Benth.) Royle ex Hook. f. – Cầu ly
Chi 6. Curcuma L. nom. cons. – Nghệ
Chi 7. Distichochlamys M. F. Newman – Gừng đen
Chi 8. Elettaria (L.) Maton
– Trúc sa, tiểu đậu khấu
Chi 9. Elettariopsis Baker – Tiểu đậu
Chi 10. Etlingera Giseke – Ét ling
Chi 11. Gagnepainia K. Schum. – Găng ba
Chi 12. Geostachys (Baker) Ridl. – Địa sa
Chi 13. Globba L. – Lô ba
Chi 14. Hedychium Koen. – Ngải tiên, bạch diệp
Chi 15. Hornstedtia Retz. – Giả sa nhân
Chi 16. Kaempferia L. – Địa liền, thiền liền
Chi 17. Siliquamomum Baill. – Sa nhân giác
Chi 18. Stahlianthus Ktunze – Tam thất gừng
Chi 19. Zingiber Boehm. – Gừng, khương
1.2. Marker phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền họ Gừng
1.2.1. Marker phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu bộ gene thực vật
Có rất nhiều kĩ thuật phân tử dùng để phân tích đa hình DNA. Nhìn chung chúng có

thể chia làm 3 loại là: các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai, các phương pháp dựa
trên PCR và các phương pháp dựa trên giải trình tự
[9].
- 7 -

Tổng quan
1.2.1.1. Các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai
Các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai gồm RFLP (restriction fragment length
polymorphisms) và VNTR (variable number tandem repeat). Các mồi đánh dấu
được lai trên màng lai chứa enzyme cắt giới hạn DNA. Sự hiện diện hay vắng mặt
của các băng trong kết quả lai giúp tìm ra tỉ lệ đa hình [9].
1.2.1.2. Các phương pháp dựa trên PCR
Các kĩ thuật dựa trên khái niệm này gồm các PCR mồi ngẫu nhiên (AP-PCR), sự đa
hình các đoạn DNA được khuếch đạ
i ngẫu nhiên (RAPD) và dấu vân tay khuếch đại
DNA (DAF) [33]. Ngoài ra còn có ISSRs, SSR, AFLP… Hiện nay, các marker
thường được sử dụng nhất là RAPD [9].
RAPD là một trong những công cụ đơn giản, kinh tế và mạnh nhất để khảo sát các
biến đổi di truyền. Trong các nghiên cứu đã công bố, kĩ thuật RAPD thường cho số
lượng locus đa hình lớn, khá dễ thu được ngay cả với các loài không có sẵn thông
tin di truyền. So với các marker quần thể khác, marker RAPD cho kết quả khá
tương đồ
ng với AFLP, ISSR và allozyme. Các marker RAPD được sử dụng khá phổ
biến, trong 307 nghiên cứu (từ năm 1993-2003), để đánh giá đa dạng di truyền cùng
loài [16].
Tuy đơn giản và rẻ tiền, nhưng kết quả đa hình từ RAPD lại rất dễ bị ảnh hưởng bởi
các yếu tố của phản ứng PCR, đòi hỏi độ tinh sạch của khuôn DNA cao. DNA
khuôn có lẫn RNA, ethanol, polysaccharide, phenolics cũng là những nguyên
nhân dẫn đến sự đ
a hình. RAPD chỉ phát hiện tính trạng trội nên những gene mang

tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình, gây khó khăn và không xác định được cá
thể dị hợp tử. Ngoài ra, độ lặp lại của RAPD không cao khi tiến hành tại các phòng
thí nghiệm khác nhau. Những nhược điểm trên đòi hỏi chúng ta phải thực hiện việc
tối ưu hóa điều kiện phản ứng trước khi sử dụng phương pháp này. Do đó, kỹ thu
ật
RAPD thường được kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng
di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.
- 8 -

Tổng quan
1.2.1.3. Các phương pháp dựa trên giải trình tự
Nhiều thông tin có thể thu được từ trình tự DNA. Trình tự DNA có thể được sử
dụng để nghiên cứu mối liên hệ phát sinh loài giữa các loài khác nhau. Trình tự
cũng cho phép phát hiện các loài mới hay các loài khác thường. Một ứng dụng ưu
việt khác là xác định loài tranh cãi bằng cách so sánh trình tự này với trình tự đã
được công bố trên cơ sở dữ liệu (như GenBank). Tuy nhiên để giải trình tự, chúng
ta cần bi
ết trước trình tự để thiết kế mồi khuếch đại vùng gene mong muốn.
Sự đa hình và biến đổi trong trình tự DNA có thể xảy ra do sự thay thế, thêm hoặc
bớt các nucleotide. Các biến đổi này có thể được phát hiện một cách trực tiếp và có
thể thu được thông tin về một locus. Biến đổi di truyền ở mức độ một nucleotide
xảy ra khắp nơi. Giải trình tự trực tiếp có thể xác đị
nh được đa hình đơn nucleotide
ở từng loài nghiên cứu.
Một chiến lược khác của giải trình tự là phân tích sự đa dạng của trình tự ITS của
rDNA. Vùng ITS của rDNA 18S-26S cung cấp một trình tự hữu ích để nghiên cứu
sự phát sinh loài của nhiều họ thực vật hạt kín. Các trình tự DNA khác như trnK của
DNA lục lạp và vùng 5S rDNA cũng là các công cụ nhận định [9].

Các vùng khác nhau trong bộ gene có tỉ lệ tiến hóa khác nhau, có thể sử dụng để

định danh ở các mức độ phân loại khác nhau. Các vùng không mã hóa cho protein
có áp lực chọn lọc thấp nên tính đa dạng tăng và có thể dựa vào các vùng này để xác
định loài thực vật. Các vùng này thường là các vùng gene rRNA, các gene ti thể, lục
lạp [33]. Các gene này có khoảng hơn 100 bản sao, nên các phương pháp sử dụng
chúng có tính nhạy cao và thuận tiện cho việc khuếch đại. Đây cũng là một thuận
l
ợi cho PCR các mẫu dược liệu [33].
1.2.2. Ứng dụng marker phân tử trong nghiên cứu cây họ Gừng
1.2.2.1. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây họ Gừng trên thế giới
Áp dụng phân tích DNA để khảo sát phân loại và nhận diện các cây họ Gừng đã
được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm. Phân tích RAPD được dùng
- 9 -

Tổng quan
nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền DNA trên Nghệ C. aerugeneosa Roxb ở Thái
Lan [32], trên cây Riềng nếp (Alpinia spp.) [29], trên chi Curcuma ở Bangladesh
[16], giữa các loài thuộc chi Boesenbergia [28]. Phân tích đa dạng di truyền loài
Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe ở Bangladesh bằng RAPD cho thấy các quần
thể này duy trì tính đa dạng cao, có sự khác biệt giữa các vùng trồng [16]. RAPD
marker cũng được dùng để nghiên cứu nhận định và khảo sát mối quan hệ di truyền
8 dòng Gừng ở Ấn Độ [39].
Bên cạ
nh RAPD, các nhà nghiên cứu Ấn Độ đã chứng minh trình tự vùng internal
transcribed spacer (ITS) của ribosome nhân và gene matK (các nucleotide vị trí giữa
115 đến 130, 680 đến 690 và 1455 đến 1465 của gene matK) thuộc gene trnK có thể
dùng làm mã vạch DNA (DNA barcoding) cho cây họ Gừng [11].
1.2.2.2. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây họ Gừng trong nước
Ở trong nước, các nghiên cứu về về họ Gừng đã được tiến hành từ rất lâu, chủ yếu
tập trung vào phân tích thành phần hóa học và khả
o sát một số tác dụng sinh học.

Nghiên cứu về tính đa dạng của họ Gừng cũng được tiến hành nhưng không nhiều.
Một số nghiên cứu tiêu biểu như: khảo sát mối quan hệ di truyền và hàm lượng
curcumin một số loài Nghệ từ các vùng khác nhau của Việt Nam [7], nghiên cứu
đặc điểm vi học, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của tinh dầu 3 cây
ngải sậy ở An Giang là Ng
ải sậy củ lớn, Ngải sậy củ nhỏ và Ngải sậy Campuchia
[6].
Qua các tài liệu thu thập được, có thể nói rằng nghiên cứu về nhận định loài, xây
dựng cây phát sinh loài, khảo sát tính đa dạng của các cây thuộc họ Gừng đã được
thực hiện rất nhiều trên thế giới. Thái Lan, một nước thuộc Đông Nam Á gần nước
ta, cũng đã có rất nhiều công bố về đa d
ạng di truyền họ Gừng ở mức độ phân tử.
Tuy nhiên, vấn đề này ở nước ta vẫn chưa được phát triển mạnh.
1.3. Nghiên cứu phát sinh loài họ Gừng
1.3.1. Trình tự DNA và phân loại thực vật
- 10 -

Tổng quan
1.3.1.1. Sơ lược về phân loại thực vật dựa vào trình tự DNA
Không giống như động vật, ngoài bộ gene nhân (nDNA) và ti thể (mtDNA), thực
vật còn có có một bộ gene bổ sung là bộ gene lạp lục (cpDNA). DNA nhân, lục lạp
và ti thể đều được sử dụng trong phân tích phát sinh loài. Tùy vào mức độ phân tích
mà mỗi vùng gene và mỗi phương pháp được áp dụng phù hợp. Do tính phức tạp và
lặp đi lặp lại, chỉ có một số gene thuộ
c nDNA như 18S, 26S, vùng ITS….được sử
dụng. Vùng 18S và vùng 5.8S thường được sử dụng để xác định ở mức bộ hoặc họ;
vùng 26S thường được dùng để xác định ở mức dưới họ cho đến loài; vùng ITS và
vùng 5S spacer thường được dùng để phân tích ở mức loài cho tới mức dưới loài
(Hình 1.1) [33].
Bộ gene ti thể phù hợp cho phân biệt ở mức loài vì chúng có đặc điểm là cấu trúc

kích thước, cấu hình, và trật tự gene thay đổi nhanh chóng. Gene
cytochrome b và
vùng control thường được sử dụng ở mức từ loài đến dưới loài. Trước đây chúng
thường được sử dụng ở mức loài và gần đây chúng thường được sử dụng hơn ở mức
dưới loài (Hình 1.1) [33].

Hình 1.1. Các vùng gene dùng trong phân tích phân loại thực vật ở các mức độ
khác nhau [33].
- 11 -

Tổng quan
DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA), là DNA sợi đôi, có chiều dài
trong khoảng 35 - 217 kb tùy loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài
khoảng 115 - 165 kb. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 – 10000 bản sao
cpDNA. Các gene thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3
nhóm như sau: Nhóm một là các gene mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang
hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ),
ATP synthase (atpA, atpB ), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA,
ndhB ); Nhóm hai là các gene mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 ), trnA (trnH,
trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gene tiểu phần ribosome (
rps2,
rps3 ); Và nhóm ba gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng)
và các gene mã hóa protein như matK, cemA [34].
Có rất nhiều gene cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S,
rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK …trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài.
Vùng 16S phù hợp ở mức bộ, trong khi rbcL, atpβ và ndhF phù hợp từ mức bộ đến
mức loài. Vùng intron trnL, spacer trnL-trnF và matK có thể áp d
ụng trong một
biên độ rộng từ bộ cho tới dưới loài. Trước đây chúng thường được sử dụng từ mức
họ cho tới mức loài; hiện nay chúng thường được sử dụng từ mức họ cho đến phụ

loài. Vùng atpβ-rbcL có thể được sử dụng từ mức chi đến mức dưới loài, nhưng
chúng cũng thường được sử dụng từ mứ
c chi đến mức phụ loài (Hình 1.1) [33].
Gene rbcL được sử dụng nhiều để dựng cây phát sinh loài ở các hạt. Tuy nhiên, đối
với mối quan hệ di truyền ở mức dưới loài thì sự phân tích trên gene này gặp nhiều
hạn chế. Vì vậy, việc cần phải tìm một vùng DNA khác tiến hóa nhanh hơn gene
rbcL để xây dựng cây phát sinh loài ở mức dưới loài và gene matK là một gene đầy
hứa hẹn cho mục tiêu này [14].
1.3.1.2. Vùng ITS
ITS (internal transcribed spacer) là một đo
ạn RNA không có chức năng, nằm giữa
các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã. Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1
- 12 -

Tổng quan
– 5.8S – ITS2 (Hình 1.2). Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt
và nhanh chóng phân hủy.

Hình 1.2. Sơ đồ vùng ITS [37].
Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối
với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá bảo tồn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát
sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành. Do đó các locus 5.8S có thể phục vụ như là
một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận
diện. Tiện ích của vùng bảo tồn như 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ s
ở dữ
liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [21].
1.3.1.3. Vùng gene matK
Gene matK (gene mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên bởi Sugita và
cộng sự (1985) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gene
trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509

codon nằm trong intron của gene trnK và dường như chưa rõ chức năng [14].
Đã có một số nghiên cứu sử d
ụng trình tự gene matK để xây dựng cây phát sinh loài
như: Saxifragaceae (Johnson và Soltis, 1994, 1995; Johnson et al., 1996),
Polemoniaceae (Steele và Vilgalys, 1994; Johnson và Soltis, 1995), Orchidaceae
(Jarrell và Clegg, 1995), Myrtaceae (Gadek et al. 1996), Poaceae (Liang và Hilu
1996), Apiaceae (Plunkett et al. 1996) và thực vật có hoa (Hilu và Liang, 1997).
Thông qua các phân tích chi tiết trên trình tự gene matK có trên GenBank và các
nghiên cứu sơ bộ (Liang và Hilu, 1996; Hilu và Liang, 1997), cho thấy gene matK
có tính đa dạng hơn những gene khác có trong lục lạp [14].
- 13 -

Tổng quan
1.3.1.4. Giới thiệu sơ lược về cây phát sinh loài (phylogeney)
Phylogeney xuất phát từ sự kết hợp hai từ gốc Hy Lạp. Phylo nghĩa là trực hệ
(tuyến tính của một dòng họ) và genesis tức là nguồn gốc – tạm dịch phylogeney là
sự phát sinh loài.
Trong ngành molecular phylogeney, người ta nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài
sinh vật thông qua các bằng chứng phân tử, cụ thể là trình tự DNA và protein. Như
vậy, sự phân kỳ di truyền được đánh giá thông qua s
ự khác biệt giữa các trình tự, là
kết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo tiến trình thời gian. Bằng cách sử dụng
công cụ máy tính, các chuỗi dữ liệu sẽ mô phỏng tiến trình tiến hóa và phân tích
tiến trình phát sinh loài.
1.3.1.5. Nghiên cứu phát sinh loài họ Gừng bằng trình tự ITS và matK
Trình tự ITS được sử dụng để tiến hành phân tích xây dựng cây phát sinh loài trên
Roscoea [26], xác định nhanh các đột biến trên Aframomum [13]; xây dựng cây phát
sinh loài trên tông Zingibereae dựa trên trình tự ITS (nrDNA) và trình tự trnL - F
(cpDNA) [27].
Năm 2001, Hui Cao và cộng đã sự nghiên cứu nhận định nguồn gốc dược liệu các

cây thuộc chi Nghệ được dùng làm thuốc ở Nhật dựa trên trình tự gene 18S rRNA
và trnK [15]. Dựa trên phân tích riêng biệt và kết hợp trình tự ITS và matK để xây
dựng cây phát sinh loài chi Amomum (Alpinioideae: Zingiberaceae) [44]; xây dựng
cây phát sinh loài, mối quan hệ tiến hóa và phân loại chi Globba và tông Lobbeae
[24], xây dựng cây phát sinh loài ở mức độ phân tử trên chi Alpinia [22], chi Gừng
[23], phân tích đa dạng di truyền và đị
nh danh chi Boesenbergia Thái Lan [18].
Paul S. Manos và Kelly P. Steele (1997) đã nghiên cứu xây dựng cây phát sinh loài
Hamamelididae dựa trên dữ liệu trình tự DNA lục lạp, cụ thể là trên gene matK. So
sánh việc phân tích trình tự của gene matK với các trình tự của gene rbcL đã được
công bố trước đây cho thấy rằng cây phát sinh loài tạo ra từ trình tự của matK có độ
phân giải tốt hơn và tính ổn định cao hơn [30].
- 14 -

Tổng quan
1.3.2. Định danh cây họ Gừng
Hình 1.3. Sơ đồ mô tả các phương pháp dùng để định danh thực vật ở mức loài [33].
Mã vạch DNA (DNA barcoding) là trình tự của một chuỗi DNA ngắn, có cùng
nguồn gốc tổ tiên (orthologous), được đề xuất và khởi xướng để tạo điều kiện
nghiên cứu đa dạng sinh học, xác định người chưa thành niên, giới tính liên kết,
phân tích pháp y [21], [22].
Tại hội nghị “The Second International Barcode of Life Conference” được t
ổ chức
tại Đài loan (16 - 21/12/2007), các nhà khoa học đã đưa ra các mã vạch DNA sử
dụng trên thực vật (Bảng 1.3 và Hình 1.4). Tuy nhiên các nhà khoa học vẫn chưa
thống nhất chọn vùng gene hay vùng spacer nào cho tất cả các loài thực vật.
Bảng 1.3. Các mã vạch DNA thực vật được đề nghị [12].
Nhóm nghiên cứu Gene Spacer
Kress và cộng sự
rbcL trnH-psbA

Chase và cộng sự
matK, rpoC1, rpoB
Chase và cộng sự
matK, rpoC1 trnH - psbA
Kim và cộng sự
matK, atpF/H trnH - psbA
Kim và cộng sự
matK, atpF/H psbK/I
Nhận định mẫu
các loài chưa biết
Phát hiện
các loài đích /
sự khác biệt của
các loài trong cùng chi
Phát hiện các loài
trong danh sách
các loài nghi ngờ
Mức loài
Giải trình tự các vùng
đặc hiệu cho loài
Lai vi bản trải
SCAR
/
ARMS
- 15 -

Tổng quan

Hình 1.4. Sơ đồ các mã vạch DNA được đề cử để xác định loài thực vật [10].
Như vậy có 7 vùng DNA plastid gồm spacer atpF - atpH , gene matK, gene rbcL,

gene rpoB, gene rpoC1, spacer psbK – psbI, và spacer trnH – psbA được chọn làm
ứng cử viên làm mã vạch DNA cho thực vật trên đất liền; trong đó, có bốn vùng là
các phần của gene mã hóa (gene matK, gene rbcL, gene rpoB và gene rpoC1), và
ba vùng đệm không mã hóa cho protein (atpF - atpH, trnH - psbA, và psbK - psbI).
Qua khảo sát đã chọn ra được 3 vùng plastid là: rbcL (dễ
sử dụng nhưng khó phân
biệt); matK (khả năng phân biệt và mã hóa cao hơn, gần với CO1, nhưng tính phổ
quát thấp) và trnH - psbA (có tính phổ quát, có khả năng phân biệt cao nhưng chiều
dài hay thay đổi [10].


- 16 -

Vật liệu và phương pháp
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Mẫu nghiên cứu
Các mẫu nghiên cứu gồm 25 mẫu ngải hiện có ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên,
tỉnh An Giang; trong đó có một số mẫu đã được Trung tâm Sâm và Dược liệu
Thành Phố Hồ Chí Minh thu thập, nhân giống; một số do công ty DOMESCO cung
cấp. Các mẫu này bao gồm củ tươi hoặc cây nguyên vẹn. Ngoài ra, chúng tôi sử
dụng 28 loài có trình tự ITS và/hoặc trnK – matK trên GenBank để phân tích; trong
đó có 25 loài thuộc nhóm trong và 3 loài thuộc nhóm ngoài (Bảng 2.1) (xem thêm
phụ lục A).
Bả
ng 2.1. Danh sách các mẫu vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu.
A. Các mẫu thực nghiệm
Stt Ký hiệu mẫu Nguồn cung cấp
1 N1 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
2 N2 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
3 N3 TT Sâm và Dược liệu TPHCM

4 N4 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
5 N5 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
6 N6 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
7 N7 Công ty DOMESCO
8 N8 Công ty DOMESCO
9 N9 Công ty DOMESCO
10 N10 Công ty DOMESCO
11 N11 Công ty DOMESCO
12 N12 Công ty DOMESCO
13 N13 Công ty DOMESCO
14 N18 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
15 N19 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
16 N20 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
- 17 -

Vật liệu và phương pháp
17 N21 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
18 N22 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
19 N23 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
20 N24 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
21 N25 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
22 N26 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
23 N27 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
24 N28 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang
25 N29 TT Sâm và Dược liệu TPHCM
B. Các mẫu có trình tự ITS và trnK - matK trên GenBank

Tên loài
Accession number
ITS matK

26
Aframomum libatum
JF848584
27 Aframomum sp. Kress 99-6368
AF478707 AF478807
28 Aframomum sp. Waimea W86S127 AF478708 AF478808
29 Alpinia elegans K. Schum. AF478713 AF478813
30 Alpinia galanga (L.) Willd AY424739
AF478815
31 Amomum yunnanense S. Q. Tong AY352012 AY352039
32 Boesenbergia aff. burttiana Sakai
378
AB097226
33
Boesenbergia rotunda
AF478726 AF478827
34 Curcuma amada Roxb. AY424752
35
Curcuma longa
AB557689 AB557670
36
Curcuma roscoeana
AF478739 AF478839
37
Curcumorpha longiflora
AF478743
38 Globba sp. Williams 00 334 AY339741 AY341104
39 Hedychium villosum AF478762 AF478861
40
Hitchenia glauca

AF478765 AF478864
- 18 -

Vật liệu và phương pháp
41
Kaempferia paviflora
AF478768 AF478869
42 Kaempferia rotunda L. AY424765 AF478868
43 Smithatris supraneanae W.J. Kress
& K. Larsen
AY424772 AF478896
44 Stahlianthus involucratus (Baker)
R. M. Sm.
AY424773 AF478897
45
Zingiber ellipticum
AF478799 AF478901
46 Zingiber fragile
DQ064581

47
Zingiber officinale
DQ064590 AB047756
48
Zingiber rezumbet
AF478803
49 Zingiber sp. Takano cult 21 (KYO) AB049291
50
Zingiber spectabile
AF414499

51
Siphonochilus decorus*
AY769810 AF478894
52
Siphonochilus aethiopicus*
AY769811 AF478893
53
Siphonochilus kirkii*
AF478794 AF478895
* nhóm ngoài
2.2. Thiết bị
- Tủ âm (-) 86
o
C Nuaire ILS-DF8517E
- Tủ âm (-) 20
o
C Sanaky VH-130
- Tủ lạnh
- Nồi hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Lò vi sóng
- Máy ổn nhiệt Wealtec HB-2
- Máy khuấy từ
- Máy đo pH Digimed DM-21
- Bộ thiết bị điện di ngang, gel agarose, Advance Mupid EXu
- Bộ thiết bị đọc gel Dolphin Doc (Wealtec)
- Máy PCR BioRad MyCycle
- 19 -

Vật liệu và phương pháp

- Máy đo quang phổ UV-VIS
- Micropipette và các loại đầu tip tương ứng từ hãng BIOHIT: 0.1 - 3µL,
2 - 20 µL, 10 - 100 µL, 20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, 1 - 10mL.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chiết tách và tinh sạch DNA
 Nguyên vật liệu
- Nitơ lỏng (Sovigaz)
- Tris - HCl: cân Tris - base ở nồng độ cần dùng, hòa tan trong 80% lượng
nước, thêm HCl, dùng máy đo pH để chỉnh dung dịch về pH 8,0; thêm nước
vừa đủ. Lưu ý nhiệt độ tăng 1
o
C thì pH giảm khoảng 0,03 đơn vị.
- EDTA 0,5 M pH 8: hòa tan Na
2
EDTA trong nước, điều chỉnh pH đến 8 bằng
NaOH, thêm nước vừa đủ 1 lít.
- Isopropanol.
- Nuclei l ysis buffer (N.L.B): 1,4 M NaCl; 0,1 M Tris - HCl (pH 8.0); 20 mM
EDTA; 2% PVP - 40; 1% 2 - mercaptoethanol.
- Extraction buffer (CTAB 2%, PVP 2%, NaCl 5M, Tris - HCl 1M, EDTA
0.5M)
- Chloroform : isoamylalcohol (24:1).
- Cồn tuyệt đối và cồn 70%.
- TE
0,1
(10 mM Tris - Cl, pH 7,4 và 0,1 mM EDTA) : phối hợp 0,5 mL Tris -
HCl 2 M; pH 7,4 và 20 ml EDTA 0,5 M (pH 8); thêm 99,48 mL nước. Tiệt
trùng bằng lò hấp, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- RNase 10 mg/mL: hòa tan 10 mg/mL RNase trong TE, đun sôi 10 phút để
diệt DNase. Chia thành các phần nhỏ và bảo quản -20

o
C.
 Tiến hành chiết DNA từ lá [16]
1. Cân lượng mẫu khoảng 100 mg.
2. Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng bằng bộ cối chày rồi cho vào tuýp 1,5 mL.
- 20 -

Vật liệu và phương pháp
3. Thêm 600 µL dung dịch đệm chiết N.L.B và 3 μL RNase, ủ 60
o
C trong 1
giờ, lắc tay định kỳ.
4. Thêm đồng lượng Chloroform : Isoamylalcohol, lắc mạnh trong 1 phút, sau
đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
5. Ly tâm 10000 vòng/phút, trong 10 phút, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sang
tuýp mới.
6. Thêm đồng lượng Chloroform : Isoamylalcohol, lắc mạnh trong 1 phút, sau
đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
7. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sang
tuýp mới.
8. Cho vào 2/3 thể tích isopropanol, lắc đều, ủ ở -20
o
C trong 1 giờ, sau đó ly
tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, rồi bỏ isopropanol lấy phần cắn.
9. Rửa cắn với 1 mL ethanol 70%, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút,
để khô cồn.
10. Hòa tan cắn trong 50 µL dung dịch bảo quản đệm TE
0,1
và bảo quản ở
-20

o
C.
 Tiến hành chiết DNA từ củ [1]
1. Cân lượng mẫu khoảng 100 mg
2. Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng bằng bộ cối chày rồi cho vào tuýp 1,5 mL.
3. Thêm 600 μL dịch EB, lắc liên tục trong đá khoảng trong 5 phút. Sau đó, ly
tâm 10000 vòng/phút, trong 10 phút, lấy phần cắn.
4. Tương tự từ bước 3 đến bước 10 như ở qui trình li trích DNA từ lá.
2.3.2. Kiểm tra dịch chiết DNA
-
Pha loãng dịch chiết DNA trong nước cất để đạt độ pha loãng 300 lần.
- Tiến hành đo quang ở 3 bước sóng: 230 nm (A
230
), 260 nm (A
260
), và 280 nm
(A
280
).
- Cách tính nồng độ DNA khi đo quang.
A
260
=1 tương ứng với 50 ng/µL.
- 21 -

Vật liệu và phương pháp
Nồng độ DNA (ng/µL) = Số đơn vị A
260
x 50 x độ pha loãng
Vậy: Nồng độ DNA (ng/µL) = A

260
x 15000
- Kiểm tra dịch chiết DNA bằng điện di trên gel agarose 1% và đọc kết quả
dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm.
DNA tinh sạch được bảo quản ở -20
0
C đến khi dùng.
2.3.3. Điện di
 Nguyên vật liệu
- Dung dịch đệm TAE 1X: pha từ dung dịch mẹ TAE 50X.
- Agarose tinh khiết dùng cho điện di (Merck).
- Dung dịch ethidium bromide 10 mg/mL.
- Dung dịch đệm nạp mẫu (loading buffer) 10X (Promega).
- Thang DNA chuẩn 1 Kb hoặc 100 bp (Promega).
 Tiến hành
- Đổ gel: cân agarose vào 60 mL đệm TAE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắc
đều và làm nguội đến 50
o
C, thêm ethidium bromide đạt nồng độ cuối là 1
μg/mL, trộn đều và đổ vào khuôn, gắn lược vào, để yên trong khoảng 30
phút cho thạch đông.
- Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TAE sao cho dung dịch đệm ngập
trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản thạch đặt về phía cực âm.
- Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải 10X, nạp mẫu vào
các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn.
- Chạy ở
dòng điện 100 Volt, 30 - 60 phút.
- Quan sát các băng DNA trên hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm.
2.3.4.
PCR-RAPD các mẫu ngải

 Nguyên vật liệu
25 mẫu ngải