Nghiên cứu phương pháp tiền xử lý Lignocellulose trong sinh khối cỏ VA06 (Varisme 6) làm nguyên liệu sản xuất cồn sinh học

vv
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



ĐOÀN VĂN THU



NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TIỀN XỬ LÝ
LIGNOCELLULOSE TRONG SINH KHỐI
CỎ VA06 (Varisme 6) LÀM NGUYÊN
LIỆU SẢN XUẤT CỒN SINH HỌC




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGHÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 60 42 30



Người hướng dẫn khoa học: TS. BÙI MINH TRÍ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012









LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên con xin gửi tới Bố Mẹ lòng biết ơn sâu sắc nhất. Bố Mẹ đã sinh
thành ra con và luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con phấn đấu trong cuộc
sống này. Dù con có thế nào thì Bố Mẹ luôn là nơi bình yên và che chở cho con.
Em xin cảm ơn Thầy Bùi Minh Trí, Thầy là người đã cho em ước mơ và sự tin
tưởng, sẽ không có từ ngữ nào để nói hết lòng biết ơn củ
a em đối với Thầy. Em luôn
chúc cho Thầy và gia đình mạnh khỏe và thành công.
Xin cảm ơn tất cả các Thầy, Cô đã từng dạy em, cho em những kiến thức để
ngày hôm nay em vững bước trên đường đời.
Cảm ơn các anh, chị, và các em sinh viên ngành Công nghệ sinh học trong
Viện công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nông Lâm TPHCM đã giúp
đỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi làm đề tài.
Cảm ơn các anh chị thuộc phòng kỹ thuật c
ủa Đại học Chung Nam – Hàn
Quốc đã giúp đỡ tôi thực hiện chụp hình kính hiển vi điện tử.
Xin cảm ơn cuộc sống và những người thân yêu trong mái ấm nhỏ đã luôn
cùng nhau vượt qua mọi khó khăn.

Xin chân thành cảm ơn!

Đoàn Văn Thu

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC BẢNG ix
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii
Chương 1: Mở đầu 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1
.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Yêu cầu 2
1.3. Thời gian và địa điểm thực hiện 2
Chương 2: Tổng quan tài liệu 3
2.1. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học 3
2.1.1. Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH) 3
2.1.2. Vai trò sinh khối trong sản xuất NLSH 4
2.2. Tổng quan về cây cỏ ở Việt Nam 6

2.2.1. Thành phần của các cây thân cỏ. 6
2.2.1.1. Thành phần cấu tạo cellulose . 8
2.2.1.2. Thành phần cấu tạo hemicellulose 11
2.2.1.3. Thành phần cấu tạo lignin 14
2.2.1.4. Các chất trích ly 17
2.2.1.5. Tro 18

2.2.2. Sự thủy phân cellulose 19
2.2.2.1. Cấu trúc enzyme cellulase 19
2.2.2.2. Cơ chế hoạt động 20
2.2.3. Sự phong phú của cây cỏ Việt Nam 19
2.3. Tổng quan về quá trình tiền xử lý trên thế giới và trong nướ
c 23
2.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới 23
2.3.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam 30
ii

2.3.3. Quá trình tiền xử lý thực hiện trong quá trình nghiên cứu 31
Chương 3. Vật liệu và phương pháp. 32
3.1 Vật liệu 32
3.2. Trang thiết bị và dụng cụ 33
3.3. Hóa chất và các vật tư tiêu hao 34
3.4. Địa điểm thực hiện 35
3.5. Trình tự tiến hành 35
3.5.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng Cellulose trong một số loại cỏ 36
3.5.2. Thí nghiệm 2: Kh
ảo sự tác động của vi sóng và một số hóa chất kết
hợp lên hàm lượng lignin và cellulose trong cỏ VA06 42
3.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng đường glucose tạo thành từ
nguyên liệu đã qua tiền xử lý thủy phân bằng enzyme cellulase 46
3.5.4. Thí nghiệm 4: Phân lập các chủng nấm mốc có khả năng phân hủy
cellulose, tiến hành nuôi cấy canh trường thu cellulase và kiểm tra khả năng
thủy phân của enzyme trên cơ chất đã qua tiền xử lý 47
3.5.5 Xử lý s
ố liệu 49
Chương 4:Kết quả và biện luận 50
4.1. Hàm lượng các thành phần chính có trong chất khô một số loại cỏ. 50

4.2. Ảnh hưởng của vi sóng và một số hóa chất lên hàm lượng lignin và
cellulose trong cỏ VA06. 53
4.2.1. Ảnh hưởng của vi sóng lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc
lignocellulose 54
4.2.2 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp của vi sóng và NaCl lên kh
ả năng
loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 55
4.2.3. Ảnh hưởng của dung dịch NH
4
OHvới nhiệt độ khác nhaulên khả
năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 58
4.2.4. Ảnh hưởng của dung dịch H
2
O
2
lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu
trúc lignocellulose 60
iii

4.2.5. Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NH
4
OH và H
2
O
2
lên khả
năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 61
4.2.6. Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và NH
3
lên

khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 63
4.2.7. Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và H
2
O
2
lên
khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 64
4.2.8. Quy trình tối ưu 65
4.3. Hàm lượng đường glucose tạo thành từ nguyên liệu đã qua tiền xử lý
thủy phân bằng enzyme cellulase. 66
4.4. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính cellulase cao và tiến hành canh
trường thu enzyme cellulase và kiểm tra khả năng thủy phân của enzyme
trên cơ chất đã qua tiền xử lý. 68
Chương 5: Kết luận và kiến nghị 72

5.1. Kết luận: 72
5.2. Kiến nghị: 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
Phụ lục 78




1

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên.Trong hàng
ngàn năm lịch sử nhân loại, cellulose được xem như một vật liệu không thể thiếu

cho quần áo, nhà ở, và còn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự hình thành nền
văn hóa của con người
[15]
. Cellulose được hình thành bởi các liên kết 1-4 glucoside
giữa các đơn phân là glucose. Trong tự nhiên cellulose là thành phần vô cùng quan
trọng trong cấu trúc của thực vật. Cellulose không đứng một mình riêng lẻ mà được
bao bọc và liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như lignin và hemicellulose
tạo thành cấu trúc vững chắc lignocellulose
[19]
.Việc loại bỏ lignin nhằm thu hồi
cellulose là công việc được quan tâm trên toàn thế giới. Đặc biệt khi các vấn đề về
“an ninh năng lượng”, môi trường sống thay đổi… trở thành vấn đề cấp thiết mang
tính chất toàn cầu, thì việc thu hồi được cellulose và hemicellulose từ các phế phẩm
nông nghiệp, các loài cỏ dại… như là một giải pháp “ nhất cử lưỡng tiện” được ưu
tiên hàng đầu.
Việt Nam là quốc gia nông nghi
ệp, được thiên nhiên ưu đãi, đất đai màu mỡ
nên ngoài các phụ phẩm nông nghiệp còn là nơi tập trung tới 12.000 loài cây cỏ
[2]
.
Đây là một thuận lợi vô cùng lớn về nguồn nguyên liệu chứa cellulose. Nhưng
nguồn cellulose này hiện nay ở nước ta vẫn chưa được sử dụng một cách hữu hiệu
nhất. Nếu có một phương pháp tốt để thu hồi, lượng cellulose này sẽ đem lại những
lợi ích vô cùng lớn cả về mặt kinh tế lẫn môi trường.
Chính vì những lý do trên,
dưới sự hướng dẫn của TS.Bùi Minh Trí
tôi thực
hiện đề tài:
“
Nghiên cứu phương pháp loại bỏ lignin trong sinh khối cây thân cỏ

nhằm thu hồi cellulose làm nguyên liệu trong sản xuất cồn sinh học
”.
1
.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu

- Đánh giá được thành phần cơ bản và tiềm năng sử dụng sinh khối của một
số loại cỏ thu nhận được.
2

- Xây dựng kỹ thuật tiền xử lý tối ưu đối với giống cỏ điển hình nhằm thu
hồi được lượng cellulose cao nhất có thể làm nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa
tạo cồn sinh học.
- Phân lập, tuyển chọn những chủng nấm có khả năng phân hủy cellulose.
Tiến hành canh trường thu enzyme cellulose.

1.2.2. Yêu cầu
- Xác định hàm lượng cellulose trong mẫu trước và sau quá trình tiền xử lý.
- Xác định biện pháp tiền xử lý loại bỏ lignin tối ưu.
- Nắm vững các kỹ thuật phân lập, tuyển chọn và canh trường thu enzyme.
1.3.Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện tại: Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi
trường
– Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
từ tháng 11/2010 đến tháng 1 năm
2012.



3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học.
2.1.1. Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH).
Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, được sản xuất từ nguyên liệu động
thực vật gọi là sinh khối. Gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bản carbon (C) nằm trong
chu trình lục hoá ngắn hạn, xả thải khí CO
2
, rồi thực vật hấp thụ lại CO
2
đó để tạo
thành sinh khối. Chế biến nhiên liệu sinh học trên lý thuyết coi như không làm gia
tăng CO
2
trong khí quyển
[31]
. Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi
(than đá thuộc loại cổ sinh, không tái tạo), thể lỏng như xăng sinh học, diesel sinh
học, hay thể khí như khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải).
Nhiên liệu ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều
năng lượng, dễ dàng chuyên chở, dễ tồn tr
ữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe.

Hình 2.1.Chu trình carbon trong nhiên liệu sinh học
4

2.1.2. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học.
Hiện nay, nhân loại đang phải đối mặt với một cuộc khủng hoảng về năng

lượng khi các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn kiệt và gây ô nhiễm môi
trường nghiêm trọng. Giải pháp mà con người tìm đến để khắc phục những vấn đề
đó chính là các nguồn năng lượng mới như năng lượng gió, mặt trời, sinh khối…
Khác với các nguồn năng lượng tái tạo khác, năng lượng sinh khối không chỉ thay
thế năng lượng hoá thạch mà còn góp phần xử lý ô nhiễm môi trường. Vì vậy, năng
lượng sinh khối thường được gắn liền với nền kinh tế carbon thấp hay nền kinh tế
hydro, bảo vệ môi trường sinh thái, phát triển nông nghiệp, xóa đói, giảm nghèo,
làm cho trái đất xanh hơn, sạch hơn. Nhiên liệu sinh học không giống như các
nguồn năng lượng tái sinh khác, NLSH có thể ở dạng lỏng dùng cho các phương
tiện vận tải (ô tô, xe máy, máy bay, tàu hoả). Có hai dạng nhiên liệu sinh học phổ
biến nhất là ethanol và diesel sinh học.
Theo Bộ năng lượng Hoa Kỳ, sản lượng nhiên liệu sinh học tối đa theo lý
thuyết, tính toán dựa trên hàm lượng carbon có trong phân tử của đường (trong
nguyên liệu) và hàm lượng carbon có trong phân tử của ethanol. Theo phản ứng
sinh hoá như sau:
C
6
H
12
O
6
→ 2 C
2
H
5
OH + 2 CO
2

Bảng 2.1. Sản lượng ethanol tính theo lý thuyết từ các nguồn
nguyên liệu khô

[33]
Nguyên liệu Sản lượng ethanol/ 1 tấn nguyên liệu khô
Hạt bắp ngô 124,4 gallon (470,854 lít)
Thân và lá bắp ngô 113,0 gallon (427,705 lít)
Rơm rạ 109,9 gallon (415,971 lít)
Phế phẩm của bông sợi 56,8 gallon (214, 988 lít)
Phế phẩm lâm nghiệp 81,5 gallon (308,477 lít)
Mạt cưa 100,8 gallon (381,528 lít)
Bã mía 111,5 gallon (422,027 lít)
Giấy vụn 116,2 gallon (439,817 lít)
5

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp, nên phế phụ phẩm từ nông nghiệp (
rơm, rạ, trấu…) là rất dồi dào. Bên cạnh đó, Việt Nam còn là nơi tập trung hơn
12.000 loài cỏ dại, trong số đó có những loài cỏ du nhập vào nước ta có sinh khối
lớn. Đó sẽ là thuận lợi lớn về nguồn nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học.
Bảng 2.2. Tiềm năng nhiên liệu sinh học t
ại Việt Nam
Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng
Nguồn sinh khối Tiềm năng (triệu
tấn)
Dầu tương đương
(triệu tấn)
Tỷ lệ (%)
Rơm rạ
32,52 7,30 60,4
Trấu
6,50 2,16 17,9
Bã mía
4,45 0,82 6,8

Các loại khác
9,00 1,80 14,9
TỔNG
53,43 12,08 100,0
Giải pháp NLSH đã được nước ta quan tâm và chú trọng từ năm 2007, việc
sử dụng nguồn nguyên liệu từ nông sản như gạo, sắn, ngô để sản xuất NLSH đã
mang lại nhiều chuyển biến tích cực nhưng những vấn đề mới cũng đã nảy sinh như
diện tích đất canh tác, an ninh lương thực…Diện tích đất canh tác của nước ta ít (
khoảng 9.3 triệu ha), dân đông (88 triệu năm 2011, trung bình m
ỗi đầu người 0.107
ha), lại nghèo (GDP trung bình toàn dân là 1197usd /đầu người năm 2011, của nông
dân chỉ khoảng 1/2), vùng sản xuất nông nghiệp chính là đồng bằng Sông Cửu Long
và Sông Hồng đã quá tải. Đất canh tác hiện nay phải tiếp tục sản xuất nông phẩm
thiết yếu cho đời sống người dân (chủ yếu là lúa, hoa màu phụ, cây kỹ nghệ) để tự
túc và xuất khẩu
[30] [33]
.
¾ Vì vậy Việt Nam phải tìm nguồn nguyên liệu thực vật nào để sản xuất
NLSH mà:
6

- Không tranh giành đất đai với canh tác hoa màu, chăn nuôi gia súc, nuôi cá
tôm.
- Không ảnh hưởng tới diện tích rừng.
- Thích hợp trên diện tích đất bỏ hoang cằn cỗi, sa mạc hoá, tổng cộng khoảng
10 triệu ha, gồm đất đồi trọc ở Miền Bắc (4.77 triệu ha), Bắc Trung Bộ (1.9 triệu
ha), phía Nam Trung Bộ (1.63 triệu ha), và Tây nguyên (1.05 triệu ha)
[33]
.
- Có hiệu quả kinh tế cao, giúp xoá đói giảm nghèo cho nông dân.

¾ Việc tập trung nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu theo giai đoan hai ( sử
dụng sinh khối biomass) là một giải pháp đáp ứng và phù hợp nước ta và xu hướng
thế giới.
2.2. Tổng quan về cây thân cỏ ở Việt Nam.
2.2.1. Thành phần của các cây thân cỏ.

Cây thân cỏ thuộc lọai thực vật phi gỗ, cấu tạo chúng bao gồm các thành phần
chính như: Cellulose chiếm 20-50%, hemicellulose khoảng 20 – 30%, lignin chiếm
khoảng 10-30%, còn lại là thành phần các chất trích ly và khoáng
[19]
. Các thành phần
này không nằm riêng rẽ mà chúng liên kết với nhau tạo thành phức hợp được gọi là
lignocellulose bền vững, giúp chúng chống lại các tác nhân phá hủy ngoài môi trường.
Điều này đã gây ra cản trở chính trong việc chuyển hóa sinh khối của chúng thành
nhiên liệu sinh học mà bước đầu tạo thành các đường.
Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên
nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc sử dụng nguồn phế
liệu
lignocellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu
[10]
.
Lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin, chất trích ly, và một số
chất vô cơ.
Theo Hetti Palonen, về cơ bản trong cấu trúc phân tử của lignocellulose,
cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo
mạng lưới như hemicellulose và chất kết dính như lignin. Cellulose,
hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và hình thành liên kết cộng hóa trị
với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-
7

methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin
[18]
.
Bảng 2.3. Các thành phần chính trong một số nguyên liệu giàu cellulose
[19]

Tên Cellulose Hemicellulose Lignin Tro Chất
trích ly
Cỏ 25-40 25-50 - - -
Gỗ cứng 45 ±2 30±5 20±4 0.6±0.2 5±3
Gỗ mềm 42 ±2 27±2 28±3 0.5±0.1 3±2
Bông 80-95 5-20 - - -
Cây ngô 39-47 26-31 12-16 3-5 1-3



Hình 2.2. Cấu trúc của lingocellulose
[27]
Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với
nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các
vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi
sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân
[18]
.

8



Hình 2.3: Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc

lignocellulose
[Somerville C]
Ngày nay, khoa học kỹ thuật phát triển đã cho phép chúng ta có được nhiều
hơn những ứng dụng từ holocellulose, bên cạnh những sản phẩm từ cellulose thì
những ứng dụng từ hemicellulose cũng có ý nghĩa rất quan trọng, vd: từ
hemicellulose qua thủy phân thu đường xylose qua chế biến tạo thành xylitol một
chất giúp phục hồi và bảo vệ men răng
[10]
.
2.2.1.1. Thành phần cấu tạo cellulose.
Cellulose là một polysaccharide bao gồm một chuỗi của vài trăm đến hơn
10.000 đơn vị D-glucose mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc
từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside. Cellulose
cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có
cấu trúc không đồng nhất. Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phầ
n xốp hơn
gọi là phần vô định hình
[12]
. Kiểu liên kết này khác mối liên kết α-1,4 glucose của
tinh bột, chẳng hạn như tinh bột ngô từ hạt ngô
[27]
.
Sự khác biệt về cấu trúc được chứng minh là khá đáng kể. Chuỗi Cellulose là
chuỗi thẳng và có phần cứng nhắc, nhưng tinh bột có cấu trúc chuỗi cuộn. Điều đó
làm cho các chuỗi cellulose hình thành các liên kết hydro rất nhiều, không giống
như tinh bột, các chuỗi cellulose ráp thành bó cablelike, sợi tinh thể có độ bền cao
9

và có khả năng kháng thủy phân thành glucose.
Các nhóm OH ở hai đầu mạch có

tính chất
hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C
1
có tính khử, trong khi
đó OH tại C
4
có tính chất của rượu
[18]
.


Đầu không khử Đầu khử
Hình 2.4. Cấu trúc hóa học của cellulose
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000 - 2.500.000 Dalton. Các
phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vanderwar và liên kết hydro.
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi
sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường
không đồng nhất, chúng tồn tại thành hai vùng, vùng k
ết tinh và vô định hình. Có
hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định
hình
[4]
.

Hình 2.5. Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain
10

- Vùng kết tinh (Fringed Fibrillar): phân tử cellulose được kéo thẳng và
định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với
vùng vô định hình. Các sợi cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ

liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở
mạch carbon của sợi cellulose bên cạnh. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác
động bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợ
i của vùng này.

Hình 2.6. Các kiểu liên kết trong vùng kết tinh và vô định hình
[14]

- Vùng vô định hình (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều
sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b
như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch
glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là
vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định
hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại
cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180
0
cho toàn mạch.
Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể
vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm
độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết
hydro
[4]
.
Chiều dài vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài
của vùng kết tinh. Các cây gỗ lớn lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh
nhiều, ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều vùng cellulose vô định hình
[18]
.
Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại tự do, hydrogen của
Kết tinh Vô định hình

11

chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như melyl hoặc acetyl tạo nên các dẫn
suất ete hoặc este của cellulose.
Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật có chứa cellulose bị chết,
cellulose của chúng bị phân hủy bởi một tập đoàn vi sinh vật. Các loại vi sinh vật sẽ
thay nhau phân hủy cellulose để tạo mùn và từ đó các thành phần cấu tạo cellulose
lại đi vào con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên.
2.2.1.2. Thành ph
ần cấu tạo hemicellulose.
Hemicellulose cũng là một polysaccharide, nhưng nó thường tạo ra các chuỗi
xylose xen kẽ với chuỗi bên có chứa arabinose, galactose, glucose, mannose, acetyl,
và các nhóm đường khác, tùy thuộc vào loại thực vật. Hemicellulose chứa 500 đến
3.000 đơn vị đường và bao gồm một lượng nhỏ pectin, một số polysaccharide khác.
Thành phần cơ bản của hemicellulose là các D xylopyranose, liên kết với nhau
bằng liên kết β-(1,4)
[12]
. Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào
nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm
[27]
:
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4).
- Xylose là thành phần quan trọng nhất.
- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl -O liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide
hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và
với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên
tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ
bị thủy phân.

Hình 2.7. Cấu trúc của hemicellulose
12


Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác
nhau.

 Gỗ mềm
[12]
:
Hemicellulose trong gỗ cây lá kim là galactoglucomannan, glucomannan và
các arabinoglucuronoxylan. Còn trong các cây gỗ mềm khác là glucan
arabinogalactan, xyloglucan và các glucan khác.
- Galactoglucomannan là hemicellulose chủ yếu trong các loại gỗ mềm, mạch
chính của nó là một chuỗi tuyến tính hoặc phân nhánh bởi D-mannopyranose và D-
glucopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4. Phần dư D-Galactopyranose
được liên kết như chuỗi bên một bởi liên kết α 1-6. Galactoglucomannan có thể
được tạm chia thành hai loại: loại chứa nồng độ galactose thấp - đôi khi được gọi
đơn giản nh
ư glucomannan và loại chứa galactose cao. Tỷ lệ của galactose, glucose
và mannose là 0.1-0.2:1:3-4 và 1:01:03 trong hai loại tương ứng. Các nhóm
hydroxyl ở vị trí C2 và C3 trong mạch chính có một phần thay thế bởi nhóm O-
acetyl, một nhóm trung bình có 3-4 đơn vị hexose
[12]
.

Hình 2.8. Galactoglucomannan
- Arabinoglucuronoxylan (gọi tắt là xylan), cấu tạo từ các D-xylopyranose
liên kết với nhau bằng liên kết β –(1,4), các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid
4-O-methyl-glucuronic trung bình từ 5-6 đơn vị xylose, ở vị trí 3 bằng α- L-

arabinofuranose trung bình 5-12 đơn vị xylose
[12]
.
13


Hình 2.9. Xylan
- Arabinogalactan chủ yếu được biết đến như một thành phần lõi của gỗ.
arabinogalactan có một mạch chính gồm các D-galactopyranose liên kết với nhau
bằng liên kết β –(1,3) và các mạch nhánh là các liên kết β –(1,6) giữa D-galactose,
D-galactose, L-arabinose , hoặc L-arabinose với nhau. Arabinose hiện diện trong
furanose và pyranose với tỷ lệ xấp xỉ 1:02
[12]
.

Hình 2.10. Arabinogalactan
 Gỗ cứng:
Hemicellulose chính trong gỗ cứng là xylan cụ thể hơn là O-acetyl-4-O-
methylglucurono-β-D-xylan. Giống như xylan của gỗ mềm, mạch chính là các liên
kết β (1-4)-xylopyranose. Hầu hết các nhóm hydroxyl ở C2 và / hoặc C3 của các
đơn vị xylose được thay thế bằng nhóm acetyl. Ngoài ra, các đơn vị xylose được
thay thế bằng liên kết β - (1 2) liên kết với phần dư của axit 4-O-methylglucuronic,
trong hầu hết xylan của gỗ cứng trung bình tại xylose th
ứ 10. Không giống như
xylan gỗ mềm, xylan gỗ cứng không chứa chuỗi bên arabinose. Gỗ cứng cũng chứa
glucomannan với mạch chính là liên kết β-(1-4) giữa D-mannopyranose và D-
glucopyranose. Tỷ lệ của mannose và glucose là 1:1 và 2.3:1
[12]
.
- Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính

gồm β-D- xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4). Trong đó 70%
các nhóm
OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết
với acid 4-
O-methyl-D-glucuronic
[12]
.
14


Hình 2.11. Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan

Hình 2.12. Glucomannan
 Thực vật phi gỗ:
Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này
cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C
2
bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic.
OH ở vị trí C
3
sẽ
tạo mạch nhánh với
α
-L-arabinofuranose
[12]
.

Hình 2.13: Arabinoglucuronoxylan
Cấu tạo phức tạp của hemicellolose tạo nên nhiều tính chất hóa sinh và lý
sinh cho cây.

2.2.1.3. Thành phần cấu tạo lignin.
Lignin là một thuật ngữ chung cho một tổ hợp gồm các nhóm lớn polymer
thơm được cấu tạo từ tổ hợp của 4 – hydroxyphenylpropanoid. Các thành phần
chính của lignin là các các rượu hydroxycinnamyl alcohol ( monolignol) như
coniferyl alcohol, sinapyl alcohol, và một lượng nhỏ p-coumaryl alcohol.
Monolignol được tổng hợp từ Phe qua con đường cụ thể phenylpropanoid -
monolignol. Phe có nguồ
n gốc từ con đường sinh tổng hợp shikimate plastid.
15

Enzym của con đường sinh tổng hợp lignin, cụ thể là các enzyme cytochrome P450,
cinnamate-4-hydroxylase (C4H), p-coumarate-3-hydroxylase (C3H), và ferulate-5-
hydroxylase (F5H), protein màng tế bào được cho là hoạt động tại các cytosolic bên
của lưới nội chất
[24]
.
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu
đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với
mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn
[18]
.

Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin
Các đơn vị monolignol, khi được trùng hợp tạo thành các polymer lignin,
được gọi là guaiacyl (G), syringyl (S), và p-hydroxyphenyl (H). Lignin của thực vật
hạt trần gồm chủ yếu là loại G và một lượng nhỏ loại H, trong khi thực vật hạt kín
lignin được bao gồm loại G và S. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng guaiacyl lignin
hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu
đó sẽ khó bị tấn công
bởi enzyme hơn syringyl lignin

[24]
.

Hình 2.15. Phản ứng trùng hợp tạo lignin
Qúa trình trùng hợp lignin ban đầu thông qua oxy hóa của phenol, tiếp theo là
hình thành các liên kết căn bản. Trong bước đầu tiên, phenol monolignol bị oxy hóa
tạo thành các phenolic tương đối ổn định chứa các electron lẻ trong hệ thống liên
16

hợp. Sau đó, hai gốc monomer tự do bắt cặp với nhau để tạo thành 1 dimer
(dehydro), do đó thiết lập một liên kết cộng hóa trị giữa hai tiểu đơn vị. Gốc
monolignol ưu tiên hình thành liên kết tại các vị trí β của nó, kết quả tạo thành các
liên kết β - β, β - O -4, và β -5 dimer. Sau đó, dimer này được dehydrogen một lần
nữa để một tạo ra phenolic, trước khi nó có thể bắt cặp v
ới một monomer khác, cứ
như vậy tạo thành các polymer. Các liên kết có gốc tự do căn bản này xảy ra trong
tổ hợp hóa học, do đó, tỷ lệ của mỗi kiểu liên kết có thể phụ thuộc phần lớn vào tính
chất hóa học của các monome và các điều kiện trong thành tế bào. Chiều dài trung
bình của một chuỗi lignin tuyến tính trong cây dương được ước tính là từ 13 đến 20
đơn vị
[25]
.
Trong thực vật, lignin liên kết với holocellulose thông qua liên kết hóa học
lignin - carbonhydrate. Có các kiểu liên kết sau.
- Kiểu liên kết benzyl ether: liên kết hình thành giữa nhóm α-hydroxyl của một
đơn vị lignin và một nhóm hydroxyl carbohydrate.
- Kiểu liên kết ester benzyl: liên kết được hình thành giữa nhóm α-hydroxyl
của một đơn vị lignin và gốc axit của cacboxylic carbohydrate.
- Kiểu liên kết glycoside: liên kết được hình thành giữa axit béo hoặc nhóm
hydroxyl thơm với nhóm cuối cùng của carbohydrate.

- Kiểu liên kết acetal: liên kết được hình thành giữa hai nhóm hydroxyl của
carbohydrates và một nhóm cacbonyl của lignin.


Hình 2.16. Các dạng liên kết giữa lignin với carbonhydrate
[25]
17


Trong quá trình nghiên cứu để xác định hàm lượng lignin trong các loại cây
thân cỏ người ta dùng phương pháp phân tích klason lignin.
2.2.1.4. Các chất trích ly.
Các chất trích ly là những chất hoặc có khả năng hòa tan trong những dung
môi hữu cơ (như diethyl ether, methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa,
diclormethene, acetone, ethanol, methanol, hexan, toluen, terahydrofuran) hoặc
tan trong nước. Vì vậy ta có thể dùng các loại dung môi này để tách các chất trích
ly trong việc phân tích thành phần sơ sợi lignocellulose. Những chất này có thể có
cả tính ưa dầu và ưa nước và không được xem là thành phần cấu trúc của g
ỗ
[1]
.
Chất nhựa là những chất ưa dầu, có lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong tác
nhân trích ly, nên thường chất trích ly còn được gọi là nhựa (resin).
Các chất trích ly thường có màu, mùi và vị khá đặc trưng. Chúng rất quan
trọng để
giữ lại những chức năng sinh học của cây. Đa phần các chất nhựa bảo vệ
gỗ khỏi những
tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay côn trùng. Terpenoid,
steroid, ch
ất béo, và những phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và

flavonoid đều là những chất trích ly. Các phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh
hưởng đến màu của gỗ. Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận
dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là
nhựa dầu
[6]
. Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và côn trùng. Một
số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng. Ví dụ, flavonoid được sử dụng
như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus. Một số cấu trúc chất trích ly
được thể hiện ở những hình sau :

Hình 2.17 : Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin) ; (b)
cathechin(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)
18

2.2.1.5. Thành phần tro.
Một phần đáng kể của các sinh khối thân thảo bao gồm các thành phần vô cơ,
thường được gọi là tro. Tro có nguồn gốc từ sinh khối và có tác động tiêu cực trên
các hệ thống chuyển đổi sinh khối. Đặc biệt trong hệ thống chuyển đổi sinh hóa
(chẳng hạn như sản xuất ethanol), nơi mà việc sử dụng các hoá chất vô cơ trong quá
trình tiền xử lý thì tro thêm vào tổng số dư lượ
ng vô cơ không chuyển đổi trong hệ
thống chuyển đổi. Tro bao gồm các thành phần chủ yếu
[27]
:
Kali cần thiết cho sự tăng trưởng thực vật, kali thường chiếm 1-5% trọng
lượng vật chất khô, tùy thuộc vào loài, trong khi nồng độ kali trong cây trưởng
thành thường không vượt quá 2% chất khô. Kali tham gia trong một số lượng lớn
các quy trình cần thiết cho sự phát triển của thực vật, bao gồm kích hoạt enzyme,
tổng hợp protein, quang hợp, quy định áp suất thẩm thấu, giao thông mạch dẫn, và
sự cân bằng cation-anion

[27]
.
Canxi chiếm 0,1 và 5,0% trọng lượng khô tùy thuộc vào điều kiện phát
triển, các loài cây trồng, các bộ phận. Giống như kali, canxi là một chất dinh dưỡng
có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình thiết yếu bao gồm ổn định thành tế bào,
quá trình bài tiết, ổn định màng tế bào và các quy định của áp suất thẩm thấu.
Lưu huỳnh được kết hợp thành những cấu trúc hữu cơ, bao gồm các axit
amin, protein và enzyme và các dạng tồn tại dưới các hình th
ức của sulfat, SO
4
2-
.
Yêu cầu lưu huỳnh cho sự tăng trưởng thực vật tối ưu thay đổi từ 0,1 đến 0,5%
trọng lượng thực vật khô, và khác nhau giữa các loài thực vật
[27]
.
Clo là một yếu tố tự nhiên phong phú và
tồn tại trong các hình thức của ion
clorua.Clo đóng một vai trò thiết yếu trong một số quy trình, bao gồm cả việc mở và
đóng của khí khổng.Tương tự như kali, clorua có tính cơ động cao trong
thực vật,
và
hàm lượng clo trung bình từ 0,2 - 2,0% trọng lượng thực vật khô
[27]
.
Ở thực vật C3 thì hàm lượng tro cao hơn thực vật C4 do đó cần nhiều nước
hơn trong việc tổng hợp một gam chất khô và hàm lượng tro cũng khác nhau ở các
bộ phận của cây.

19

2.2.2. Sự thủy phân cellulose.
Theo con đường sinh học Cellulose được thủy phân bằng enzyme cellulase.
2.2.2.1. Cấu trúc enzyme cellulase.
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở
dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành
hệ enzym gọi là Citolase. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1,
Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose
tạo thành glucose
[17]
.
+ Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên
thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).
+ Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thuỷ phân cellulose phản ứng
thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại
[37]
:
Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân
liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên khoảng giữa mạch phân tử cellulose.
Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ
khá cao.

Hình 2.18. Các phần của enzyme cellulase
[37]

20

Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose ở các đầu chuỗi. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:
* CBHI

có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit
amin.
Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh
thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC.
* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin.
CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên
cellulose biến tính .
+

β-glucosidase hay cellobiase
(EC.3.2.1.21):
Thủy phân cellobiose thành
glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4
đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
2.2.2.2. Cơ chế hoạt động
[3]
.

Hình 2.19: Cơ chế tác động của enzym cellulase