Thu nhận và tinh sạch phytase ngoại bào từ nấm men sporobolomyces japonicus (ay070009)

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng
Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công
Nghệ Việt Nam, người đã đưa ra ý tưởng về đề tài này. Thầy luôn quan tâm,
hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn
thành tốt luận văn này.
Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng
như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.Hồ Chí
Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khóa
học này.
Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, chị Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên
cứu Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, đã quan tâm, giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Em xin cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh
Học, cùng quý thầy cô ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới, đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn quý
thầy cô.
Cảm ơn tất cả những người bạn thân thiết lớp cao học Hóa Sinh K17,
chúng ta đã cùng nhau vượt qua khó khăn và động viên nhau trong học tập.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành
cảm ơn ông bà, cha mẹ đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, dạy dỗ con. Gia
đình là điểm tựa, là niềm tin để con vươn lên.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 01 năm 2010.
Xin chân thành cảm ơn
Trịnh Phong Vân

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa
Mục lục
Lời cảm ơn
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Acid phytic 3
1.2 Phytate 4
1.3 Nguyên tố phospho 7
1.4 Giới thiệu về phytase
8

1.4.1 Danh pháp phytase 9
1.4.2 Phản ứng xúc tác của phytase 10
1.4.3 Các đối tượng tổng hợp phytase 11
1.4.4 Sự khác biệt các vi sinh vật sinh phytase 12
1.4.5 Đặc điểm phytase nấm men 14
1.4.5.1 Vị trí sản sinh phytase của nấm men 15
1.4.5.2 Các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 15
1.4.6 Con đường khử phosphoryl hóa phytate 18
1.4.7 Chế phẩm Myo-inositol 19
1.4.8 Phân loại Sporobolomyces japonicus 21
1.4.9 Ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi 21
1.4.10 Ứng dụng phytase trong thực phẩm 21
1.4.11 Tiềm năng trong ngành thủy sản 22
1.4.12 Định hướng tương lai 23
Chương 2: Vật Liệu & Phương Pháp: 24
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
2.1 Vật liệu: 24
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 24
2.1.3 Hóa chất và cách pha dung dịch hóa chất 24
2.1.3.1 Hóa chất 24
2.1.3.2 Cách pha dung dịch hóa chất 26
2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy và cách pha các môi trường
32
2.1.4.1 Môi trường hoạt hóa và giữ giống 32
2.1.4.2 Môi trường chọn lọc nấm men sinh tổng hợp phytase 32
2.1.4.3 Môi trường lên men sinh tổng hợp phytase 32
2.2 Các phương pháp sử dụng: 33
2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ phytase 33
2.2.1.1 Dựng đường chuẩn phospho 33
2.2.1.2 Xác định lượng phospho trong dung dịch nghiên cứu 34
2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein 35
2.2.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 36
2.2.4 Phương pháp điện di SDS PAGE 39
2.3 Phương pháp nghiên cứu
: 43
2.3.1 Hoạt hóa và giữ giống: 43
2.3.1.1 Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng 43
2.3.1.2 Bảo quản giống trên môi trường YPD 20% glycerol 43
2.3.2 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase 44
2.3.3 Thu nhận dịch chiết thô enzyme 44
2.3.4 Xác định hoạt độ phytase của các chủng nấm men có vòng
phân giải lớn - chọn chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất 44
2.3.5 Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase

cao nhất …………………………………………………… 44
2.3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy 45
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
2.3.7 Khảo sát tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men sinh
phytase 45
2.3.8 Tủa enzyme 45
2.3.8.1 Kết tủa bằng muối 45
2.3.8.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ 46
2.3.9. Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt độ
phytase 47
2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi lên hoạt độ phytase
47
2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng thời gian tủa lên hoạt độ phytase . 47
2.3.12 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 47
2.3.13 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 48
2.3.14 Khảo sát tính bền nhiệt của phytase 48
2.3.15 Khảo sát tính bền nhiệt và ổn định pH của phytase 48
2.3.16 Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ
phytase 48
2.3.17 Tinh sạch phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc
gel 48
2.3.18 Phương pháp xác định hằng số K
m
49

Chương 3: Kết Quả & Biện Luận 52
3.1 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase 52
3.2 Xác định hoạt độ phytase sơ bộ của các chủng nấm men có vòng phân

giải lớn từ đó chọn ra chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất 54
3.3. Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase cao nhất
56
3.4. Khảo sát thời gian nuôi cấy 57
3.5. Khảo sát tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men sinh phytase
59
3.6. Thu nhận protein enzyme bằng các tác nhân tủa 60
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
3.6.1 Tác nhân tủa là cồn 96
o
60
3.6.2 Tác nhân tủa là acetone 61
3.6.3 Tác nhân tủa là muối amonium sulfate 62
3.7. Ảnh hưởng của thời gian tủa lên hoạt độ phytase 64
3.8. Kiểm tra sự hiện diện của phytase bằng điện di SDS-PAGE 66
3.9 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 67
3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 70
3.11 Khảo sát tính bền nhiệt của phytase 72
3.12 Khảo sát tính bền nhiệt và ổn định pH của phytase 75
3.13 Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ phytase 75
3.14 Sắc ký tinh sạch enzyme : Sử dụng sắc ký lọc gel 79
3.15 Xác định hoạt độ tổng, hoạt độ riêng của phytase sau sắc ký, hiệu
suất thu hồi hoạt độ, hiệu suất thu hồi protein 81
3.16 Xác định hằng số K
m
phản ứng enzyme – cơ chất Na-phytate 82
3.17 Kiểm tra độ tinh sạch của phytase sau sắc ký – xác định trọng lượng
phân tử phytase của Sporobolomyces japonicus 85

Chương 4: Kết luận & Đề nghị 89
4.1 Kết luận 89
4.2 Đề nghị 90
Tài liệu tham khảo: 91
Phụ lục: 94








HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- BB : Bột bắp
- CPE : Chế phẩm enzyme
- EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid.
- ddE : Dung dịch enzyme
- HĐ : Hoạt độ
- HĐR : Hoạt độ riêng
- K
m
: Hằng số Michaelis
- MW : Molecular Weight (trọng lượng phân tử).
- OD : Mật độ quang

- ODt : Mật độ quang thử thật
- ODk : Mật độ quang thử không
- ODtbt : Mật độ quang trung bình thử thật.
- ODtbk : Mật độ quang trung bình thử không.
- ΔODtb : Trung bình thử thật trừ trung bình thử không
- P : Nguyên tố phospho
- [S] : Nồng độ cơ chất
- SDS : Sodium Dodecyl Sulphate.
- SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis
- TCA : Tricloroacetic acid.
- TEMED : N,N,N
’
,N
’
-tetramethylene ethylene diamine.
- t
o
op :
Nhiệt độ tối ưu
- pH
op
: pH tối ưu
- V : Vận tốc phản ứng
- YPD : Yeast extract Pepton Dextrose


HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1: pH và nhiệt độ tối ưu của các loài vi sinh vật 13
Bảng 1.2: Các nấm men sinh tổng hợp phytase 14
Bảng 1.3: Động học của phytase nấm men 18
Bảng 2.1: Pha dung dịch phospho chuẩn 26
Bảng 2.2: Pha đệm natri acetate pH 3,5-7,0 28
Bảng 2.3: Pha dung dịch ion kim loại và chất ức chế EDTA 29
Bảng 2.4: Pha đường chuẩn phospho 33
Bảng 2.5: Các bước xác định hàm lượng phospho 34
Bảng 2.6: Pha đường chuẩn albumin 35
Bảng 3.1: Những chủng nấm men có khả năng sinh
tổng hợp phytase 52
Bảng 3.2: Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật 55
Bảng 3.3: Hoạt độ phytase theo thời gian nuôi cấy 57
Bảng 3.4: Hoạt độ phytase theo tỉ lệ giống vi sinh vật. 59
Bảng 3.5: Hoạt độ phytase thu nhận bằng tác nhân tủa cồn 96
o
với các tỉ
lệ khác nhau 61
Bảng 3.6: Hoạt độ phytase thu nhận bằng tác nhân tủa acetone với các tỉ lệ
khác nhau 62
Bảng 3.7: Hoạt độ phytase thu nhận bằng tác nhân tủa muối amonium với
các tỉ lệ khác nhau 63
Bảng 3.8: So sánh hoạt độ phytase theo các tác nhân tủa 63
Bảng 3.9: Hoạt độ phytase theo thời gian tủa 65
Bảng 3.10: Khảo sát pH tối ưu của phytase 67
Bảng 3.11: Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 69
Bảng 3.12: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của phytase 71
Bảng 3.13: Khảo sát tính bền nhiệt của phytase 72
Bảng 3.14: So sánh hoạt độ phytase ngày thứ 1 và ngày thứ 67 75

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
Bảng 3.15: Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại và chất ức chế EDTA lên hoạt
độ phytase 76
Bảng 3.16: So sánh % hoạt độ phytase bị giảm khi tương tác với các ion kim loại và
chất ức chế EDTA ở nồng độ 1mmol/ml và 5mmol/ml 78
Bảng 3.17: So sánh hoạt độ phytase, hàm lượng protein trước và sau khi sắc ký-
Hiệu suất thu hồi 81
Bảng 3.18: Sự biến thiên của ΔOD theo nồng độ cơ chất và thời gian phản ứng 82
Bảng 3.19: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 83
Bảng 3.20: Các hằng số K
m
của phytase nấm men trên cơ chất là phytate 85
Bảng 3.21: Biến thiên trọng lượng phân tử các protein theo R
f
86
Bảng 3.22: Trọng lượng protein của phytase dựa vào giá trị R
f
87

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc acid phytic 3
Hình 1.2: Cấu tạo phân tử phytate. 6
Hình 1.3 (A,B): Ảnh hưởng của pH và các ion kim loại hóa trị II lên đặc
tính tự nhiên của phytate 7
Hình 1.4: Phản ứng xúc tác của phytase lên acid phytic 10
Hình 1.5: Các con đường khử phosphoryl hóa của IP
6
xúc tác bởi phytase 19
Hình 1.6: Các đồng phân inositol 20
Hình 2.1: Hệ thống sắc ký lọc gel của Bio-Rad. 37
Hình 2.2: Bộ dụng cụ điện di 40
Hình 2.3: Đồ thị của phương trình Michaelis-Menten 50
Hình 2.4: Đồ thị của phương trình Lineweaver-Burk 51
Hình 3.1: Vòng phân giải của các chủng sinh phytase trên môi trường Schopfer
Ca-phytate 54
Hình 3.2: Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật 55

Hình 3.3: Hoạt độ phytase theo môi trường nuôi cấy 56
Hình 3.4: Hoạt độ phytase theo thời gian nuôi cấy 58
Hình 3.5: Hoạt độ phytase theo tỉ lệ giống vi sinh vật 60
Hình 3.6: Hoạt độ phytase theo các tác nhân tủa 64
Hình 3.7: Biến thiên hoạt độ phytase theo thời gian tủa 65
Hình 3.8: Điện di đồ của phytase sau khi tủa với tác nhân cồn 66
Hình 3.9: Xác định giá trị pH tối ưu của phytase 68
Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 70
Hình 3.11: Biến thiên hoạt độ phytase theo nhiệt độ 74
Hình 3.12: Biến thiên hoạt độ phytase do sự tác động của các ion kim loại
ở nồng độ 1mmol/ml 76
Hình 3.13: Biến thiên hoạt độ phytase do sự tác động của các ion kim loại
ở nồng độ 5mmol/ml 77
Hình 3.14: Sắc ký đồ phytase của Sporobolomyces japonicus 80
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh

Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
Hình 3.15: Đồ thị của phương trình Lineweaver-Burk xác định K
m
của phytase 84
Hình 3.16: Biến thiên trọng lượng phân tử protein theo R
f
86
Hình 3.17: Điện di đồ phytase Sporobolomyces japonicus trên SDS-PAGE
sau sắc ký 87

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 1 Mở Đầu
MỞ ĐẦU

Khoảng 60-90% phospho có nguồn gốc từ thực vật (ngũ cốc, hạt dầu, cây họ
đậu, tồn tại ở dạng acid phytic hoặc phytate). Phytate là muối của acid phytic,
động vật không thể hấp thu được như heo, cá, những động vật thiếu enzyme
đường ruột cho sự khử phospho của phức hợp phytate.
Bên cạnh đó lượng phytate thải ra môi trường quá nhiều, thì sự hòa tan thấp

của phosphate và quá trình chuyển nhanh chóng của nó thành dạng không tan đã
làm cho nguyên tố này trở thành một chất dinh dưỡng tăng trưởng hạn chế trong
hệ sinh thái nước ngọt.
Do đó các nhà khoa học và các nhà doanh nghiệp làm việc trong lĩnh vực
bảo vệ môi trường, dinh dưỡng cho động vật và sức khỏe cho con người đã dần
quan tâm đến enzyme phytase. Phytase được xếp vào nhóm phosphohydrolase-
enzyme thủy phân gốc phospho, xúc tác giải phóng phospho từ phytate, là thành
phần phospho hữu cơ chủ yếu trong hạt và ngũ cốc. Enzyme này được bổ sung
vào thức ăn cho động vật, và tiềm năng của nó trong việc cung cấp dinh dưỡng
cho con người và trong lĩnh vực khác như nuôi trồng thủy sản. Các xu hướng
thương mại gần đây cho thấy rõ tầm quan trọng của phytase như là một chất bổ
sung vào trong thức ăn cho gia súc.
Nghiên cứu phytase tuy không phải là mới mẻ, tuy nhiên việc tìm kiếm ra
các đối tượng mới có khả năng tổng hợp phytase sẽ tạo nên nguồn phong phú và
tạo điều kiện để nghiên cứu sâu những đặc tính sinh hóa của phytase từ các
nguồn khác nhau.
Nghiên cứu phytase nấm men có thể quan trọng với nhiều nguyên nhân. Do
phytase nấm mốc đặc biệt là Aspergillus spp, đã được nghiên cứu khá nhiều do
ứng dụng của chúng trong bổ sung vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng
phospho và các khoáng chất. Tuy nhiên, trong thực phẩm cho con người, thì
phytase không có sẵn. Nhờ vào khả năng hầu như không gây bệnh, nấm men
được chọn làm nguồn sản xuất phytase để ứng dụng trong thực phẩm cho con
người.

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 2 Mở Đầu
Và trong nội dung của đề tài này chúng tôi nhắm đến những vấn đề như sau:
 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase
 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận phytase từ nấm
men

 Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận và tinh sạch phytase
 Nghiên cứu các đặc tính của phytase tinh sạch


HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 3 Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Acid phytic
Acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6, hexakisphosphate) là nguồn ban đầu của
inositol và dự trữ phosho trong các hạt thực vật góp phần vào 70% tổng lượng
phospho. Hai đặc điểm chủ yếu của acid phytic mà đóng vai trò đặc biệt trong thực
phẩm cho con người và trong thức ăn gia súc là : (1) Đối với động vật có dạ dày
đơn thì acid phytic chỉ bị phân cắt nhẹ trong dạ dày do đó trong các thức ăn cho
động vật cần thiết phải bổ sung phosphate vô cơ [9]. (2) Khả năng liên kết mạnh
của acid phytic với các ion kim loại, protein, acid amin dẫn đến làm giảm tính năng
sinh học của các chất dinh dưỡng như các chất khoáng (Ca
2+
, Zn
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
,
Fe
2+
/
3+
), các protein và các acid amin. Thành phần acid phytic cao trong thức ăn
chăn nuôi thì thường phải được bổ sung với phospho vô cơ, tuy nhiên điều này là

nguyên nhân gây nên sự tăng lượng phosphate và hậu quả là lượng phosphate tăng
trong các dòng nước (kênh, sông, suối…). Do đó, bổ sung phytase thương mại ngày
càng trở nên phổ biến và sẽ làm giảm bớt nhu cầu bổ sung phospho vô cơ cũng như
giảm bớt lượng phosphate gây ô nhiễm môi trường.[21], [26], [32]












Hình 1.1: Cấu trúc acid phytic, công thức
C H O P [32]
6 18 24 6

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 4 Tổng quan tài liệu
Ngoài ra acid phytic còn có một số lợi ích như sau:
- Acid phytic có chức năng quan trọng trong cơ thể như là chất ức chế sự sản
sinh các gốc hydroxyl tự do và kháng sự oxy hóa do đó nó được xem như là chất
chống ung thư.
- Nó được cho rằng IP
6
làm tăng các tế bào lymphocyte để diệt các tế bào ung
thư.

- Bên cạnh đó, một số báo cáo cho thấy acid phytic ức chế sản sinh ra amonia
(NH
3
) do sự kết hợp các phân tử sắt.
- Giúp những người bệnh mắc chứng đái tháo đường cải thiện tình hình sức
khoẻ. Do tinh bột sẽ khó bị tiêu hoá khi kết hợp với acid phytic. Từ đó làm giảm
lượng đường glucose có trong máu.
- Acid phytic được sử dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn để làm giảm thời
gian của quá trình lên men thực phẩm và ngăn chặn sự thay đổi những đặc tính hay
màu sắc và sự oxi hoá thức ăn và rượu. Vì vậy, nó có chức năng kìm hãm mạnh.
Chính vì những lợi ích đó mà acid phytic đã được sử dụng rộng rãi trong ngành
công nghiệp. Trong quá trình sản xuất acid phytic được thêm vào như một chất bảo
quản. [32]
Biến dưỡng của acid phytic.
Trong ngũ cốc, phospho ban đầu (acid phytic) được lưu trữ trong thể vùi ở dạng
muối hỗn hợp bên trong không bào lưu trữ protein.
Acid phytic tích lũy trong hạt trong thời gian ngắn sau khi nở hoa và kéo dài đến
lúc hạt trưởng thành. Trong suốt thời gian này, sự phát triển của thực vật có lẽ đối
mặt với những thay đổi do những điều kiện như: mưa, hạn hán, nhiệt độ cao, mầm
bệnh. Mỗi inositol – phosphate – kinase (IPK) có một giới hạn rộng với cơ chất và
có bằng chứng rằng IPKs trong gạo và đại mạch có hoạt tính phosphatase và
isomerase.
1.2 Phytate
Phytate (myo inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate ), là muối của acid phytic,
một hợp chất tự nhiên được hình thành trong suốt quá trình trưởng thành của hạt
thực vật và các loại hạt lương thực.
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 5 Tổng quan tài liệu
Phytate được tổng hợp ở mạng lưới nội chất trước khi lắng đọng trong các thể
protein, phytate được dự trữ trong các thể cầu là các thể vùi trong các thể protein.

Khoảng 60-80% trọng lượng khô của thể cầu này là phytate. Trong các thể cầu, thì
phytate được tìm thấy là dạng phytin, phức hợp của các cation K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
và
các protein. Trong hầu hết thực vật một lá mầm, thì các thể protein được tìm thấy
chủ yếu trong lớp alơron của hạt.[9]
Trong các hạt nghỉ, phytate hiện diện 60-90% tổng phospho. Chỉ một phần rất
nhỏ myo-inositol phosphate tồn tại như myo-inositol penta và tetrakisphosphate.
Bên cạnh đó, phytate được cho là dự trữ cation, nhóm phosphoryl năng lượng cao,
và có ái lực cao với sắt tự do.Vì phytate là hợp chất có nguồn gốc từ hạt thực vật,
hạt cây lương thực nên lượng phytate được hấp thụ hàng ngày có thể lên đến
4500mg. Trung bình, hằng ngày lượng phytate được hấp thụ khoảng 2000-2600 mg
đối với thực phẩm từ rau quả trong khẩu phần ăn của cư dân các nước đang phát
triển.
Phytate có một giới hạn pH rộng như là ion âm mạnh kết hợp với các thành phần
thực phẩm có ion dương như các chất khoáng, protein.
Phytate hình thành các phức hợp với các cation kim loại hóa trị II, III. Độ ổn
định và độ hòa tan của phức phytate-kim loại phụ thuộc vào mỗi cation, giá trị pH,
tỉ lệ phytate-cation và sự hiện diện của các phức hợp khác trong dung dịch.
Thực vậy, một cation có thể liên kết với một hoặc nhiều hơn nhóm phosphate
của mỗi phân tử phytate hoặc cầu nối hai hay nhiều hơn phân tử phosphate. Hầu hết
các phytate có xu hướng hòa tan tốt hơn từ pH thấp đến pH cao. Độ hòa tan của
phytate tăng tại giá trị pH thấp hơn từ 5,5-6,0 đối với Ca
2+
, 7,2-8,0 đối với Zn
2+.

Về
đặc điểm sinh lý tự nhiên của phytate là phytate có thể tồn tại ở dạng không có kim
loại hoặc ở dạng phức hợp kim loại-phytate phụ thuộc vào pH của dung dịch và
nồng độ cation kim loại. [14]
Ở pH acid, sự proton hóa H
+
của nhóm phosphate của phytate sẽ sinh ra dạng
không kết hợp với kim loại.
Ở pH trung tính, sự khử H
+
của nhóm phosphate của phytate làm tăng ái lực cho
các cation kim loại hóa trị II và do đó hình thành dạng phức kim loại-phytate với
các cation kim loại hóa trị II hầu hết là Mg
2+
, Ca
2+
.
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 6 Tổng quan tài liệu
Trong phức hợp kim loại-phytate, các cation hóa trị II với bán kính ion lớn như
Ca
2+
(0,99 Å) và Sr
2+
(1,12 Å), liên kết với 2 nguyên tử oxi từ nhóm phosphate của
phytate theo kiểu răng kép. Tuy nhiên, các cation hóa trị II với bán kính nhỏ như
Mg
2+
(0,65 Å), Fe
2+

(0,74 Å) và Zn
2+
(0,71 Å), liên kết với 2 nguyên tử oxi theo
kiểu đơn. Do vậy, xu hướng thường hình thành phức hợp kim loại dạng kép đối với
các cation kim loại hóa trị II có bán kính ion lớn.
Điều quan tâm chủ yếu đến sự hiện diện của phytate trong thực phẩm là tác
động xấu của nó đến sự hấp thụ các chất khoáng như Zn
2+
, Fe
2+
/
3+
, Ca
2+
, Mg
2+
,
Mn
2+
, và Cu
2+
. Đặc biệt sự thiếu hụt sắt và kẽm là do kết quả của việc hấp thụ lượng
phytate cao.[19]


Hình 1.2: Cấu tạo phân tử phytate [34]

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 7 Tổng quan tài liệu


pH kiềm và các ion
kim lo
ạ
i
pH acid
Phytate không kim loại Phức hợp phytate-kim loại
Hình 1.3 (A,B): Ảnh hưởng của pH và các cation kim loại hóa trị II lên đặc
tính tự nhiên của phytate. [19]
Hình A: Phytate tồn tại dạng không có kim loại hoặc phức hợp phytate-kim loại tùy
thuộc vào pH và các cation kim loại hóa trị II. Tại pH kiềm và nồng độ cation cao
thì hình thành phức hợp phytate-kim loại.
Hình B: Các cation kim loại liên kết với nhóm phosphate của phytate phụ thuộc
vào bán kính ion của cation kim loại. Sự hình thành nên phức hợp kim loại dạng
răng kép thường xảy ra đối với các cation kim loại có bán kính lớn.
1.3 Nguyên tố phospho
Phospho (P) là một nguyên tố trong tự nhiên đóng vai trò then chốt trong các
phản ứng sinh hóa. Nó là thành phần thiết yếu của vật liệu di truyền (DNA, RNA)
trong tất cả các tế bào. Liên quan đến các phản ứng chuyển hóa năng lượng ở dạng
ATP, ADP, và nó cũng hiện diện trong các phospholipid.
Mặc dù không có mặt trong các chuỗi acid amin, thành phần xây dựng nên các
protein nhưng nó góp phần quan trọng trong sinh tổng ATP của chúng. Bên cạnh
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 8 Tổng quan tài liệu

đó, nó cũng đóng vai trò quan trọng trong quang tổng hợp, hô hấp, oxy hóa khử,
truyền tín hiệu, biến dưỡng cacbonhydrate và cố định nitơ. Do đó “không có sự
sống nào mà không cần đến P”. Tuy nhiên P thiếu trong chu trình tuần hoàn như
chu trình Cacbon, chu trình Nitơ và kết quả là trong tự nhiên sự vận động P thì
chậm. Ngoài ra, sự hòa tan thấp của phosphate và quá trình chuyển nhanh chóng
của nó thành dạng không tan đã làm cho nguyên tố này trở thành một chất dinh
dưỡng tăng trưởng hạn chế trong hệ sinh thái nước ngọt.
Khoảng 20-85% phospho trong đất nông nghiệp tồn tại ở dạng hữu cơ, gồm các
ester inosiol phosphate, phospholipid, acid nucleic, phosphate liên kết với glucose,
các dẫn xuất của acid phosphoric cũng như phytate. P có xu hướng trở thành
nguyên tố tăng trưởng hạn chế trong đất trồng và trong hệ thống nước. Trên toàn
cầu, 70% đất trồng có cả đất acid và có cả đất bazơ và trong những loại đất này, thì
P ở dạng phức hợp rất khó cho thực vật sử dụng. Khi P ở dạng phức hợp hữu cơ thì
nó có thể tương tác với các cation hóa trị II, III ở trong đất, và ở dạng này thì rễ rất
khó mà hấp thu được, mặc dù nó dư thừa trong đất. Trong các con sông, ao hồ, P có
thể là nguyên nhân gây nên sự phát triển các loại tảo, điều này khiến cho các nguồn
nước bị ô nhiễm.
Thực vật chỉ có thể sử dụng P từ dạng vô cơ chỉ sau khi có sự thủy phân cầu nối
ester C-O-P bởi phosphatase sẽ giải phóng ra P dạng vô cơ. Do đó phosphatase rất
quan trọng cho sự dinh dưỡng ở thực vật sử dụng P.[15]
1. 4 Giới thiệu về phytase
Trong vài thập kỷ gần đây, các nhà khoa học và các nhà doanh nghiệp làm việc
trong lĩnh vực bảo vệ môi trường, dinh dưỡng cho động vật và sức khỏe cho con
người đã dần quan tâm đến enzyme phytase. Phytase được xếp vào nhóm
phosphohydrolase-enzyme thủy phân gốc phospho, xúc tác giải phóng phospho từ
phytate, là thành phần phospho hữu cơ chủ yếu trong hạt và ngũ cốc. Enzyme này
được bổ sung vào thức ăn cho động vật, và tiềm năng của nó trong việc cung cấp
dinh dưỡng cho con người và trong lĩnh vực khác như nuôi trồng thủy sản.[15]
Các xu hướng thương mại gần đây cho thấy rõ tầm quan trọng của phytase như
là một chất bổ sung cho thức ăn cho gia súc.

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 9 Tổng quan tài liệu
Phosphohydrolase (ví dụ như acid phosphatase và phytase) là những enzyme
phá vỡ liên kết ester C-O-P và cung cấp phospho vô cơ sẵn có từ những thành phần
hữu cơ khác nhau của phospho như phytate. Những enzyme này có giá trị đáng kể
trong việc làm giảm ô nhiễm phospho. [23]
1.4.1 Danh pháp phytase
Phytase (myo-inositol hexaphosphate phosphohydrolases) thuộc phân nhóm acid
phosphatase xúc tác thủy phân acid phytic (IP
6
) hoặc phytate tạo nên các ester
inositol phosphate thấp hơn và phospho vô cơ.
Ban đầu hai lớp phytase được phân loại bởi IUPAC-IUB vào năm 1975, 3-
phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26), dựa vào vị trí chuyên biệt thủy
phân phytate ban đầu trong vòng cacbon của inositol. Phytase của vi sinh vật, đặc
biệt là phytase có nguồn gốc từ nấm mốc (EC 3.1.3.8) thường cắt nhóm phosphate ở
cacbon C
1
hoặc C
3
của vòng inositol (Dạng D và L) và được gọi là 3-phytase. Còn
phytase (EC 3.1.3.26) tác động phân cắt tại C
6
và được gọi là 6-phytase chủ yếu ở
thực vật. [18]
Dựa vào hoạt động của pH, thì phytase được phân loại thành 2 lớp chính:
• Histidine acid phosphatase(HAps)
• Alkaline phytases (APs).
Tuy nhiên người ta quan tâm hơn đến acidic phytase do ứng dụng của nó trong
thức ăn chăn nuôi và cơ chất đặc hiệu của nó rộng hơn cơ chất của alkaline phytase.

Các phytase có các cấu trúc và cơ chế xúc tác khác nhau, và kết quả là chúng được
phân loại thành histidine acid phosphatase (HAPs), β-propeller phytase (BPP) và
purple acid phosphatase (PAP) dựa vào những motif vị trí hoạt động của chúng.
Giữa những phytase này thì người ta nghiên cứu HAPs rộng rãi hơn, chúng có vị trí
hoạt động chuyên biệt một motif 8 peptide bảo tồn RHGXRXP và hoạt động xúc
tác của dipeptide HD. [10]
Khoảng 60-90% phospho có nguồn gốc từ thực vật (ngũ cốc, hạt dầu, cây họ
đậu), chúng tồn tại ở dạng acid phytic hoặc phytate. Phytate là muối của acid
phytic, động vật không thể hấp thu được như heo, cá, những động vật thiếu enzyme
đường ruột cho sự khử phospho của phức hợp phytate. Acid phytic cũng được cho
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 10 Tổng quan tài liệu
rằng là một nhân tố ngăn cản dinh dưỡng, do nó có khả năng kìm hãm các cation đa
hóa trị, mà những khoáng chất này không có sẵn trong cơ thể động vật. Phytase
(myoinositol hexakisphosphate) thuộc họ histidine acid phosphatase, tác động hiệu
quả trong sự thủy phân phytate sinh ra myoinositol và phosphate vô cơ. Một số
phytase không có khả năng thủy phân phytate hoàn toàn và có lẽ phải thay enzyme
khác hoặc bổ sung enzyme khác để làm tăng nhanh quá trình thủy phân, bao gồm
acid phosphatase thuộc họ histidine acid phosphatase. Mặc dù acid phosphatase
không có khả năng thủy phân phytate nhưng nó hỗ trợ phytase trong quá trình làm
tăng nhanh sự phóng thích phosphate từ các cấu trúc myoinositol phosphate thấp
hơn. [16],[18],[20]
1.4.2 Phản ứng xúc tác của phytase
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate 3- và 6-phosphohydrolase; EC 3.1.3.8
và EC 3.1.3.2.6) xúc tác thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (phytic acid, Ins
P
6
) giải phóng phosphate vô cơ (P
i
), lượng thấp ester myo-inositol phosphate (Ins P

5

đến Ins P
1
) và trong một số trường hợp thủy phân giải phóng ra myo-inositol.
Phytase được sản sinh ra từ các sinh vật như: thực vật, động vật, nấm mốc, vi
khuẩn, và nấm men.


Hình 1.4: Phản ứng xúc tác của phytase lên acid phytic [15]
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 11 Tổng quan tài liệu
1.4.3 Các đối tượng tổng hợp phytase
Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng: phytase được tổng hợp ở nhiều đối tượng khác
nhau: thực vật, các mô động vật và đặc biệt là vi sinh vật
Phytase thực vật
Trong thực vật phytase chủ yếu được tìm thấy trong các hạt thực vật. Tuy nhiên
chỉ có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo và từ các loại
đậu như đậu nành, đậu xanh…Phytase cũng được tìm thấy trong mù tạt, khoai tây,
củ cải, rau diếp và phấn hoa Huệ Tây. Suzuki và cộng sự đã sản xuất được chế
phẩm phytase đầu tiên từ cám gạo và cám mì. [9], [11]
Phytase động vật
Kết quả các nghiên cứu cho thấy: phytase được tìm thấy ở thận và máu dê, trong
máu các động vật xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển. Đồng
thời, phytase cũng hiện diện trong đường tiêu hoá của nhiều loài động vật như
đường ruột của chuột, heo, cừu, bò, gà, dê và cả ở người. Tuy nhiên, phytase trong
hệ ruột động vật không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hoá phytate. Đặc
biệt, phytase từ ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase từ ruột chuột
và không có ý nghĩa trong việc tiêu hoá phytate, phytate được tiêu hoá trong hệ
thống tiêu hoá người nhờ lượng phytase có trong thực phẩm.

Động vật nhai lại có thể tiêu hoá được phytate nhờ hoạt động của phytase được
sản xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Lượng phosphate vô cơ giải phóng ra được
cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng.[22]
Phytase vi sinh vật
Vi khuẩn
- Có nhiều nghiên cứu khác nhau đã cho thấy: rất nhiều vi khuẩn có khả năng
sinh phytase thuỷ phân hợp chất phytate giải phóng phosphate vô cơ như E.coli,
B.subtilis, Aerobacter aerogegnes, các chủng Pseudomonas. Phytase được tổng hợp
ở cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Phytase từ các vi khuẩn gram âm là protein
nội bào, ngược lại, phytase từ các vi khuẩn gram dương là protein ngoại bào. Mặc
dù, phytase được phát hiện nhiều ở vi khuẩn nhưng trong số đó, có rất ít phytase
được đưa vào sản xuất. Bởi vì, sản lượng enzyme thấp và pH tối ưu cho hoạt động
của phytase là pH trung tính và pH kiềm. Trong khi đó quá trình tiêu hoá thức ăn
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 12 Tổng quan tài liệu
xảy ra ở pH acid. Do đó, phytase từ vi khuẩn bị hạn chế sử dụng trong chế biến thức
ăn chăn nuôi. [5], [9]
Nấm mốc
- Hoạt tính phytase tìm thấy hầu hết trong các nấm mốc như Aspergillus
terreus, Asp.ficuum, Asp.niger. Hầu hết nấm mốc đều sinh phytase ngoại bào.
ngược với vi khuẩn, các chế phẩm phytase được sử dụng rộng hơn. Vì phytase
được sản xuất từ nấm mốc có sản lượng cao và chịu được pH acid, đáp ứng được
những yêu cẩu tiên quyết khi thêm vào thức ăn.
Nấm men
- Đối với nấm men, phytase được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau:
Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Rhodotorula rubra, Arxula
adeninivorans, Pichia spartinae và rất nhiều loài khác.
1.4.4 Sự khác biệt các vi sinh vật sinh phytase
Một số gen của phytase và các protein được tìm thấy ở vi sinh vật bao gồm: vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc. Phytase của nấm mốc Aspergillus niger được mã hóa

bởi một phân đoạn 1,4kb DNA và trọng lượng phân tử là 80kDa với 10 vị trí N-
glycosylation. Trọng lượng phân tử trung bình của phytase vi khuẩn nhỏ hơn
phytase của nhóm nấm mốc (40-55 so với nấm mốc là 80-120kDa). Chủ yếu là khác
nhau về sự glyco giải. Trọng lượng phân tử của phytase thực vật được phân tách từ
bột mì, bột bắp, đại mạch, yến mạch từ 47-76kDa. [19]
Vi khuẩn Bacillus thì tất cả phytase có hoạt tính cao nhất ở pH acid do đó nó
hoạt động hiệu quả trong dạ dày. Một điều lưu ý rằng Bacillus sản sinh phytase
dường như khác xa với những vi sinh vật sinh phytase khác. Hầu hết phytase thuộc
lớp histidine acid phosphatase có một motif 8 peptide vị trí hoạt động bảo tồn
RHGXRXP và dipeptide HD hoạt động xúc tác. Hai chủng Bacillus sinh phytase
được xác định và tạo dòng bộ gen của chúng. Cả 2 gen này không có trình tự giống
với histidine acid phosphatase hoặc các phosphatase khác. [16]
Ngoài ra, Bacillus sinh phytase khác xa với các phosphatase khác vì chúng có
pH tối ưu tại pH 7,0-8,0 và cấn thiết ion Ca cho hoạt động của chúng. Acid phytic
trong thức ăn chăn nuôi thường ở dạng phức hợp với cation hóa trị II là Ca
2+
. Vì
điều kiện pH trung tính trong ruột non thì acid phytic sẽ chuyển thành dạng kết hợp
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 13 Tổng quan tài liệu
Ca-phytate, cơ chất chính của Bacillus sinh phytase. Alkaline phytase từ Bacillus
thì khá ổn định ở khoảng nhiệt độ từ 80-95
o
C.
Trong khi đó Escherichia coli: phytase có pH rất hẹp với pH tối ưu là 4,5 hầu
như không có hoạt tính ở pH 6,0
Hầu hết phytase có nhiệt độ tối ưu ở 44-60
o
C. Trái lại, phytase từ A.fumigatus và
B.amyloliquefaciens có nhiệt độ tối ưu ở 70

o
C, phytase của A.fumigatus hoạt động
trong khoảng pH từ 2,5-8,5 và duy trì 80% hoạt tính trong khoảng pH từ 4,0-7,3.
[23],[24]
Bảng 1.1: pH và nhiệt độ tối ưu của các loài vi sinh vật [23]
Loài vi sinh vật pH Nhiệt độ
Aspergillus niger NRRL 3135 2,2; 5,0-5,5 58
A.niger IIIAn/8 2,7; 5,5 -
A.niger 92 5,0 55
A.oryzae
5,5 50
A.terrrus
4,5 70
A.carneus
5,6 40
A.carbonarius
4,7 53
Rhizopus oligosporus
4,5 55
Klebsialla sp.
6,0 37
Klebsialla aerogenes
4,5 -
K.oxytoca MO-3 5,0-6,0 55
K.terrigena
5,0 58
Penicillium caseoicolum
3,0 45
Neurospora sp.
5,0-6,0 60

Aerobacter aerogenes
4,0-5,0 45-50
Citrobacter freundii
2,7; 5,0 52
Escherichia coli
4,5 -
Bacillus subtilis
7,0-7,5 -
B.subtilis var.nano
6,0-6,5 60
Schwannipmyces castellii
4,4 77
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ 14 Tổng quan tài liệu
1.4.5 Đặc điểm phytase nấm men
Nhiều nghiên cứu cho thấy vai trò của nấm men về khả năng phân hủy phytate
Lambrenchts và cộng sự (1992) đã sàng lọc ra 21 chủng nấm men có khả năng thủy
phân phytate, và trong các chủng này thì Schwanniomyces castellii CBS 2863 có
hoạt tính cao nhất. Nghiên cứu trong hàng trăm loài nấm men sinh phytase ngoại
bào thì Pichia spartinae có hoạt tính phytase cao nhất ở nhiệt độ tối ưu là 75-80
o
C,
pH 3,6-4,5 và P.rhodanensis thì hoạt tính phytase cao nhất ở nhiệt độ tối ưu là 70-
75
o
C , và pH 4,5-5,0. Báo cáo cho thấy các loài nấm men này là nguồn gen phong
phú cho khả năng chịu nhiệt của phytase. Các loài nấm men đỏ cũng được nghiên
cứu và báo cáo cho thấy là có khả năng sinh phytase như Rhodotorula gracilis,
Arxula adeninivorans, P.anamala và Candida krusei WZ-001. Gần đây có báo cáo
về khả năng sinh phytase của các nấm men ở biển. [16]

Bảng 1.2: Các nấm men sinh tổng hợp phytase [16]
Nấm men Vị trí Tác giả
Aruxula adeninivorans
Ngoại bào Sano et al., 1999
Candida spp
Ngoại bào Nakamura et al., 2000
Candida krusei
Nội bào Quan et al., 2001
Crypotococcus sp
Ngoại bào Greenwood et al., 1977
Kluyveromyces lactis
Ngoại bào Nakamura et al.,2000
Pichia anomala
Ngoại bào Nakamura et al.,2000
P. anomala
Nội bào
Vohra và Satyanarayana,
2001

P. rhodanensis
Ngoại bào
Nakamura et al., 2000

P. spartinae
Ngoại bào Nakamura et al., 2000
Rhodotorula gracilis
Nội bào Bindu et al., 1998
Saccharomyces cerevisiae
Nội bào Howson and Davis, 1983

HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh