Xây dựng qui trình xác định hàm lượng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột qua chế biến ở nhiệt độ cao bằng phương pháp lcmsms

- 1 -
MỞ ĐẦU
- Acrylamide là một hoá chất công nghiệp sử dụng chủ yếu là để sản
xuất polyacrylamide; nó cũng vừa được phát hiện trong thực phẩm với
hàm lượng khá cao. Acrylamide được hình thành trong quá trình chiên,
nướng và đút lò của nhiều loại thực phẩm khác nhau, đặc biệt là các
thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây và các sản phẩm ngũ cốc. Các
nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến acrylamide vì tính độc hại của
nó trong thực phẩm, chính là khả nă
ng gây ung thư và phá huỷ DNA.
Nó là nguyên nhân gây ra những khối u ở chuột phòng thí nhiệm, dù
chưa có bằng chứng chứng minh phơi nhiễm acrylamide qua thực phẩm
là nguyên nhân gây ung thư ở người. Nó cũng được biết đến là chứng
độc thần kinh ở người và ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của con
người. Nhiều quốc gia và các hiệp hội quốc tế thực hiện đánh giá nguy
cơ độc hại của acrylamide trong thực phẩ
m và đưa ra kết luận rằng cần
có nhiều nỗ lực giảm hàm lượng chất này xuống thấp nhất có thể [15]
- Acrylamide được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm chiên, nướng,
đút lò, nó tồn tại trong những sản phẩm thực phẩm chế biến công
nghiệp cũng như nấu tại nhà. Acrylamide có phổ biến trong các sản
phẩm chế biến từ khoai tây ở nhiệt độ cao (khoai tây chiên, snack
khoai tây…), ngũ
cốc, bánh mì nướng, bánh quy, các sản phẩm bánh
công nghiệp, cà phê. Chưa có tổ chức cũng như quốc gia nào đưa ra
được hàm lượng tối đa cho phép của Acrylamide trong thực phẩm [15]
- Trong cuộc sống bận rộn ngày nay, thực phẩm ăn nhanh, chế biến sẵn
trở nên được ưa chuộng ở Việt Nam đặc biệt là snack khoai tây, mì ăn
liền…, ẩn trong nó là những mối nguy tiềm tàng ảnh hưởng đến sức
khoẻ
người tiêu dùng.

- Nhiệm vụ của Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng-Thành Phố Hồ Chí
Minh là tham vấn cho Bộ Y Tế đánh giá mối nguy ảnh hưởng đến sức
- 2 -
khoẻ người dân, xác định chất này trong thực phẩm là giai đoạn đầu
của quá trình.
- Góp phần vào giai đoạn này, đồng thời tận dụng các thiết bị sắc ký hiện
có tại Viện, chúng tôi thực hiện đề tài xây dựng qui trình xác định hàm lượng
Acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột qua chế biến ở nhiệt độ cao bằng
phương pháp LC-MS/MS
Mục tiêu thực hiện đề tài:
1. Xây dựng qui trình xác đị
nh acrylamide trên 2 nền mẫu chính snack
khoai tây và mì ăn liền:
- Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu và phân tích trên thiết bị
- Xác định giá trị sử dụng của phương pháp đã xây dựng
2. Áp dụng qui trình vừa xây dựng phân tích 30 mẫu snack khoai tây và
mì ăn liền sản xuất tại Việt Nam

- 3 -
TỔNG QUAN
CHƯƠNG 1: ACRYLAMIDE
1.1.Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của acrylamide [8], [46]
Acrylamide là chất hóa học có công thức phân tử C
3
H
5
NO, công thức cấu tạo

phân tử lượng 71.08g/mol và tên IUPAC là prop-2-enamide, với tính chất vật lý
và hóa học:
+ Là tinh thể rắn màu trắng, không mùi
+ Nhiệt độ nóng chảy: 84.5 ± 0.3
o
C
+ Áp suất hơi: thấp (0.007 mmHg ở 25
o
C, 0.03 mmHg ở 40
o
C, 0.07 mmHg ở
50
o
C và 0.14 mmHg ở 55
o
C)

+ Nhiệt độ sôi: 136
o
C ở 3.3 kPa / 25 mmHg
+ Ở điều kiện phân hủy không nhiệt tạo thành NH
3
, có tham gia của nhiệt độ
sẽ phân hủy thành CO, CO
2
, NOx…
+ Độ tan của acrylamide trong dung môi phân cực và không phân cực thay
đổi rất lớn
Bảng 1.1: Độ tan của Acrylamide trong những dung môi khác nhau
(Habermannm, 1991; American Cynamid, 1969)
Dung môi g/100 ml ở 30
o
C
Nước 215.5
Methanol 155
Dimethyl sulphoxide 124
Dimethyl formamide 119
Ethanol 86.2
Acetone 63.1
Pyridine 61.9
Acetonitrile 39.6
Ethylene glycol monobuthyl ether 31
Dioxane 30
Ethyl acetate 12.6
Chloroform 2.66
1,2-Dichloroethane 1.50
Benzene 0.35

Carbon tetrachloride 0.038
n-Heptane 0.0068
- 4 -
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp phân tích acrylamide có thể
kể đến là: độ tan, khối lượng phân tử nhỏ, độ bay hơi thấp…
Acrylamide là sản phẩm công nghiệp do sự thủy phân của acrylonitrile
Acrylamide được sử dụng để tổng hợp các polyacrylamide làm chất keo tụ: dùng
trong xử lý nước uống và nước thải, làm môi trường điện di, sử dụng trong công
nghiệp làm giấy, tinh chế quặ
ng…Một vài acrylamide được dùng trong sản xuất
thuốc nhuộm và sản xuất các monomer khác
1.2. Sự hình thành Acrylamide trong thực phẩm
Acrylamide trong thực phẩm được Swedish National Food
Administration công bố lần đầu tiên vào tháng 4 năm 2002. [14] Cơ quan
này đã sử dụng máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) để phát hiện
và khảo sát trong diện rộng các loại thực phẩm với số lượng hơn 100 mẫu
thực phẩm các loại. Các nhà nghiên cứu nhận thấy acrylamide không
được
tìm thấy trong các loại thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc.
Trong các sản phẩm khoai tây chiên hoặc các sản phẩm ngũ cốc được
chiên hoặc nướng như bánh bích qui … hàm lượng acrylamide nằm trong
khoảng từ 100-2300 µg/kg. Hơn một nửa số mẫu khoai tây chiên được
khảo sát có hàm lượng acrylamide trên 1000 µg/kg.
Nghiên cứu tiên phong trên đã mở đầu cho hàng loạt các nghiên cứu
khác nhau về khảo sát đánh giá thực trạng hàm lượng acylamide trong các
sả
n phẩm thực phẩm khác nhau, trong đó tập trung chủ yếu vào các đối
tượng thực phẩm giàu tinh bột và được chế biến ở nhiệt độ cao ở các quốc
gia khác nhau như Na Uy, Anh, Mỹ, Úc, Hồng Kông… Năm 2003,
Australia đã tiến hành khảo sát 112 mẫu thực phẩm giàu tinh bột trên thị

trường cả nước, qua khảo sát cho thấy hàm lượng acrylamide trung bình
trong khoai tây chips là 501μg/kg. Từ kết quả khảo sát cơ quan này cũng
tính lượng acrylamide đư
a vào cơ thể trung bình là 1.4μg/kg khối lượng
cơ thể ngày dựa trên khối lượng cơ thể là 67 kg.
- 5 -
Tại Hồng Kông, năm 2002 K.S.Leung và cộng sự đã sử dụng máy sắc
ký lỏng LC-MS/MS khảo sát 400 mẫu thực phẩm, chủ yếu là thực phẩm
truyền thống Châu Á tại Hồng Công cho thấy acrylamide được phát hiện
chủ yếu trong những nhóm như gạo và sản phẩm của gạo, mỳ, bánh và
những sản phẩm bột nhão dùng làm bánh…Những nhóm có hàm lượng
acrylamide cao là những sản phẩm liên quan đến bánh bích qui. Hàm
lượng acrylamide cao nhất
được tìm thấy trong những sản phẩm khoai tây
với hàm lượng từ 1500 – 1700 µg/kg. Các sản phẩm có độ giòn làm từ bột
lúa mạch có hàm lượng acrylamide thấp hơn, dao động trong khoảng 440
µg/kg, tiếp đến là các sản phẩm làm từ bắp 65 – 230 µg/kg và sau cùng là
sản phẩm làm từ bột gạo 15 – 42 µg/kg.
Báo cáo ngày 30 tháng 4 năm 2009 của EFSA (European Food Safety
Authority) [10] đã đưa ra kết quả khảo sát Acrylamide năm 2007 trong
các sản phẩm thực phẩm như sau:
Bảng 1.2: Acrylamide trong một số
sản phẩm thực phẩm (nguồn EFSA
2009)
Loại thực phẩm
Số
mẫu
Trung vị
µg/kg
Trung bình

µg/kg
Maximum
µg/kg
Bánh biscuit 227 169 313-317 4200
Bánh mỳ 272 46-50 126-136 2430
Các loại ngũ cốc
dùng ăn điểm tâm
128 79-100 135-156 1600
Thực phẩm ngũ cốc
dành cho trẻ em
76 5-42 52-74 353
Cà phê 208 188 249-253 1158
Khoai tây chiên 529 253 348-350 2668

Sản phẩm khác 854 160-169 305-313 4700
Snack khoai tây 216 490 626-628 4180
Các sản phẩm khoai
tây nấu tại nhà
121 150 310-319 2175
- 6 -
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy acrylamide được hình thành trong phản ứng
Maillad và chất chính để hình thành acrylamide là asparagine (một acid amine)
và đường khử (glucose, fructose, sucrose…) [45]

Hình 1.1: Cơ chế hình thành acrylamide theo phản ứng Maillard
Hàm lượng acrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng đường
và asparagine trong thực phẩm, nhiệt độ chế biến thực phẩm, thời gian chế
biến… Nhiệt độ càng cao thì acrylamide hình thành càng nhiều, thời gian
- 7 -
chế biến, hàm lượng đường và asparagine cũng tỉ lệ thuận với sự hình

thành acrylamide.

Hình 1.2: Nồng độ acrylamide(µg/kg)trong hambuger phụ thuộc
nhiệt độ chế biến [35]
1.3. Độc tính của acrylamide
Acrylamide được phát hiện trong thực phẩm vào tháng 4 năm 2002 tại
Thụy Điển, chủ yếu trong các loại thực phẩm giàu tinh bột khi chiên
hoặc nướng ở nhiệt độ cao trên 120
o
C. Đã có nhiều nghiên cứu để xác
định mức độ ảnh hưởng của acrylamide đối với con người thông qua
các thử nghiệm trên động vật. Con đường chính dẫn đến phơi nhiễm
acrylamide là do tiếp xúc với các monomer acrylamide qua da, qua
đường hô hấp và qua đường ăn uống. Acrylamide được đưa vào qua
đường miệng với liều trên 100 mg/kg trọng lượng cơ thể thì gây ngộ
độc cấp và LD
50
là >150 mg/kg trọng lượng cơ thể.[14]
* Mức độ phơi nhiễm của con người đối với acrylamide: [6], [10], [39]
Năm 2002, tổng hợp các số liệu thu thập được từ các nước Úc, Na
Uy, Hà Lan, Thụy Điển và Mỹ, Ủy ban FAO/WHO đã đưa ra phơi nhiễm
ước lượng của người dân đối với acrylamide là từ 0,3 - 0,8 μg/kg khối
lượng cơ thể/ngày. Tuy nhiên con số này chỉ mang tính tham khảo vì tại
thời
điểm này, những thống kê về loại thực phẩm bị ô nhiễm acrylamide
và số lượng mẫu chưa được đầy đủ.
- 8 -
Nghiên cứu năm 2004 khảo sát trên quần thể dân số Hà Lan cho thấy
loại thực phẩm đóng vai trò chủ yếu đối với phơi nhiễm acrylamide của
người dân là các sản phẩm khoai tây chiên (31%), sản phẩm chiên dòn

(15%), còn lại là cà phê (13%), bánh bích qui, bánh mì
Phơi nhiễm của quần thể dân số trung bình là 1μg/kg khối lượng cơ
thể/ngày) (JECFA 2005) thấp hơn 500 lần so với 0,5 mg/kg khối lượng cơ
thể/ngày (lượng cao nhất không gây ảnh hưởng
đến hệ thần kinh) [11]
Tuy nhiên IARC kết luận: acrylamide thuộc nhóm 2A là chất có thể
gây ung thư cho con người mặc dù không có bằng chứng đầy đủ về khả
năng này đối với con người. Nhưng có bằng chứng đầy đủ trên thực
nghiệm về khả năng gây ung thư trên động vật do acrylamide và chất
chuyển hóa glycidamide phản ứng cộng hóa trị với DNA ở chuột.
Acrylamide và glycidamide cộng hóa trị với haemoglobin ở nhữ
ng người
bị phơi nhiễm và ở chuột; đồng thời acrylamide gây đột biến gen và sai
hình (đột biến) nhiễm sắc thể trong tế bào mầm của chuột [23].
1.4. Các qui định về acrylmide:
Sau đây là một vài tiêu chuẩn cho phép của hàm lượng acrylamide
Bảng 1.3: Một vài tiêu chuẩn cho phép về hàm lượng acrylamide [8]
Nguồn Giới hạn cho phép Tham khảo
Vật liệu bao gói thực phẩm
10 μg/kg EU Commission, 2002b
Nước uống
1 μg/l
WHO-World Health
Organization

0.5 μg/l

EPA- Environmental
Protection Agency

0.1 μg/l EU Commission 1998
Mỹ phẩm chăm sóc cơ thể
0.1 mg/kg EU Commission 2002a
Mỹ phẩm khác
0.5 mg/kg EU Commission 2002a
Không khí nơi làm việc
30 μg/m
3

AFS 2005:17


- 9 -
1.5. Các phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm:
Đã có rất nhiều các nghiên cứu đươc đăng tải trong hầu hết các tạp chí khoa học
về phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm từ năm 2002 đến nay.
- Các phương pháp xác định acrylamide dựa trên các thiết bị sắc ký khí và
sắc ký lỏng với các đầu dò khác nhau (ECD; UV, DAD…):
o Sắc ký lỏng pha đảo đầu dò PDA được sử dụng xác định
acrylamide trong snack khoai tây theo Vural Gokmen, Hamide Z.
Senyuva, Jale Acar, Kemal Sarioglu, Thổ Nhĩ Kỳ năm 2004 [17]

o Theo nghiên cứu của E.K. Paleologos, M.G. Kontominas thuộc đại
học Ioannina, Hy Lạp Acrylamide đươc xác định bằng sắc ký lỏng
pha thường đầu dò UV [32]
o Yonghong Zhu
*, Genrong Li, Yunpeng Duan, Shiqi Chen, Chun
Zhang, Yanfei Li nghiên cứu xác định acrylamide trong thực phẩm
giàu tinh bột qua chế biến nhiệt bằng sắc ký khí đầu dò ECD
[44]…

Tuy nhiên, do sự phức tạp của các nền mẫu thực phẩm các phương pháp
này không hiệu quả để phân tích acrylamide ở hàm lượng vết. [43]
- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS ) cũng là phương pháp
lựa chọn ưu tiên khi hàm lượng Acrylamide thấp hơn 50 µg/kg ở sản
phẩm ngũ cốc sau tạo dẫn xu
ất (brom hóa) [33]
- Đầu dò khối phổ được ưu tiên chọn lựa khi kết hợp với sắc ký lỏng để dễ
dàng khẳng định lại cấu trúc vì acrylamide là chất có khối lượng phân tử
nhỏ mà nền mẫu thực phẩm lại vô cùng phức tạp [17] [43]

Một số các qui trình phân tích acrylamide trong một vài sản phẩm thực phẩm,
sử dụng các dung môi chiết khác nhau, các cách làm sạch khác nhau được
trình bày ở bảng 1.4



- 10 -
Bảng1. 4: Một số các phương pháp xác định acrylamide trong thực phẩm:
Sản phẩm
Dung môi
chiết
Làm sạch &
dẫn xuất
Thiết bị đo Tham khảo
Khoai tây chiên,
bánh cookies,
cacao, cà phê
H
2
O (70

o
C)
Hexan LC-UV [32]
Snack khoai tây
Acetone Hexan LC-UV [26]
Snack khoai tây
MeOH
Carrez I&II
SPE Oasis
HLB
LC-DAD
LC-MS
[17]
Snack khoai tây,
cánh gà chiên
Dd NaCl
2M
Hexan
Bromate hóa
EtOAc
GC-ECD
GC-MS
[41]

Mì ăn liền, snack
khoai tây, bánh qui
H
2
O
Hexan

Bromate hóa
EtOAc
GC-ECD
GC-MS
[44]

Ngũ cốc
H
2
O
Carrez I +
Carrez II
Bromate hóa
EtOAc-
Hexane (4:1)
Cột Florisil
GC-MS
[33]

Khoai tây chiên,
snack khoai tây
H
2
O
SPME
GC-PCI-
MS/MS
[28]

Snack khoai tây

H
2
O
Hexan
C18 (MSPD)
GC-MS
[13]
Snack khoai tây,
ngũ cốc, bánh qui,
b
ánh mì nướng
CH
2
Cl
2

-
EtOH 2%
ASE LC-MS/MS [7]
Thực phẩm
H
2
O
SPE Oasis
HLB
SPE Bond
Elut-Accucat
LC-MS/MS

[38]

Snack khoai tây,
thịt, bánh mì
H
2
O
SPE Isolute
Multi-Mode
300mg
LC-MS/MS

[40]
- 11 -
Sản phẩm
Dung môi
chiết
Làm sạch &
dẫn xuất
Thiết bị đo Tham khảo
Snack khoai tây,
ngũ cốc, bánh mì,
cà phê
H
2
O (80
o
C)
CH
2
Cl
2

SPE
MAX/MCX
SPE Envi-carb
LC-MS/MS

[40]
Khoai tây chiên,
bánh mì, đậu rang,
cà phê
H
2
O

CH
2
Cl
2
SPE Oasis
HLB 200mg
SPE Bond
Elut-Accucat
200mg
LC-MS/MS [36]
Khoai tây chiên,
snack khoai tây,
bánh mì, bánh qui
0.01mM
acid acetic
Carrez I +

Carrez II
SPE Oasis
MCX
LC-MS

[34]
Sản phẩm từ khoai
tây và ngũ cốc
H
2
O
SPE Oasis
HLB
SPE Bond
Elu
t
-Accucat
LC-MS/MS
[18]
Ghi chú:
SPE Oasis HLB: cột chiết pha rắn C18 nối silicagel HLB của Oasis
SPE Bond Elut-Accucat: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C8 và
chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX) của Agilent
SPE Isolute Multi-Mode: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C18
và chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX)
SPE MAX/MCX: kết hợp 2 cột chiết pha rắn với chất mang là chất trao đổi
cation (MCX) và anion trung bình (MAX)
* Ưu và nhược điểm của các phương pháp xác định acrylamide:
Thiết bị sắc ký lỏng LC với các đầu dò UV, DAD:
• Ưu: thiết bị rẻ tiền, xử lý mẫu đơn giản

• Nhược: dễ gây sai số, nhầm lẫn khi mẫu có nền phức tạp
Thiết bị sắc ký khí GC với các đầu dò ECD:
• Ưu: thiết bị rẻ tiền
• Nhược: quá trình xử lý mẫu phức tạp khi phải tạo dẫn xuất
- 12 -
Thiết bị GC-MS:
• Ưu: xác định được Acrylamide hàm lượng thấp hơn 50 µg/kg ở sản phẩm
ngũ cốc [33]
• Nhược: thiết bị đắt tiền, quá trình xử lý mẫu phức tạp vì phải tạo dẫn xuất
Thiết bị LC-MS:
• Ưu: xử lý mẫu đơn giản
• Nhược: dễ gây sai số, nhầm lẫn khi mẫu có nền phức tạp
Thiết bị
LC-MS/MS:
• Ưu: xử lý mẫu đơn giản
• Nhược: thiết bị đắt tiền
1.6. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ: [30], [31], [47]
1.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng:
1.6.1.1.Khái niệm: Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với
pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng.
Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt:
sắc ký lỏng pha thường và s
ắc ký lỏng pha đảo.
Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của
pha động, dùng phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử
lượng không lớn lắm
Sắc ký lỏng pha đảo: pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân
cực cao hơn. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân
cực đến phân cực vừa. Pha động thường là dung môi phân cực, trong đó
nướ

c đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, sắc ký lỏng pha đảo
được sử dụng nhiều.
1.6.1.2. Nguyên tắc: Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng
dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên
tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu
trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương
tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do đó, chúng di chuy
ển
với tốc độ khác nhau trong cột tách và tách khỏi nhau.
- 13 -
1.6.1.3. Sơ lược các bộ phận chính của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng
cao:
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính sau: bơm, bộ
tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu

Hình 1. 3: Sơ đồ một thiết bị HPLC
• Bơm: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định
khi thành phần pha động thay đổi. Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc
độ dòng, độ nhớt pha động và kích thước pha tĩnh.Gồm 2 chế độ:
o Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi, thời gian
phân tích dài, độ phân giải kém
o Chế độ gradient dòng: thành ph
ần pha động thay thổi trong quá
trình phân tích.
• Bộ tiêm mẫu: Dùng đưa mẫu vào hệ thống, bao gồm van 6 cổng, vòng
mẫu (loop) cho phép tiêm một thể tích giống nhau vào thiết bị…
• Cột sắc ký: thường làm bằng thép không rỉ; có đường kính 2.1 – 7.6mm,
chiều dài cột 1 – 30cm, đường kính hạt 3 - 10µm; trơ, có thành phẳng và
chịu được áp suất cao
BƠM 1

BƠM 2
DUNG
MÔI 1
DUNG
MÔI 2
BỘ TRỘN
BỘ TIÊM
MẪU
CỘT
ĐẦU DÒ
BỘ ĐIỀU KIỂN VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
- 14 -
Tùy tính chất của chất cần phân tích mà ta có thể lựa chọn cột phân tích
(pha tĩnh), pha động

Hình 1.4: Sơ đồ lựa chọn pha tĩnh [47]
Acrylamide tan tốt trong nước và các dung môi phân cực, là chất trung tính, háo
nước nên cột tách được chọn là cột pha đảo C18
1.6.2. Khối phổ:[31]
1.6.2.1.Khái niệm: Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định
khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion
phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có
th
ể được tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích như proton hóa, loại bỏ
electron…Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z, từ đó có thể cho
thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của thiết bị khối phổ: gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa, bộ phận
phân tích khối và đầu dò.
- 15 -
1.6.2.2.Nguyên tắc: Mẫu được ion hóa trong buồng ion hóa, sau đó được

đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu
thu được sẽ chuyển vào máy tính thông qua phần mềm xử lý và lưu trữ.
1.6.2.3. Cấu tạo của thiết bị khối phổ: gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa,
bộ phận tách ion và đầu dò ion
• Nguồn ion hóa: là nơi tạo ion, sử dụng các kỹ thuật: ion hóa phun
điện tử (ESI-electrospray ionization), ion hóa hóa h
ọc ở áp suất
thường (APCI-atmospheric pressure chemical ionization), ion quang
hóa học ở áp suất khí quyển (APPI- atmospheric pressure
photoionization)
o Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI):
• Ion được tạo ra trong pha dung dịch
• Thích hợp cho chất không bền nhiệt, chất khá phân cực, chất có
phân tử khối lớn
• Quá trình tạo ion: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc
ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại áp thế cao và sau
đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản.
Dưới tác dụng của
điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn
mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung
môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do
sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ dần thành những hạt
mang điện nhỏ hơn. Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa
vào bộ phận tách ion qua một cửa r
ất nhỏ, dung môi và khí N
2
bị
bơm hút ra ngoài. Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện
thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo
sát. Các chất có tính acid tạo ion âm ở pH cao, các chất có tính baz

tạo ion dương ở pH thấp
- 16 -

Hình 1.5: Kỹ thuật ion hóa phun điện tử
o Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI):
• Ion được tạo ra trong pha hơi
• Thích hợp cho chất không bền nhiệt, chất ít phân cực, chất có phân
tử khối nhỏ
• Quá trình tạo ion: phân tử chất phân tích và dung môi đi qua một lò
sấy, hóa hơi, các phân tử khí N
2
phun ra và đi vào vùng phóng điện
(corona discharge), hiện tượng ion hóa xảy ra:
Cơ chế tạo ion dương:
N
2
+ e
-
→ N
2
+
+ 2e
-

H
2
O + e
-
→ H
2

O
+
+ 2e
-
H
2
O + H
2
O
+
→ H
3
O
+
+
•
OH
M + H
3
O
+
→ MH
+
+ H
2
O
Cơ chế tạo ion âm: với những phân tử có H linh động, trong vùng
phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần
còn lại là một anion:

•
OH + M → (M-H)
-
+ H
2
O
- 17 -


Hình 1.6: Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển
o Kỹ thuật ion hóa quang hóa học ở áp suất khí quyển:
• Quá trình tạo ion: Kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật APCI nhưng
hỗn hợp khí hơi đi qua vùng chứa các tia photon của đèn Krypton
(hay UV) để tạo ion (thay vì vùng phóng điện)

Hình 1.7: Kỹ thuật ion hóa quang hóa học ở áp suất khí quyển
- 18 -

Hình 1.8:Phạm vi ứng dụng của các kỹ thuật ion hóa trong LC-
MS/MS
• Bộ phân tích ion (bộ phân tích khối lượng):
o Bộ tứ cực (Triple quad): Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực
song song. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa
dòng một chiều và điện thế tần số radio. Các tứ cực đóng vai trò là
một bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion
chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z.
Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua tứ cực.

Hình 1.9:Cấu trúc bộ phân tích khối Triple Quad
o Bộ phân tích bẫy ion (Qtrap): bao gồm một điện cực vòng với

nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột ở trên và ở dưới.
Các ion sau khi đi vào bẫy ion được bẫy lại cho đến khi một điện áp
tần số radio (Rf) được áp lên trên điện cực vòng, các ion khác m/z
trở nên không ổn định và sẽ đi về hướng đầ
u dò. Do điện áp Rf
khác nhau trong hệ mà thu được một phổ khối lượng đầu đủ. Các
ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự
khác nhau về m/z, đồng thời có thể thực hiện quá trình bắn phá để
- 19 -
thu được các mảnh con, từ đó phân tích theo m/z của ion con. Về
nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu để
thực hiện MS n lần, tuy nhiên thực tế chỉ có khả năng thực hiện
đến khối phổ 3 lần.
o Bộ phân tích thời gian bay (TOF-time of flight): dựa trên cơ sở gia
tốc các ion tới đầu dò với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng
năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thờ
i gian đi tới đầu
dò sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn do có vận tốc
lớn hơn, các ion lớn sẽ đi chậm hơn. Thời gian bay tới đầu dò của
một ion phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động
học của ion đó. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp
nhưng có thể phân tích không hạn chế khối lượng ion
•
Bộ phận phát hiện ion:
o Nguyên lý: tạo tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ
cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện do điện tích di
chuyển.
o Có 2 loại bộ phát hiện phổ biến: nhân electron và nhân quang điện
• Bộ phát hiện nhân electron: là đầu dò phổ biến, có độ nhạy cao.
Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron, các electron

thứ cấp
được dẫn tới các dinot tiếp theo và tạo ra các electron thứ
cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron
• Bộ phát hiện nhân quang cũng tương tự như thiết bị nhân electron,
các ion ban đầu đập vào một dinot tạo tạo ra các electron, nhưng
các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn photpho và giải
phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ
nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của kỹ
thuật này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên
loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.

- 20 -
1.6.3. Thiết bị LC-MS/MS (Shimadzu LC 20AD – AB Sciex
TripleQuad 5500)





Hình 1.10: Hệ LC-MS/MS sử dụng phân tích Acrylamide

Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu LC 20AD:
gradient áp suất cao, 2 bơm, 2 dòng dung môi, hệ thống tiêm mẫu tự
động
Nguồn ion hóa: 2 nguồn ion hoá ESI và APCI

Hình 1.11: Nguồn ion hóa Turbo-V
Hệ sắc kí lỏng Shimadzu
LC 20AD
Bộ điều khiển hệ thống và

xử lý số liệu
Khối phổ AB Sciex
TripleQuad 5500MS

- 21 -
Bộ phân tích khối: với tứ cực cong (Qurved LINAC Collision Cell)
buồng va chạm áp suất cao, tăng tốc ion xuyên qua buồng va chạm,
làm tăng tốc độ phân tích, loại bỏ hiệu quả phân tử không mang điện
nền, phù hợp với kỹ thuật UHPLC

Hình 1.12: Bộ phân tích khối của thiết bị Khối phổ AB Sciex TripleQuad
5500MS (với thiết kế mới Qurved LINAC Collision Cell)
*Một vài chế độ quét phổ sử dụng ở thiết bị Triple Quad
Chế độ quét phổ MRM-multiple reaction monitoring: Q1 chọn mảnh
ion mẹ [M+H]
+
, Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 giám sát một mảnh ion
con được chọn, chỉ ion con được chọn mới được phát hiện tại đầu dò. Độ
nhạy của chế độ quét MRM chính là khả năng bao nhiêu ion con được tạo
ra. Kỹ thuật này sẽ làm giảm nhiễu nền
Chế độ quét ion con-Product ion scanning: Q1 lựa chọn mảnh ion mẹ,
Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 bẫy và quét tất cả các ion con được phân
mảnh. Kỹ thuật này cho phép xác đị
nh các hợp chất có cùng thời gian rửa
giải.



- 22 -
1.7. Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử:

[2], [3], [5], [9], [12], [19], [20] ,[21], [22], [37]
Xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử là sự khẳng định bằng việc
kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương
pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose). Kết quả
của Xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử có thể đượ
c sử dụng để
đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Xác định giá trị sử
dụng của phương pháp thử là một phần không thể thiếu nếu muốn có
một kết quả phân tích đáng tin cậy.
Để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử cần dựa vào các thông
số sau:
1.7.1. Các thông số xác định giá trị sử dụng củ
a phương pháp thử:
-
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các
tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự,
tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh
được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không
có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có
cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả
n
ăng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất
cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.Tính đặc hiệu
thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích.
- Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc
phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác
định phân biệt rõ với các chấ
t khác thì phương pháp phân tích có tính
chọn lọc. Như vậy, tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu. Do các
phương pháp phân tích thường có nhiều chất cùng xuất hiện nên khái

niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn.
- Khoảng tuyến tính: là khoảng của đường thẳng thể hiện sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tín hiệu của thiết bị được thể
hiện qua hệ s
ố tương quan gần bằng 1 (0.995 cho đa số các chất phân tích)
- 23 -
- Giới hạn phát hiện của phương pháp: là nồng độ chất phân tích thấp nhất
có trong mẫu mà phương pháp có khả năng phát hiện được với độ tin cậy
là 99% khác biệt so với mẫu trắng
- Giới hạn định lượng: là mức nồng độ mà phương pháp cho kết quả định
lượng với độ tinh cậy nhất định
- Độ chính xác: là sự gần đúng giữa giá tr
ị kết quả thử nghiệm và giá trị
chấp nhận (giá trị thực). Độ chính xác được xác định thông qua 2 thông
số: độ đúng (truenesss) và độ chụm
• Độ đúng: là sự gần đúng giữa giá trị trung bình của một loạt thí
nghiệm với giá trị thực. Độ đúng thường được biểu diễn thông qua
độ chệch (bias)
o Độ chệch (bias): là sự lệch giữa giá trị trung bình của k
ết
quả thí nghiệm so với giá trị thực
• Độ chụm: là sự gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập thu
được dưới các điều kiện qui định. Độ chụm thường được tính bằng
độ lệch chuẩn của các kết quả kiểm nghiệm. Độ lệch chuẩn càng
lớn độ chụm càng kém.
• Độ lặp lại: là độ chụm đượ
c xác định dưới cùng điều kiện thí
nghiệm (cùng phòng thí nghiệm, cùng người thực hiện, cùng thiết
bị, …)
• Độ tái lặp trong phòng thí nghiệm: là độ chụm đươc thực hiện dưới

các điều kiện khác nhau trong cùng một phòng thí nghiệm (phương
pháp, người phân tích, môi trường…) trong một thời gian dài hợp
lý
• Độ thu hồi: là phần trăm nồng độ thực của chất phân tích thu hồi
được trong quá trình phân tích.
- Độ không đả
m bảo đo: là thông số đi kèm kết quả đo, đặc trưng cho độ
phân tán của các giá trị đo.


- 24 -
1.7.2. Mức chấp nhận cho các thông số trong xác định giá trị sử dụng của
phương pháp thử:
Bảng 1.5: Thông số cơ bản và mức chấp nhận theo tài liệu “Hướng dẫn
kiểm soát chất lượng trong phòng kiểm nghiệm” [1]

STT Thông số kỹ thuậtMức chấp nhận Ghi chú
1 Khoảng tuyến tính
RSD < 20% và R
2
>
0.99

2 Giới hạn định lượng < MRL RSDwR ≤ 20%
3 Ảnh hưởng của nền mẫu Giảm đến mức tối đa
Sử dụng chất bảo vệ,
kỹ thuật thêm
chuẩn…
4
Độ chọn lọc ( mức độ đáp

ứng của nền mẫu, hóa chất
và
m
ẫu kiểm soát)
< 30% tại LOQ
5
Độ thu hồi của phương
p
háp (%)-đơn cấu tử
80 - 120 RSDwr < 20%

Độ thu hồi của phương
p
háp (%)-đa cấu tử
60 - 140 RSDwr < 20%
6 Độ lặp lại_RSDwr (%) ≤ 20 Tại mỗi mức khảo sá
t
7
Độ tái lặp nội bộ PTN_
RSDwR (%)
≤ 20 Tại mỗi mức khảo sát
8 Giá trị mẫu trắng (blank)
< 30% giới hạn định
lượng công bố của
phương pháp thử

- 25 -
THỰC NGHIỆM
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ N
ỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu (Dụng cụ, thiết bị, hoá chất - chất chuẩn)
2.1.1. Dụng cụ
- Ống ly tâm nhựa 2ml, 50ml
- Giá đựng ống ly tâm nhựa 2ml, 50ml
- Micropipette: 10-100µl, 100-1000µl, 1000-10000µl
- Vial thủy tinh màu nâu 1.5ml
- Bình định mức 10ml, 25ml
2.1.2. Thiết bị
- Máy lọc nước siêu sạch Barnstead Easypure II
- Máy đồng nhất mẫu, tốc độ 3000 – 8000 vòng/phút
- Cân phân tích 4 số lẻ (độ nhạy 0,1 mg) Metler-Toledo
- Máy l
ắc ngang IKA HS 260 basic
- Máy lắc Vortex
- Máy ly tâm Universal 320R Hettich
- Máy đánh siêu âm
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hiệu Shimadzu
+ Bơm LC – 20AD XR

+ Autosampler SIL – 20AD XR
+ Degasser DGU – 20 A5
+ Interface CBM – 20A
+ Cột sắc ký phân tích: Inertsil ODS – 3V, 5 µm, 150 mm x 4,6 mm
- Đầu dò khối phổ 2 lần(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500
Turbo V source: kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI)
2.1.3. Hoá chất, chất chuẩn
Chất chuẩn:
- Acrylamide 99.5%, hãng sản xuất Fluka, mã đặt hàng 01696, số lô
1254876