Xử lý rơm rạ bằng sợi tơ nấm rơm volvariella volvacea và đánh giá khả năng tạo bioethanol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN THỊ HIỀN




XỬ LÝ RƠM RẠ BẰNG SỢI TƠ NẤM RƠM
VOLVARIELLA VOLVACEA VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG TẠO BIOETHANOL



Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã Số: 604240



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

TP. HCM, Năm 2011
ĐH Quốc gia ĐH Khoa họa tự nhiên TP.HCM
i
Lời cảm ơn

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quốc Khánh, phòng
Vi sinh ứng dụng, Viện sinh học nhiệt đới đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí
nghiệm, chỉnh sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị
nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị
Đào Thị Thu Hiền cùng tập thể phòng vi sinh,
Viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi cũng không bao giờ quên sự tận tình dạy bảo, động viên của các thầy cô
Khoa Sinh học, phòng Sau đại học, trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ
Chí Minh tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn bè đã giúp đỡ
động viên tôi trong suốt thời gian học tập.


ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 1
MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề
Vào những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đi đôi với sự phát triển kinh
tế xã hội, nhu cầu sử dụng năng lượng càng tăng nhanh. Theo dự báo của tổ chức
Năng lượng thế giới IEO (International Energy Organzation), từ năm 1999 đến

2020 nhu cầu tiêu thụ năng lượng của thế giới sẽ tăng 60%. Nguồn n
ăng lượng có
thể chia làm ba dạng: Năng lượng hóa thạch (dầu mỏ, than đá và khí tự nhiên), năng
lượng tái tạo và năng lượng hạt nhân. Hiện nay trên thế giới nguồn cung cấp năng
lượng chủ yếu vẫn là từ nhiên liệu hóa thạch. Hơn nữa, nguồn dầu thô và than đá
được sử dụng quá nhiều, tạo ra sự giải phóng Carbon ngược lại vào bầu khí quyển,
là nguyên nhân chủ yếu củ
a sự thay đổi khí hậu toàn cầu. Do đó, nhiều quốc gia và
tập đoàn năng lượng trên thế giới có chiến lược sử dụng tiết kiệm dầu mỏ đồng thời
nghiên cứu sản xuất các nhiên liệu sạch thân thiện với môi trường trong đó có nhiên
liệu sinh học.
Nhiên liệu sinh học (NLSH) là loại chất đốt tái tạo sản xuất từ nguyên liệu
động thực vật gọi là sinh kh
ối (biomass). Nguồn năng lượng được tạo ra từ biomass
chiếm 63% tổng số năng lượng tái tạo. Có nhiều cách phân loại nhiên liệu sinh học
(NLSH). Thông thường dựa vào nguồn gốc của các nguyên liệu dùng để sản xuất
NLSH có thể chia NLSH thành ba thế hệ:
- NLSH thế hệ thứ nhất từ các loại cây trồng ăn được như lương thực, thực phẩm, ví
dụ: Mía, của cải, ngũ cốc, d
ầu mỡ động thực vật. Nhược điểm cơ bản là đã sử dụng
những nguồn tài nguyên sinh khối liên quan đến lương thực dẫn đến mất an ninh
lương thực trên thế giới.
- NLSH thế hệ thứ hai chủ yếu từ các phụ phẩm hoặc phế thải trong sản xuất, sinh
hoạt có nguồn gốc hữu cơ, ví dụ: Phế thải nông lâm nghiệp (rơ
m rạ, trấu, bã mía,
thân ngô, mùn cưa, gỗ vụn…), chăn nuôi (phân súc vật, bùn cống rãnh…) và sinh
hoạt (dầu, mỡ thải). Ưu điểm nổi bật là sử dụng nguồn sinh khối không ảnh hưởng
gì đến lương thực, thực phẩm nuôi sống con người và gia súc đảm bảo an ninh
lương thực toàn cầu, đồng thời còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM

Trang 2
- NLSH thế hệ thứ ba từ tảo (nước ngọt và nước biển), cây jatropha curcas (cây cộc
rào hay cây dầu mè), cỏ swichgrass, cây halophyte, có ưu điểm vượt trội là dựa vào
nguồn sinh khối phong phú của các loại cây không thuộc cây lương thực, có thể
sinh trưởng hoang dại ở cả những nơi đất cằn cỗi với hàm lượng dầu cao. Tuy nhiên
đó mới chỉ là nghiên cứu thăm dò ban dầu còn nhiều vấn đề khoa học và công nghệ

liên quan đến canh tác, khai thác, chế biến các tài nguyên sinh khối này cần phải
giải quyết trước khi NLSH thế hệ ba xuất hiện trên thị trường.
Hiện nay NLSH thế hệ thứ hai được ưu tiên nghiên cứu và sử dụng vì hầu
như sẽ không ảnh hưởng đến giá lương thực và đảm bảo an ninh lương thực toàn
cầu. Biomass như rơm rạ, thân cây ngũ cốc và các phế thải nông nghiệp khác được
tạo ra hàng n
ăm trên thế giới khoảng hơn nửa tỷ tấn, trong đó châu Á chiếm tới
92%. Rơm rạ là một trong những phế thải nông nghiệp ít giá trị sử dụng, số lượng
lớn đặc biệt ở các nước xuất khẩu lúa gạo, như ở Việt Nam. Rơm rạ chiếm hơn 50%
tổng trọng lượng cây lúa.
Thành phần chủ yếu của chúng bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin
gắn kết ch
ặt chẽ với nhau bởi những liên kết hidro và liên kết đồng hóa trị. Để có
thể sản xuất ethanol, các polymer này cần được phân hủy thành đường đơn và sau
đó hỗn hợp đường được lên men thành ethanol. Việc thủy phân lignocellulose theo
con đường hóa học và enzyme đều không đơn giản và hao phí về mặt kinh tế. Các
nghiên cứu cho thấy một số loài vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose
trong đó có loài Volvariella volvacea, tên thường gọi là nấm rơm. Nấm rơ
m được
trồng trên nhiều dạng chất thải có lignocellulose như rơm của các cây ngũ cốc, lá
chuối, bã mía đường, vỏ quả cọ dầu. (Cai et al., 1999). Giống với nhiều vi nấm,
trong quá trình sinh dưỡng, các loại nấm này có khả năng sản sinh trong môi trường
nuôi dưỡng chúng hệ enzym để phân giải cellulose, hemicellulose thành các đường

đơn sau đó mới hấp thụ làm nguồn dinh dưỡng. V. volvacea sản xuất ra một hệ
thống nhiều enzym gồ
m β-glucosidase, endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 3
chuyển hoá cellulose thành glucose (Cai et al., 1998). Ngoài ra, V. volvacea còn tạo
ra laccase là một enzym phân giải lignin và oxy hoá các hợp chất phenol [1].
Việc sử dụng V. volvacea để thủy phân lignocellulose góp phần giảm ô nhiễm
môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế. Do đó, chúng tôi chọn đề tài “Tiền xử lý,
thủy phân và thử khả năng tạo bioethanol từ rơm rạ” với mục tiêu và nội dung cụ
thể như sau:
 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu: Sử
dụng các chủng nấm rơm để tiền xử lý, thủy phân và
thử khả năng tạo bioethanol từ rơm rạ từ đó chọn chủng nấm rơm có khả năng thủy
phân nguyên liệu lignocellulose tốt nhất.
 Nội dung nghiên cứu:
Nuôi cấy nấm rơm trên cơ chất rơm rạ với độ ẩm, hàm lượng dinh dưỡng thích
hợp.
Theo dõi hoạt tính các enzyme thủy phân cơ chất r
ơm rạ và sự thay đổi thành
phần rơm rạ theo thời gian.
Điện di protein để kiểm tra sự hiện diện của protein enzyme.
Lên men bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Thử khả năng tạo cồn bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS-headspace

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
ii
MỤC LỤC
Nội dung Trang
Lời cảm ơn i
Mục lục ii
Danh mục hình iv
Danh mục bảng vi
Ký hiệu và viết tắt vii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: Tổng quan 4
1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4
1.2. Cấu trúc rơm rạ 4
1.2.1. Cellulose 5
1.2.2. Hemicellulose 6
1.2.2. Lignin 7
1.3. Nấm rơm 9
1.3.1. Tổng quát về nấm rơm 9
1.3.2. Cấu tạo hình thái quả thể nấm rơm 10
1.3.3. Vòng đời của nấm rơm 11
1.3.4. Nguyên liệu trong môi trường trồng nấm 12
1.4. Qúa trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ 13
1.4.1. Bioethanol 13
1.4.2. Qúa trình sả
n xuất bioethanal từ rơm rạ 15
1.4.2.1. Tiền xử lý 15

1.4.2.2. Thủy phân 16
1.4.2.3. Lên men 26
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 32
2.1. Vật liệu 32
2.1.1. Nguyên liệu 32
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 33
2.1.3. Hóa chất 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu 34
2.2.1. Phương pháp phân tích 34
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
iii
2.2.1.1. Phương pháp xác định FPase 34
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase và xylanase 37
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính laccase 41
2.2.1.4. Xác định hàm lượng protein 42
2.2.1.5. Phương pháp định lượng đường khử 43
2.2.1.6. Phương pháp xác định thành phần rơm rạ 44
2.2.1.7. Phương pháp xác định hàm lượng glucosamine 45
2.2.1.8. Phương pháp nuôi cấy nấm men 47
2.2.1.9. Điện di phân tích protein 47
2.2.1.10. Đo nồng độ cồn bằng máy sắc ký khí khối phổ 53
2.2.2. Trình t
ự nghiên cứu 54
2.2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm 54
2.2.2.2. Tiền xử lý 54
2.2.2.3. Thủy phân 55
2.2.2.4. Lên men 55
2.2.2.5. Đo nồng độ cồn của các mẫu lên men 55
Chương 3: Kết quả và thảo luận 56
3.1. Hoạt tính enzyme FPase, cellulase, xylanase, laccase của mẫu theo thời gian 56

3.2. Sự thay đổi pH theo thời gian 59
3.3. Sự tăng trưởng tế bào nấm r
ơm theo thời gian 61
3.4. Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian 62
3.5. Hàm lượng glucose sau thủy phân 63
3.6. Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy 65
3.7. Xác định protein enzyme bằng điện di SDS-PAGE 66
3.8. Nồng độ cồn sau lên men 68
Chương 4: Kết luận và kiến nghị: 69
4.1. Kết luận 69
4.2. Kiến nghị 69
Tài liệu tham khảo 71
Ph
ụ lục 75
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
vi
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm
Bảng 1.2: Thành phần một số nguồn nguyên liệu trồng nấm
Bảng 2.1: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose và xylose
Bảng 2.2: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase
Bảng 2.3: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn protein
Bảng 2.4: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose
Bảng 2.5: Các bước tiến hành dựng đường ch
ẩn glucosamine
Bảng 2.6: Các thành phần của HVP
Bảng 3.1: Hoạt tính enzyme FPase, cellulase và xylanase của mẫu
Bảng 3.2: Hoạt tính laccase của mẫu
Bảng 3.3: pH theo thời gian của cơ chất

Bảng 3.4: Hàm lượng đường glucosamine của các mẫu
Bảng 3.5: Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian
Bảng 3.6: Hàm lượng glucose sau thủy phân
Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy
Bảng 3.8: Nồng độ cồn sau lên men

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Rơm rạ ở Việt Nam
Hình 1.2: Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose
Hình 1.3 : Vùng vô định hình và vùng kết tinh trong vách tế bào thực vật
Hình 1.4: Các thành phần của hemicellulose
Hình 1.5: Các alcohol thơm của lignin
Hình 1.6 : Cấu trúc lignin
Hình 1.7: Cấu trúc các thành phần rơm rạ
Hình 1.8: Quả thể nấm rơm

Hình 1.9: Các giai đoạn phát triển khác nhau của tai nấm rơm
Hình 1.10: Chu trình sống của nấm rơm
Hình 1.11 : Cellulase
Hình 1.12: Tóm tắt quá trình thủy phân của cellulase
Hình 1.13: Cơ chế hoạt động của xylanase
Hình 1.14. Cơ chế xúc tác của laccase
Hình 1.15: Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hình 1.16: Cơ chế quá trình lên men
Hình 2.1: Rơm rạ được xử lý với chủng nấm rơm
Hình2.2 : Nấm rơm được phân lập trong ống thạch nghiêng.
Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện điện di protein trên gel
Hình 2.4 : Quy trình ti

ến hành thí nghiệm
Hình 3.1: Hoạt tính enzyme Fpase theo thời gian nuôi cấy
Hình 3.2: Hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy
Hình 3.3: Hoạt tính xylanase theo thời gian nuôi cấy
Hình 3.4: Hoạt tính laccase theo thời gian nuôi cấy
Hình 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian
Hình 3.6: Hàm lượng glucosamine theo thời gian
Hình 3.7: Thành phần rơm rạ thay đổi theo thời gian
Hình 3.8: Hàm lượng glucose sau thủy phân
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
v
Hình 3.9: Hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy
Hình 3.10: Hoạt tính cellulase trên môi trường CMC agar
Hình 3.11: Kết quả điện di protein
Hình 3.12: Nồng độ cồn sau lên men

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 4
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam
Rơm rạ gắn liền với đời sống người dân Việt Nam từ bao đời nay. Rơm rạ
cũng tạo nên nét đẹp rất riêng của làng quê Việt Nam với cây rơm, mái rạ. Nó là
nguồn nhiên liệu, nguyên liệu cho rất nhiều lĩnh vực sản xuất và là vật phẩm phục
vụ muôn mặt đời sống sinh hoạt củ
a chúng ta.
Tuy nhiên vài năm trở lại đây tình trạng đốt rơm rạ diễn ra ngày càng phổ
biến sau mùa gặt gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.
Như vậy rơm rạ nên giải quyết thế nào? Hầu hết các nước đã và đang tìm
kiếm các phương pháp tận dụng rơm rạ xử lý theo cách an toàn thân thiện với môi
trường.

Rơm rạ là một trong các nguồn nguyên liệ
u lignocellulose. Hằng năm nền
nông nghiệp Việt Nam tạo ra một lượng lớn rơm rạ nhưng phần lớn dùng để bón,
làm chất đốt hay làm thức ăn cho gia súc mà chưa được sử dụng một cách hiệu quả
trong vấn đề năng lượng.
Rơm rạ chiếm 62,6% các nguồn biomass chính ở Việt Nam cho thấy việc tận
dụng nguồn nguyên liệu này trong việc sản xuất bioethanol là cách sử dụng chúng
hi
ệu quả trong vấn đề năng lượng [3]

Hình 1.1: Rơm rạ ở Việt Nam
1.2. Cấu trúc rơm rạ
Thành phần chính của rơm rạ là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích
ly và tro. Cellulose, hemicellulose và lignin được quan tâm chủ yếu trong luận văn.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 5
Cellulose chiếm 29,68%, hemicellulose chiếm 17.11% và lignin chiếm 12.17%
thành phần rơm rạ [17].
1.2.1. Cellulose
Cellulose là một polymer mạch thẳng của các D- glucose, các D- glucose liên
kết với nhau bằng liên kết β-1,4- glycoside (Hình 1.2).

Hình 1.2 : Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [19]
Liên kết β-1,4- glycoside là một liên kết nội phân tử nên các đơn vị glucose
xen kẽ trên và dưới tạo nên cellulose có dạng chuỗi xoắn. Mỗi một chuỗi celllose
chứa hàng chục nghìn đơn vị β-1,4- glycoside, các chuỗi này lại sắp xếp song song
nhau tạo thành các sợi có đường kính 3.5 nm. Các sợi này lại kết hợp với nhau
thành bó sợi có đường kính lớn hơn. Giữa các chuỗi cellulose thường hình thành rất
nhiều các liên kết hydro, nh
ờ đó mà sợi cellulose rất bền. Các bó sợi có cấu trúc

không giống nhau:
+ Phần cấu trúc chặt gọi là cellulose kết tinh
+ Phần cấu trúc không chặt gọi là cellulose vô định hình.

Hình 1.3: Vùng vô định hình và vùng kết tinh trong vách tế bào thực vật.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 6
Cellulose là nguồn nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất và được sản
xuất với tốc độ 4x10
10
tấn/ năm. Các sản phẩm thủy phân của cellulose là nguồn
nguyên liệu chế biến cho rất nhiều quá trình hóa học, là nguồn cung cấp glucose lớn
nhất và được dùng sản xuất nhiên liệu ethanol.
1.2.2. Hemicellulose
Hemicellulose cùng với lignin và cellulose tạo thành tế bào thực vật.
Hemicellulose là polymer của xylose, galactose, mannose, aribinose, các đường
khác và các acid uronic của chúng


Hình 1.4: Các thành phần của hemicellulose [37]
Thành phần cấu tạo của hemicellulose rất khác nhau trong tự nhiên và phụ
thuộc vào nguồn thực vật nhưng có một vài đặc điểm chung sau:
+ Mạch chính được cấu tạo từ liên kết 1,4
+ Xylose là thành phần quan trọng nhất
+ Nhóm thế phổ biến là nhóm acetyl O- liên kết với vị trí 2 hoặc 3
+ Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide
hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và v
ới
lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại
ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân.

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 7
1.2.3. Lignin
Lignin là một phức hợp polymer thơm vô định hình, là polymer phong phú thứ
hai sau cellulose, thông thường được tìm thấy ở gỗ và là một phần không thể thiếu
của vách tế bào thực vật.
Lignin lấp đầy khoảng trống trong vách tế bào giữa cellulose, hemicellulose và
các thành phần pectin, đặc biệt trong tracheids, sclereids và xylem. Nó có liên kết
đồng hóa trị với hemicellulose tạo độ bền cơ học cho vách tế bào.
Lignin thông thường chứa 3 alcohol thơm bao gồm coniferyl alcohol, sinapyl
và p-coumaryl [33].

p-coumaryl alcohol Coniferyl alcohol Sinapyl alcohol
Hình 1.5: Các alcohol thơm của lignin [31]
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong
cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc
hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng
vô định hình. Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên
mặt phẳng thành tế bào. Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của
lignin đều bị ảnh hưởng b
ởi mạng polysaccharide. Việc mô hình hóa động học phân
tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin
sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 8
Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự
do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm
carbonyl.
Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và cả với cellulose, độ

bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa
học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết.
Cấu trúc hóa học của lignin dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH
thấp.
Lignin khó được tiêu hóa bởi enzyme do bởi các liên kết chéo với các thành
phần khác của tế bào, nó cũng làm giảm sự tiếp cận của cellulose và hemicellulose
tới một vài enzyme của vi khuẩn. Do đó, lignin thông thường giúp bảo vệ thực vật
khỏi mầm bệnh và vật gây hại. Tuy nhiên, vài loài nấm và vi khuẩn có khả năng
phân hủy các polymer này: Nấm mục trắng Coriolus versicolor, P. chrysosporium
and T. versicolor [34].

Hình 1.6 : Cấu trúc lignin [31]


ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 9

Tóm lại, các thành phần của rơm rạ có thể được minh họa trong hình dưới đây


Hình 1.7: Cấu trúc các thành phần rơm rạ [38]
1.3. Nấm rơm
1.3.1. Tổng quát về nấm rơm
Nấm rơm là loại nấm khá phổ biến ở Đông Nam Á, nấm thường mọc trên
nguyên liệu phổ biến là rơm nên có tên chung là nấm rơm, (straw mushroom), tên
khoa học là Volvariella volvacea, thuộc họ nấm rơm Plutaceae. Nấm cũng có thể
mọc trên một vài loại nguyên liệu khác như: lục bình, bẹ chuối khô, bông gòn, mạt
cưa, bã mía,….
Về phân loại, nấm rơm dự kiến có hơn 100 loài nhưng sự phân biệt giữa chúng
thường không rõ ràng. Ví dụ một vài loài nấm như: V.diplasia, mũ nấm có màu nâu

đất, hay nấm rơm lụa bạc V.bombycina,….
Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm được tóm tắt trong bảng 1.1.






ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 10
Bảng 1.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm rơm [17]
Yếu tố Nuôi ủ tơ nấm Ra quả thể
Khoảng biến
thiên
Tối thích Khoảng biến
thiên
Tối thích
Nhiệt độ 14-40
0
C 35
0
C 25-30
0
C 28
0
C
Ẩm độ 50-70% 60% 80-100% 90%
pH 6-7 6.5 6-7 6.5

1.3.2. Cấu tạo hình thái quả thể nấm: Qủa thể nấm rơm gồm:

- Bao gốc: Bao gốc dài và cao, lúc nhỏ bao lấy mũ nấm, khi mũ nấm trưởng thành
gây nứt bao, bao gốc chỉ còn lại phần trùm lấy gốc chân cuống nấm. Bao nấm chứa
sắc tố melanin tạo ra màu đen ở bao gốc. Độ đậm nhạt tùy thuộc vào ánh sáng, ánh
sáng càng nhiều thì bao gốc càng đen.
- Cuống nấm: Khi còn non thì mềm và giòn. Khi già x
ơ cứng lại và khó bẽ gảy.
- Mũ nấm: Mũ nấm hình nón cũng có chứa melanin nhưng nhạt dần từ trung tâm ra
rìa mép. Bên dưới mũ có nhiều phiến nấm.

Hình 1.8: Quả thể nấm rơm [17]

Tai nấm rơm đặc biệt lúc còn non được bao trong một lớp vỏ có màu trắng
xám đến đen, khi trưởng thành xé rách vỏ bọc và vươn mũ nấm lên cao, cuống có
bao gốc và không vồng cổ. Đảm bào tử hình thành ở hai mặt phiến nấm bên dưới
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 11
mũ nấm. Đảm bào tử nấm rơm có màu hồng thịt nên khi tai nấm trưởng thành phiến
có màu đỏ, vươn mũ nấm lên cao.
Từ lúc hình thành nụ nấm đến khi phát triển thành tai trưởng thành, quả thể
nấm rơm trải qua nhiều giai đoạn. Người ta gọi tên quả thể dựa theo hình dạng của
chúng ở mỗi giai đoạn: Hình đinh ghim, hình nút, hình trứng, hình kéo dài và hình
dù hay trưởng thành.

Dạng nút Dạng trứng Dạng kéo dài Dạng trưởng thành

Hình 1.9: Các giai đoạn phát triển khác nhau của tai nấm rơm [17]
1.3.3. Vòng đời của nấm rơm :
Bắt đầu từ các đảm bào tử và được xem là kết thúc khi hình thành tai nấm hoàn
chỉnh. Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi, gặp điều kiện
thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm này thường chỉ có một nhân

nên gọi là s
ợi nấm sơ cấp. Đối với nấm rơm, chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ một bào tử nẩy
mầm cũng có thể tự phối hợp cho ra tơ thứ cấp. Từ hệ sợi tơ thứ cấp chứa hai nhân,
nấm phát triển thành mạng sợi, lan ra khắp nơi trên cơ chất để rút lấy dinh dưỡng.
Trong trường hợp bị đứt khúc, các s
ợi nấm tự làm lành vết thương và tái lập lại hệ
sợi, tương tự như cây trồng trong giâm chiết cành. Hệ sợi nấm phát triển thành
mạng sợi. Gặp những điều kiện nhất định, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch
nấm. Hạch nấm tiếp tục phát triển cho quả thể trưởng thành.

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 12


Hình 1.10: Chu trình sống của nấm rơm [17]
Nấm rơm còn một dạng bào tử thứ hai gọi là hậu bào tử. Đây là bào tử vô tính
có dạng hình cầu và là một dạng sống đặc biệt của chúng nhằm tránh qua các giai
đoạn môi trường khắc nghiệt. Hậu bào tử hình cầu, có hai nhân và có màu hồng thịt
như đảm bào tử. Khi nẩy mầm, hậu bào tử sẽ cho lại hệ sợi nấm.
Chất xơ
của thực vật là cellulose, hemicellulose và lignin trong khi chất xơ của
nấm là chitin.[28]. Chitin là vật liệu cấu trúc cơ bản trong nấm và được chứng minh
có giá trị như chất xơ. Nó cũng được thủy phân thành glucosamine.
1.3.4. Nguyên liệu trong môi trường trồng nấm
Trong thiên nhiên, hầu như tất cả các xác bã thực vật đều có thể trồng nấm.
Tuy nhiên, không phải nguyên liệu nào nấm cũng sử dụng ngay mà cần trải qua quá
trình chế biến thích hợ
p. Quá trình này gồm nhiều công đoạn với sự tham gia của
các yếu tố khác nhau, vừa sinh học vừa không sinh học [17].
Tùy loài nấm, có loài sản xuất được các loại enzym phân giải mạnh nên

nguyên liệu sử dụng tương đối thô hơn. Ngược lại, cũng có những loài cần có
nguyên liệu gần như mùn hóa. Dưới đây là một số nguồn nguyên liệu trồng nấm
(bảng 1.2)

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 13

Bảng 1.2: Thành phần một số nguồn nguyên liệu trồng nấm [7]
Rơm rạ lúa khô
Nước
 13,4% Cellulose và lignin 28%
Protein thô 1,8% Hydrat cacbon 42,9%
Lipid thô 1,5% Chất khoáng 12,4%
Bã mía đã phơi khô
Nước
 8,7% Cellulose và lignin 28,2%
Protein thô 2% Hydrat cacbon 58,4%
Lipid thô 0,7% Chất khoáng 2,1%
Cỏ khô
Nước
 14,14% Hydrat cacbon 3,45%
Protein thô 4,15% Chất khoáng 9,88%

1.4. Qúa trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ
1.4.1. Bioethanol:
Việc cung cấp và sử dụng năng lượng đóng một vai trò trong tâm trong tổ
chức xã hội, từ phúc lợi cá nhân cho đến sự phát triển xã hội và công nghiêp. Khả
năng tiếp cận năng lượng và chi phí cho năng lượng được đánh giá là yếu tố quyết
định cho mối quan hệ kinh tế và chính trị giữa các quốc gia. Xem xét các nguồn
năng l

ượng, xã hội loài người đã sử dụng nhiên liệu hóa thạch tăng lên đáng kể
trong 50 năm qua . Việc sử dụng xăng cho vấn đề giao thông vận tải đã chiếm 1/3
lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính (Wyman, 1996) ảnh hưởng nghiêm trọng đến
môi trường đã dẫn đến một vấn đề thiết yếu là giảm nhu cầu tiêu thụ. Thật vậy, các
nền kinh tế mạnh nhất th
ế giới đã ký cam kết sâu sắc đối với việc phát triển các kỹ
thuật công nghệ nhằm vào việc sử dụng các nguồn năng lượng tái tạo. Trong
chương trình nghị sự này, viêc thay thế xăng nhiên liệu lỏng bằng ethanol tái tạo là
có tầm quan trọng hàng đầu.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 14
Nhiên liệu bioethanol chủ yếu được sản xuất từ quá trình lên men đường.
Nguồn đường chính để sản xuất ethanol là các cây trồng cho mục đích năng lượng
bao gồm ngũ cốc, ngô, lúa mì, mùn cưa, rơm,…. Cũng có những nghiên cứu việc sử
dụng rác thải đô thị để sản xuất nhiên liệu ethanol.
Ethanol là một chất lỏng không màu, có thể bị phân hủy do vi khuẩn, tính
độc thấp và ít gây ô nhiễm môi trường nếu b
ị tràn. Khi cháy sẽ tạo ra CO
2
và H
2
O.
Bioethanol có một số thuận lợi hơn các nguồn nhiên liệu khác: Có thể tái tạo, giảm
lượng khí nhà kính, có thể bị phân hủy và ít độc hơn các nhiên liệu hóa thạch khác,
giảm lượng carbon monoxide do đó cải thiện chất lượng không khí.
Ethanol có thể được sản xuất từ biomass thông qua quá trình thủy phân và lên
men đường. Biomass chứa một phức hợp carbohydrate như cellulose, hemicellulose
và lignin. Để sản xuất đường từ biomass, biomass phải được tiền xử lý bằng acid
hay enzyme để làm giảm kích thước vật liệu thô và mở cấu trúc thực vật. Các phần
của cellulose và hemicellulose bị phá vỡ bởi enzyme hay acid thành đường và sau

đó sẽ lên men thành ethanol.
Brazin là nước tiên phong trong việc sử dụng nhiên liệu tái tạo. Việc thay thế
xăng bằng ethanol bắt đầu từ năm 1975, khi chính phủ Brasil phát động chương
trình
“Proálcool Program". Tại thời điểm cuộc khủng hoảng dầu lửa đầu tiên vào
những năm 1970, cả nước phải nhập khẩu 85% dầu thì tiềm năng sản xuất ethanol
từ mía như một nhiên liệu vận chuyển phù hợp với chính sách của chính phủ về
cung cấp năng lượng. Chương trình
“Proálcool Program" ưu đãi cho các nhà máy
rượu và các công ty ô tô sản xuất xe hơi chỉ chạy bằng ethanol.
Gần đây, ngành công nghiệp ethanol ở Brazin không được sự khuyến khích
của chính phủ và nhiên liệu sinh học được phân phối bởi công ty dầu Petrobras. Các
hạm đội Brazin của 20 triệu xe hơi (gồm xe hơi, ánh sáng quảng cáo, xe tải và xe
buýt khoảng 24 triệu) chạy được xăng pha trộn có chứa 22-24% ethanol hay 100%
ethanol. Khí đốt tự nhiên cũng được sử dụng số lượ
ng ít. Sự tiêu thụ ethanol được
dự báo sẽ tăng lên khi số lượng xe chạy bằng cả xăng pha trộn hay bằng ethanol,
được dự báo sẽ tăng từ 4 đến 15 triệu vào 2013.

ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 15
Mĩ cũng đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học. Liên minh châu Âu
cũng đã tiến tới việc khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo
luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành
viên.
Ở Việt Nam, công nghệ sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu, chủ yếu
sản xuất từ rỉ
đường mía làm ethanol cho ngành thực phẩm và công nghiệp.
Cần có những nghiên cứ để làm sao tăng hiệu quả của quá trình sản xuất
ethanol và tăng quá trình chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững thay thế

nhiên liệu hóa thạch.
1.4.2. Quá trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ
1.4.2.1. Tiền xử lý
Tiền xử lý lignocellulose là cần thiết bởi vì quá trình thủy phân các nguyên
liệu không được tiền xử lý xảy ra chậm và kết quả là sản lượng sản ph
ẩm thấp. Vài
phương pháp tiền xử lý làm giảm sự kết tinh của cellulose. Tiền xử lý cũng làm cho
cellulose đến gần hơn với các enzyme phân hủy cellulose, điều này làm giảm chi
phí quá trình xử lý.
Nhiều phương pháp tiền xử lý khác nhau được sử dụng, có thể chia thành ba
nhóm chính:
+ Hóa học ( acid hay kiềm)
+ Vật lý/ hóa lý
+ Phương pháp sinh học bằng vi sinh vật
Trong phương pháp tiền xử lý bằng phương pháp hóa học, ví dụ dùng acid,
hemicellulose sẽ bị tấ
n công và phần lớn lignin bị loại bỏ.
Không có một nguyên lý tiền xử lý chung nào và các nguyên liệu khác nhau sẽ
có phương pháp tiền xử lý khác nhau. Vì nhiều enzyme phân hủy cellulose của nấm
hoạt động ở pH thấp ( 4-5), tiền xử lý bằng acid dường như được ưu tiên trong khi
enzyme nấm được chọn cho thủy phân.
Tiền xử lý sinh học dùng vi sinh vật và các enzyme của chúng có những thuận
lợi như: Nhu cầu năng lượng thấp, tạo ch
ất thải thấp và ít tác động đến môi trường.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 16
Vài loài nấm đảm, ví dụ P. chrysosporium, Streptomyces viridosporus, Phelebia
tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiae
được chứng minh có khả
năng tấn công lignin và carbohydrate, nó cũng được chứng minh có khả năng biến

đổi nguyên liệu lignicellulose thành ethanol.
1.4.2.2. Thủy phân
Sau khi tiền xử lý, cellulose và hemicellulose được thủy phân thành đường đơn
( hexose và pentose) bằng cách dùng cellulase và hemicellulase. Enzyme chịu đựng
nhiệt độ cao và pH thấp được dùng cho thủy phân vì hầu hết các kỹ thuật tiền xử lý
hiện nay dựa vào acid và độ nóng. Hơn nữa, enzyme chịu nhiệt có vài thuận lợi như
hoạt tính chuyên biệ
t và tính ổn định cao, cải thiện toàn bộ quá trình thủy phân, từ
đó làm giảm chi phí. Do bởi những hứa hẹn về enzyme nấm chịu nhiệt và acid nên
chúng có tiềm năng tốt dùng để thủy phân lignocellulose ở quy mô công nghiệp.
 Enzyme cellulase

Hình 1.11 : Cellulase
- Cellulase là một phức hợp gồm nhiều enzyme. Các loại enzyme trong phức hợp
này sẽ lần lượt phân hủy cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose.
Theo Wood và Mc Crae (1979) quá trình thủy phân cellulose được thực hiện
bởi ba nhóm enzyme sau :
+ Endocellulase hay endoglucanase : Phân giải liên kết β-1,4-glycosid bằng cách
tấn công vào vùng không kết tinh của cellulose, pH thích hợp 4-5, nhiệt độ thích
hợp từ 50 đến 70
0
C. Sản phẩm của quá trình này là cellodextrin, cellobiose và
glucose
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 17
+ Exocellulase hay exobiohydrolase : Enzyme này thủy phân cellobiose từ đầu
không khử của chuỗi glucan và cellodextrin, pH thích hợp 4-5, nhiệt độ thích hợp
37-60
0
C.

+ β-glucosidase hay cellobiase : Enzyme này thủy phân cellobiose và cellodextrin
tạo thành glucose, nhiệt độ thích hợp 45-75
0
C.
- Cơ chế tác động của cellulase
Quá trình tác dụng của cellulase có thể chia thành những giai đoạn sau :
+ Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi
Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha
rắn/ lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử. Những tương tác
này thường không mang bản chất cộng hóa trị, nói cách khác, các tương tác này
thường tạo thành do liên kế
t hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm
kỵ nước. Các phân tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước
trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đến sự hấp phụ mới. Lực tĩnh điện góp phần vào việc
hấp phụ của enzyme lên bề mặt phân pha, tuy nhiên không phải là yếu tố quyết định
quá trình hấp phụ của protein.
Protein là mộ
t polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này
làm cho protein có bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt. Phần kỵ nước trong
phân tử protein là những nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane,
phenylalanine và tyrosine. Thông thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các
amino acid mang nhóm kỵ nước sẽ được giấu vào bên trong. Tuy nhiên cũng có một
vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề mặt ngoài của phân tử
protein. Chính các
phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa
các phần kỵ nước và liên kết hidro. Ái lực của protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước
trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh hưởng tới tương tác tĩnh điện.
Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề mặt kỵ n
ước là bất thuận
nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước. Điều này bởi vì phân tử protein sẽ có

một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước.
ĐH Quốc gia ĐH Khoa học tự nhiên TP.HCM
Trang 18
Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro.
Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện. Trong thực tế, điện tích bề mặt
của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó.
Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp thụ mà tương tác điện tích-
điện tích hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đ
óng vai trò quyết định cho quá
trình.
Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn
tới sự hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu chỉ ra
rằng cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose. Ngoài ra, đối với
β- glucosidase không giống các enzyme cellulase khác không có trung tâm tạo liên
kết CBD, enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng.
Rất cần thiết hạn chế tối đa việ
c hấp phụ không chọn lọc của cellulase lên
lignin nếu muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế. Về mặt lý
thuyết, công nghệ protein có thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho
enzyme này hấp phụ chọn lọc hơn. Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên
vùng cellulose kết tinh là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác
động lên cấu trúc cần được tránh. Hiện tại, vẫn chưa có nghiên cứu nào thành công
trong việc thay đổ
i chuỗi acid amin của cellulase để làm cho enzyme này thủy phân
vật liệu lignocellulose hiệu quả.
Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose
-CBD và trung tâm hoạt động chính -CD. Cellulase tạo được liên kết với cellulose
là nhờ vào trung tâm tạo liên kết CBD. Đối với các chủng T. reesi, CBD là trung
tâm gồm các phân tử nhỏ, gồm 36 amino acid. Thông thường trung tâm liên kết có
3 amino acid tyrosine, chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose. Trong CBD

I, một tyrosine được thay thế bằng tryptophane.
Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBD I, CBDII, EG,…) sẽ
dẫn
đến ái lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất. Đã có
nhiều nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết
với cellulose.