Xây dựng mô hình và thử nghiệm điều trị bệnh xơ hóa gan bằng liệu pháp tế bào gốc trên chuột nhắt trắng (mus musculus var. Albino)

LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên con xin cảm ơn Bà nội, Ba Me, O Kim đã ngày đêm hy sinh lặng lẽ,
dạy con biết vượt qua gian khổ để trưởng thành. Em xin cám ơn Anh Hai đã tin
tưởng, động viên em trên bước đường em đi.
Cho tôi được bày tỏ lòng ngưỡng mộ và chân thành biết ơn Thầy BS.CKII. Trần
Minh Thông, người đã truyền cho tôi niềm tin yêu khoa học, chu đáo tận tình giúp
tôi tháo gỡ những vướng mắc trong thời gian nghiên cứu và tiến hành luận văn.
Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Phan Kim Ngọc. Thầy luôn tạo mọi điều
kiện tốt nhất, quan tâm, động viên và giúp đỡ để tôi tiến hành nghiên cứu của mình.
Tôi cũng đã rất may mắn nhận được sự giúp đỡ của TS. Lê Kim Hòa và TS. Đỗ
Minh Sĩ tạo cho tôi nhiều cơ hội để báo cáo bảo vệ luận văn này.
Tôi đặc biệt rất cảm ơn bạn Ngô Duy bình đã đồng hành với tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài và viết luận văn. Cám ơn Bình đã luôn giúp đỡ, quan tâm,
chia sẻ với tôi những khó khăn, niềm vui, nỗi buồn trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Phạm Văn Phúc, anh Lê Thành Long đã giúp đỡ và
cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích.
Cảm ơn bạn Trương Hải Nhung, Đặng Thị Tùng Loan, Trần Thị Như Mai, Nguễn
Thị Diệu Hằng, em Nguyễn Thành Trung, Phạm Quốc Việt, Huỳnh Nhã Vân, Lê
Ngọc Châu đã chia sẻ, giúp đỡ tôi rất nhiều.
Cuối cùng tôi xin cám ơn tất cả các bạn bè, đồng nghiệp trong PTN Nghiên cứu và
Ứng dụng Tế bào gốc đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 09 năm 2010

Trần Hồng Diễm

1




Trần Hồng Diễm Mở đầu

MỞ ĐẦU
NGUYÊN NHÂN TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU [23] [25] [42] [48]
Theo thống kê của National Center for Health Statistics (2006) xơ gan và suy
gan mạn là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các quốc gia trên
thế giới, phổ biến đứng hàng thứ 12 ở Hoa Kỳ năm 2002, với 27,555 trường hợp tử
vong (9,2/100,000 người). Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến xơ gan chẳng hạn như
tiếp xúc với hóa chất công nghiệp, uống rượu hoặc nhiễm siêu vi B, C trong thời
gian dài. Khoảng 70,000 công nhân ở 15 nước Châu Âu (CAREX, 1990-1993);
100,000 công nhân ở Mỹ (NOES, 1997) có khả năng phơi nhiễm với CCl4. Theo
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao, với tỷ lệ 15 -
20% dân số mang mầm bệnh viêm gan siêu vi B, khoảng 20% trường hợp viêm gan
B chuyển thành xơ gan. Tổn thương ống mật cũng có thể gây xơ gan, như sự tắc
ống mật cơ học, bệnh viêm xơ gan do tắc mật nguyên phát (primary bliary cirrhosis)
và viêm xơ chai đường mật nguyên phát (primary sclerosing cholangitis) (Peter
Fickert và cộng sự, 2007).
Hiện nay, ở Việt Nam điều trị bệnh xơ gan ở giai đoạn sớm, chủ yếu là dùng
các thuốc chống xơ như Colchicine, Corticoids (trong viêm gan tự miễn), và một số
thuốc khác đang nghiên cứu (HOE 007). Đối với xơ gan nặng, các tế bào gan bị
hoại tử cao dẫn tới suy chức năng gan thì sự điều trị chỉ là giải quyết các biến chứng
của xơ gan như cổ trướng, tăng huyết áp cửa gan…
Biện pháp tối ưu và là hy vọng duy nhất đối với bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn
muộn là cấy ghép gan mới. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là hiếm

nguồn gan hiến tặng, chi phí cao và phải dùng thuốc ức chế miễn dịch để tránh thải
loại. Năm 2005, chỉ có khoảng 1/3 trong danh sách 17,000 người chờ ghép gan
được cấy ghép gan (Maggie H. và cộng sự, 2006). Vì vậy các nhà nghiên cứu trên
thế giới đang gấp rút tìm ra các phương pháp điều trị mới. Trong đó, liệu pháp tế
bào gốc đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều nước và cho thấy tiềm năng hứa
2




Trần Hồng Diễm Mở đầu

hẹn phục hồi chức năng gan (Isao Sakaida, 2006; M.T. Abdel Aziz và cộng sự,
2007; P. Burra và cộng sự, 2008; Scott V. Perryman và cộng sự, 2008 ).
Xuất phát từ tính cấp thiết của đề tài, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xây dựng mô
hình và thử nghiệm điều trị bệnh xơ hóa gan bằng liệu pháp tế bào gốc trên
chuột nhắt trắng (Mus musculus var. Albino).
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xây dựng thành công mô hình xơ hóa gan trên chuột nhắt trắng bằng hóa chất.
- Đánh giá hiệu quả và vai trò của tế bào gốc trung mô trong điều trị xơ hóa gan
trên chuột.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nội dung 1: Tạo mô hình xơ hóa gan chuột bằng CCl4 liều 0,8 ml/kg trong 8
tuần.
- Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả gây xơ hóa gan của CCl4 liều 0,8 ml/kg, dựa trên
các chỉ tiêu:
1. Xét nghiệm sinh hóa (hoạt độ ALT, AST).
2. Đánh giá mô học (nhuộm hematoxylin và eosin).
3. Đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin 1,
ecto-5’-nucleotidase).

- Nội dung 3: Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột.
- Nội dung 4: Thu nhận quần thể tế bào đơn nhân tủy xương chuột.
- Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả điều trị xơ hóa gan sau 3 tuần ghép tế bào gốc
trung mô và quần thể tế bào đơn nhân tủy xương chuột, dựa trên các chỉ tiêu:
1. Xét nghiệm sinh hóa (hoạt độ ALT, AST).
2. Đánh giá mô học (nhuộm hematoxylin và eosin).
3. Đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin ,
ecto-5’-nucleotidase).



MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. SƠ LƯỢC VỀ GAN 3
1.1.1. Giới thiệu 3
1.1.2. Phôi học của gan 3
1.1.3. Cấu trúc gan 6
1.1.4. Khả năng tái sinh của gan 7
1.2. Xơ gan 9
1.2.1. Bệnh nguyên 9
1.2.2. Bệnh học 10
1.2.3. Bệnh sinh 10
1.2.3.1. Cơ chế phát sinh xơ hóa ở gan 10
1.2.3.2. Các tế bào tiềm năng phát sinh xơ hóa khác 14
1.2.3.3. Tương tác giữa các loại tế bào trong phát sinh xơ hóa 15

1.2.4. Chẩn đoán – xét nghiệm 16
1.2.4.1. Xét nghiệm sinh hóa 16
1.2.4.2. Sinh thiết – xét nghiệm mô học 18
1.2.5. Chữa trị 19
1.2.5.1. Bằng thuốc 19
1.2.5.2. Ghép gan 20
1.3. Liệu pháp tế bào 21
1.3.1. Cấy ghép tế bào gan 22
1.3.2. Cấy ghép tế bào gốc gan ứng viên 22



1.3.2.1. Tế bào gốc gan thai 23
1.3.2.2. Tế bào gốc gan trưởng thành 23
1.3.2.3. Cấy ghép tế bào gốc không thuộc gan 24
1.3.3. Tế bào gốc tủy xương 26
1.3.4. Tế bào gốc từ máu cuống rốn người 31
1.3.5. Tế bào gốc từ mô mỡ 32
1.4. Cơ sở lý thuyết gây độc gan của carbon tetrachloride 33
1.5. Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện collagen trong gan xơ hóa 36
1.6. Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện tế bào tổng hợp chất nền (integrin
1) trong gan xơ hóa 38
1.7. Cơ sở lý thuyết nghiên cứu sự biểu hiện enzym ecto-5’-nucleotidase trong
gan xơ hóa 39
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 42
2.1. Vật liệu 42
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm 42
2.1.2. Dụng cụ 43
2.1.3. Thiết bị 44
2.1.4. Hóa chất 45

2.2. Phương pháp nghiên cứu 47
2.2.1. Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 47
2.2.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả gây xơ hóa gan của CCl4 48
2.2.2.1. Xác định hoạt độ enzym alanine transaminase, enzym aspartate
transaminase trong huyết tương chuột 48
2.2.2.2. Đánh giá cấu trúc mô học gan qua mẫu gan nhuộm hematoxylin và eosin 52
2.2.2.3. Đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin 1, ecto-
5’-nucleotidase ở mức phiên mã 57
2.2.3. Phương pháp thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương
chuột 62



2.2.4. Phương pháp khẳng định tế bào gốc ứng viên là tế bào gốc trung mô 64
2.2.4.1. Phương pháp xác định marker bằng Flow cytometer 65
2.2.4.2. Phương pháp biệt hóa 66
2.2.5. Phương pháp nhuộm tế bào bằng Trypan blue 69
2.2.6. Phương pháp ghép tế bào gốc trung mô tủy xương, tế bào đơn nhân tủy
xương điều trị xơ hóa gan trên chuột 69
2.2.7. Phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị xơ hóa gan của tế bào cấy ghép 72
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 72
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 73
Phần I: KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH XƠ HÓA GAN CHUỘT BẰNG
HÓA CHẤT CCL4 0,8 ML/KG
3.1. Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT),
enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương 73
3.1.1. Hoạt độ ALT-AST sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 73
3.1.2. Hoạt độ ALT-AST sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 74
3.1.3. So sánh hoạt độ ALT-AST giữa tuần 5 và tuần 8 75
3.2. Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin 77

3.2.1. Kết quả mô học sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 78
3.2.2. Kết quả mô học sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg 80
3.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin
1, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã 83
3.3.1. Sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I) ở mức phiên mã 83
3.3.2. Sự biểu hiện gen mã hóa cho intergrin ở mức phiên mã 85
3.3.3. Sự biểu hiện gen mã hóa cho ecto-5’-nucleoxidase ở mức phiên mã 87
Phần II: KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
TỦY XƯƠNG CHUỘT
3.4. Kết quả thu nhận tế bào gốc trung mô ứng viên 92
3.5. Kết quả đánh giá marker tế bào gốc trung mô ứng viên 95



3.6. Kết quả biệt hóa của tế bào gốc trung mô ứng viên thành tế bào xương và
mỡ 97
3.6.1. Kết quả biệt hóa của MSC ứng viên thành tế bào xương 97
3.6.2. Kết quả biệt hóa của MSC ứng viên thành tế bào mỡ 98
Phần III: KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ BẰNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ TẾ
BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG
3.7. Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT),
enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương 100
3.8. Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin 103
3.9. Kết quả đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin
 ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã. 107
3.9.1. Sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I) ở mức phiên mã 108
3.9.2. Sự biểu hiện gen mã hóa cho intergrin ở mức phiên mã 111
3.9.3. Sự biểu hiện gen mã hóa cho ecto-5’-nucleoxidase ở mức phiên mã 115
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ix

TÀI LIỆU THAM KHẢO x
PHỤ LỤC xviii




iii





DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ dùng trong thí nghiệm 43
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị dùng trong thí nghiệm 44
Bảng 3.1. Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 5 tuần, 8 tuần xử lý (2 lần/ tuần) với dầu
bắp, CCl4 liều 0,8 ml/kg 73
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá marker bề mặt của MSC ứng viên 95
Bảng 3.3. Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 3 tuần điều trị với PBS (đối chứng),
MSC, BMC. 101


i




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

αCP2 Alpha complex protein 2
AFP Alpha feto protein
ALT (GPT) Alanine transaminase (Glutamate pyruvate transaminase)
ANIT Alpha-naphthyl-isothiocyanate
ASH Alcoholic steatohepatitis
AST (GOT) Aspartate transaminase (Glutamate oxaloacetate)
AT-MSC Adipose tissue- Mesenchymal stem cell
BEC Biliary epithelial cell
BMC Bone marrow cell
CSF Colony stimulating factor
DDC 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine
DDR2 Discoin domain receptor 2
DMNS Dimethylnitrosamine
ECM Extracellular matrix
EMT Epithelial-mesenchymal transition
EPC Endothelial progenitor cell
ET-1 Endothelin-1
F-B Formalin-phosphate
GalN D-galactosamine
G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor
GGT Gamma glutamyl transpeptidase
HCC Hepatocellular carcinoma
HGF Hepatic growth factor
HSC Haematopoietic stem cell
ICAM-1 Inter-cellular adhesion molecule 1
IGF-1 Insulin-like growth factor 1
ii

iPSC induced-pluripotent stem cell
LDH Lactat dehydrogenase
MAPC Multipotent adult progenitor cells
M-CSF Macrophage-colony stimulating factor
MDH Malate dehydrogenase
MFB Myo-fibroblast
MMP Matrix metalloproteinase
Mrp3 Multidrug resistance protein 3
Mrp4 Multidrug resistance protein 4
MSC Mesenchymal stem cell
NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease
NCAM Neural cell adhesion molecule
Ntcp Natri Taurocholate co-transporting polypeptide
Oatp4 Organic anion transporting polypeptide
PAF Platelet-activating factor
PBC Primary biliary cirrhosis
PBS Phosphate buffered saline
PDGF Platelet-derived growth factor
PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
PSC Primary sclerosing cholangitis
ROS Reactive oxygen species
SCF Stem cell factor
SREBP-1c Sterol regulatory element binding protein
TAA Thioacetamide
TGF- β Transforming growth factor- β
TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase
VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1
UCB Umblical cord blood
iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sự hình thành chồi gan (dạng sơ đồ) 4
Hình 1.2. Gen có liên quan đến sự phát triển sớm gan 5
Hình 1.3. Cấu trúc tiểu thùy gan 7
Hình 1.4. Các thay đổi trong cấu trúc gan với sự xơ hóa phát triển (b) so với gan
bình thường (a) 11
Hình 1.5. Bệnh sinh của sự xơ hóa gan (sự phát sinh xơ hóa) 12
Hình 1.6. Các phương pháp nhuộm trong chẩn đoán mô học gan 19
Hình 1.7. Sự khác biệt giữa biệt hóa và dung hợp bởi phân tích di truyền học dựa
trên nhiễm sắc thể giới tính 29
Hình 2.1. Chuột nhắt trắng (Mus musculus var. Albino), 4-5 tuần tuổi. 42
Hình 2.3. Hóa chất (a) RT-PCR PreMix Kit one step (b) Mồi cho procollagen 1(I),
integrin 1, ecto-5’-nucleotidase. 46
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm. 47
Hình 2.5. Thao tác cho chuột uống: (a) Thao tác giữ chuột (b) Đưa kim vào thực
quản. 48
Hình 2.6. (a) Thao tác thu nhận máu từ đuôi chuột. (b)Thao tác thu huyết tương
chuột 49
Hình 2.7. Các thao tác sinh thiết. 53
Hình 2.8. Công thức cấu tạo của hematoxylin. 54
Hình 2.9. Công thức cấu tạo của eosin Y (a) và eosin B (b). 54
Hình 2.10. Một tiểu thùy gan bình thường với 3 vùng tế bào. 56
Hình 2.11. (a) Thao tác load mẫu vào lỗ răng lược (giếng) bằng micropipette, (b)
Điện di agarose mẫu cDNA trong bể điện di nằm ngang. 61
Hình 2.12. Kết quả điện di một số đoạn DNA trong gel agarose. 62

Hình 2.13. Thao tác thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương
chuột. 64
v




Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện hoạt độ ALT trong huyết tương chuột sau 5 tuần, 8 tuần
uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần. 76
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hoạt độ AST trong huyết tương chuột sau 5 tuần/ 8 tuần
uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần. 77
Hình 3.3. Cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống
dầu bắp 2 lần/ tuần). 78
Hình 3.4. Cấu trúc vi thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống dầu
bắp 2 lần/ tuần) (kết quả nhuộm H&E). 78
Hình 3.5. Cấu trúc đại thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg. 79
Hình 3.6. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết
quả nhuộm H&E). 79
Hình 3.7. Cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 8 tuần cho uống
dầu bắp 2 lần/ tuần). 80
Hình 3.8. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết
quả nhuộm H&E). 81
Hình 3.9. Cấu trúc đại thể gan chuột sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg. 81
Hình 3.10. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết
quả nhuộm H&E). 82
Hình 3.11. Cấu trúc vi thể gan của chuột rat trong nghiên cứu của Wang xian Tang
và cộng sự 2003 (kết quả nhuộm H&E). 83
Hình 3.12. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại RT-PCR
procollagen α1(I), GAPDH. 84
Hình 3.13. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại PCR collagen

trong nghiên cứu của M.T Abdel Aziz và cộng sự (2007). 85
Hình 3.14. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR integrin
GAPDH. 86
Hình 3.15. Kết quả Western blot về sự biểu hiện -Smooth muscle actin (-SMA)
trong nghiên cứu của Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2010). 87
vi




Hình 3.16. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR ecto-5’-
nucleotidase, GAPDH. 88
Hình 3.17. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại RT-PCR
procollagen α1(I), ecto-5’-nucleotidase, GAPDH. 89
Hình 3.18. Mối liên hệ giữa sự biểu hiện CD73 với sự phát sinh xơ hóa gan (kết quả
nhuộm H&E). 90
Hình 3.19. (a) Tế bào vừa thu nhận từ tủy xương, (b) Quần thể tế bào sau 24 giờ
nuôi cấy. 92
Hình 3.20. (a) Quần thể tế bào sau 48 giờ nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 72 giờ
nuôi cấy. 93
Hình 3.21. (a) Quần thể tế bào sau 8 ngày nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 15 ngày
nuôi cấy. 93
Hình 3.22. (a) Tế bào sau cấy chuyền 5 ngày, (b) Tế bào sau cấy chuyền 7 ngày. 94
Hình 3.23. Một số kiểu hình tập đoàn của MSC ứng viên khi nuôi cấy ở mật độ
thấp. 95
Hình 3.24. Kết quả phân tích Flow cytometry của MSC ứng viên. 96
Hình 3.25. Kết quả nhuộm Alizarin red. 98
Hình 3.26. Kết quả nhuộm Oil red. 99
Hình 3.27. Cấu trúc đại thể gan chuột sau 3 tuần tiêm 0,1 ml PBS (lô CCl4-PBS),
5x10

4
tế bào gốc trung mô tủy xương (lô CCl4-MSC), 5x10
4
tế bào đơn nhân tủy
xương chuột (lô CCl4-BMC). 104
Hình 3.28. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 3 tuần điều trị (a) lô CCl4-PBS, (b) lô
CCl4-MSC, (c) lô CCl4-BMC (kết quả nhuộm H&E). 106
Hình 3.29. Cấu trúc vi thể gan chuột trong nghiên cứu của Sivasami và cộng sự
(2010) (kết quả nhuộm H&E). 107
Hình 3.30. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR
procollagen 1(I), GAPDH. 109
vii




Hình 3.31. Kết quả biểu hiện collagen trong nghiên cứu của (a) M.T Abdel Aziz và
cộng sự (2007), (b) Sivasami và cộng sự (2010), (c) Cheuk-Kwan Sun và cộng sự
(2009). 110
Hình 3.32. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR integrin
, GAPDH. 112
Hình 3.33. Kết quả biểu hiện -Smooth muscle actin (-SMA) trong nghiên cứu
của (a) Sivasami và cộng sự (2010), (b) Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2010). 113
Hình 3.34. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR ecto-5’-
nucleotidase, GAPDH. 116

3




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ GAN
1.1.1. Giới thiệu [1]
Gan là một cơ quan đảm nhiệm nhiều chức năng phức tạp trong cơ thể động
vật có xương sống, bao gồm cả người. Cơ quan này đóng vai trò quan trọng trong
quá trình chuyển hóa các chất (carbonhydrat, protein, lipid, …) và một số các chức
năng khác trong cơ thể như dự trữ (máu, glycogen, các vitamin, sắt và đồng, …),
tổng hợp (protein huyết tương: các yếu tố đông máu, albumin).
Gan cũng sản xuất dịch mật cần thiết cho quá trình tiêu hóa mỡ. Gan còn có
chức năng lọc máu, giáng hóa các chất độc và thuốc; giáng hóa insulin và các
hormon khác; giáng hóa hemoglobin tạo sắc tố mật giúp phân hủy và tái sử dụng
hồng cầu; biến đổi ammonia thành ure. Trong ba tháng đầu tiên của thai kỳ, gan là
nơi tạo hồng cầu chính cho thai nhi. Gan còn tham gia vào quá trình miễn dịch.
Hiện tại, không có một cơ quan nhân tạo nào có thể đảm trách được toàn bộ
chức năng vô cùng phức tạp của gan. Chỉ một vài chức năng có thể thực hiện được
thông qua con đường nhân tạo để điều trị suy gan.
1.1.2. Phôi học của gan [15]
Ở chuột, bắt đầu từ ngày thứ 8 của thời kỳ thai nghén, gan phát triển từ nội bì
cơ quan tiêu hóa nguyên thủy (ventral foregut endoderm). Bằng chứng đầu tiên của
sự biệt hóa gan là sự cảm ứng mRNA mã hóa albumin và -fetoprotein trong tế bào
nội bì (endodermal cells), ngay cả trước khi biệt hóa kiểu hình. Giữa ngày 8,5 và
9,5, tiền thân tế bào gan (hepatocyte precursors) sản sinh, bắt đầu ở ngày 9,5, di cư

đến trung bì tim (cardiac mesoderm) trong vách xương gan (septum transversum).
Tín hiệu từ trung bì tim làm tế bào tăng mức mRNA mã hóa albumin và -
fetoprotein, hình thành nên chồi gan (liver bud). Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
(Fibroblast growth factors – FGFs) 1, 2 và 8 có đủ khả năng để cảm ứng sự biểu
4




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

hiện gen gan trong nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên thủy chuột (murine foregut
endoderm). FGF receptor 1 và 4 biểu hiện ở tế bào nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên
thủy (foregut endoderm cells) và thiết yếu cho sự cảm ứng này.
Ở ngày 10,5 bắt đầu có sự tạo mạch cho chồi gan, theo sau là sự tăng lớn kích
thước gan. Những tế bào ở giai đoạn sớm trong chồi gan dương tính với cả albumin
và -fetoprotein. Những kiểu hình biệt hóa của tế bào gan (hepatocyte) và biểu mô
ống mật (bile duct epithelium) rõ nét lên trong giữa kỳ thai nghén. Các nghiên cứu
xác định dòng chưa được công bố, nhưng nói chung người ta cho rằng ống mật và tế
bào gan xuất phát từ tiền thân thông thường, đó là nguyên bào gan (hepatoblasts).
Người ta chưa biết liệu chỉ có một loại nguyên bào gan hay có một sự phát triển
dòng theo thứ bậc gồm những nguyên bào gan nguyên thủy và các tiền thân có hai
tiềm năng. Nguyên bào gan thai có thể được cho là tương đương với một tế bào gốc
gan thai.

Hình 1.1. Sự hình thành chồi gan (dạng sơ đồ) [15].
(a) Ở đốt thân phôi 6, trung bì tim tạo nên (mũi tên) nội bì cơ quan tiêu hóa nguyên thủy để hoạt
hóa gen đặc trưng gan (biểu hiện bởi khối trắng). (b) Tế bào gan sớm bắt đầu sản sinh trong lớp nội
bì. (c) Tế bào gan sớm di cư vào vùng trung mô lỏng lẻo gọi là vách xương ngang. Tế bào gan sớm
sau đó kết tụ xung quanh mao mạch kiểu xoang trong trung mô, hình thành nên gan.

Người ta đã nhận diện ra một vài gen rất quan trọng đối với sự phát triển của
gan (hình 1.2). Những gen đầu tiên giữ vai trò quan trọng đó là yếu tố phiên mã

(a
)
Chuyên hóa
(b
)
Tăng trưởng

(c
)
Di cư
Trung bì
tim

tim

vách
Chồi gan
T
ế b
ào gan s
ớm

5

Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

HNF3 và GATA-4. Các gen này thiết yếu cho sự chuyên biệt hóa nội bì và cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của các biểu mô khác như phổi và tuyến
tụy. Hiện tại, các yếu tố chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện gen gan lúc bắt đầu trước
khi hình thành chồi gan chưa được biết đến. Trái lại, người ta vừa nhận diện được
vài nhân tố có liên quan đến sự hình thành chồi gan như: c-jun, yếu tố tăng trưởng
người (hepatocyte growth factor-HGF), và c-met được cho là thiết yếu cho sự hình
thành chồi gan. Các yếu tố khác như 1-integrin hoạt động trong sự phát triển sau
đó của gan (hình 1.2).
Nói chung, sự hiểu biết về sự phát triển gan ở mức phân tử vẫn còn rất ít. Có
khả năng là nhiều cơ chế được khám phá cho đến nay liên quan đến chuyên biệt hóa
gan trong suốt quá trình tạo phôi cũng sẽ được ứng dụng để tái tạo tiền thân gan và
sinh học tế bào gốc gan (liver stem cell).

Hình 1.2. Gen có liên quan đến sự phát triển sớm gan [15].
6




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

1.1.3. Cấu trúc gan [1] [15][45][53]
Gan nằm ngay bên dưới cơ hoành ở phần trên, bên phải ổ bụng (bên phải dạ
dày). Gan mềm, có màu đỏ sẫm, chiếm 2 % khối lượng cơ thể người và 5 % khối
lượng cơ thể chuột. Gan là cơ quan duy nhất với hai nguồn cung cấp máu dẫn vào.
Động mạch gan cung cấp máu oxy hóa, và tĩnh mạch cửa mang máu trong tĩnh
mạch giàu chất dinh dưỡng và hormon từ nội tạng (ruột và tuyến tụy). Động mạch
gan, tĩnh mạch cửa, và ống mật chủ đi vào gan ở cùng vị trí, tạo thành bộ ba cửa

rãnh ngang gan (portal hepatis).
Gan được bao phủ bởi một lớp mô liên kết phân nhánh kéo dài suốt toàn bộ
nhu mô gan và có chức năng như các vách (septa). Lớp mô liên kết này chia nhu mô
gan thành những đơn vị nhỏ gọi là các tiểu thùy.
Đơn vị chức năng của gan là tiểu thuỳ gan. Tổng cộng có từ 50,000 đến
100,000 tiểu thuỳ. Tiểu thuỳ gan hình trụ, ở giữa là tĩnh mạch trung tâm, đổ vào
tĩnh mạch gan, rồi vào tĩnh mạch chủ. Chung quanh tĩnh mạch trung tâm là các bè tế
bào gan xếp theo hình nan hoa. Mỗi bè tế bào thường gồm hai lớp tế bào gan và
giữa các tế bào là các tiểu quản mật. Lớp tế bào gan kéo dài từ khoảng không gian
cửa đến tiểu TM trung tâm. Tất cả các tế bào gan đều bài tiết mật vào các tiểu quản
mật, rồi mật chảy vào các ống mật lớn hơn và cuối cùng đổ vào ống mật chủ. Mật từ
ống mật chủ đi thẳng vào tá tràng hay đi vào túi mật. Khi ăn mật được phóng thích
từ túi mật vào tá tràng, sau đó mật được tái hấp thu tại hồi tràng vào tĩnh mạch cửa
rồi vào các tế bào gan. Vùng kết nối giữa tiểu quản mật và ống mật được gọi là ‘ống
Hering’ (canals of Hering). Giữa các tiểu thuỳ gan có các tiểu tĩnh mạch cửa, tiểu
động mạch gan từ đó máu đổ vào xoang mao mạch (sinusoid) nằm giữa các bè tế
bào gan, phân phối oxy và chất dinh dưỡng cho tế bào ở gan, lấy CO
2
và sản phẩm
chuyển hóa từ tế bào ở gan và cuối cùng chảy vào tĩnh mạch trung tâm. Tiểu tĩnh
mạch cửa, tiểu động mạch gan và ống mật hình thành ‘bộ ba cửa’ (portal triad) của
tiểu thùy. Ngoài ra còn có các mạch bạch huyết. Các mao mạch kiểu xoang được lót
7




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

bởi các tế bào nội mô và các tế bào Kuffer. Lớp nội mô có những cửa sổ lớn, nên

các chất từ huyết tương khuyếch tán vào khoảng Disse giữa các tế bào nội mô và tế
bào gan. Khoảng Disse liên hệ trực tiếp với các mạch bạch huyết.


Hình 1.3. Cấu trúc tiểu thùy gan [53].
(a) 3 tiểu thùy có cấu trúc 6 cạnh được phân ranh giới bởi các portal triad ở ngoại biên và gồm một
tĩnh mạch ở trung tâm, (b) Cấu trúc mô học của một tiểu thùy, (c) Cấu trúc của một phiến tế bào
gan.
1.1.4. Khả năng tái sinh của gan [45]
Gan là một cơ quan đặc biệt có khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng và khối
lượng của chính nó. Ở những loài gặm nhấm và người, gan phát triển nhanh chóng
sau khi cắt bỏ hơn 50% khối lượng. Quá trình gia tăng khối lượng này (do cắt bỏ
một phần gan hay do tổn thương cấp tính do hoá chất) gọi là sự tái sinh của gan,
mặc dù sự gia tăng này xảy ra thông qua sự tăng sinh bù hơn là sự tái sinh đúng
nghĩa.
8




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Khả năng tái sinh gan hoàn toàn là một đặc tính đặc trưng của gan. Sự tái sinh
bắt đầu bằng việc kích hoạt sự phát triển quần thể gan nguyên thủy. Tế bào gan
trong cơ thể người trưởng thành đã biệt hóa, bình thường ở trạng thái không hoạt
động và duy trì khả năng này cho đến khi cơ thể có nhu cầu. Sau đó, chúng quay lại
trạng thái không hoạt động, hoàn thành chức năng. Những tế bào khác trong gan,
bao gồm biểu mô mật (biliary epithelium), nội mô xoang mao mạch (sinusoidal
endothelium), tế bào hình sao (stellate cells), và những tế bào Kupffer, cũng tăng
sinh, với giai đoạn tiềm tàng khoảng 24 giờ ở chuột nhưng chưa được biết rõ ràng ở

người. Trong điều kiện bình thường, quá trình này là kết quả của sự điều hòa chính
xác, phục hồi toàn bộ khối mô và cấu trúc tế bào. Vì vậy, đây không chỉ là một mô
hình hoàn hảo cho việc điều khiển sự phát triển tế bào gan, mà còn là phương tiện
để điều khiển sự tạo thành những tế bào mô chuyên biệt – sự phân cực tế bào và tổ
chức không gian ba chiều.
Tế bào gan nguyên thủy giống như một “người đóng góp” cho một “bể” tế bào
gốc gan, mặc dù điều này không phù hợp với định nghĩa về tế bào gốc đã được công
nhận – một tế bào có khả năng tự làm mới và đa năng. Tế bào gan là đơn năng, mặc
dù có một số nghiên cứu cho rằng những tế bào gan phát triển thành tế bào biểu mô
ống, người ta cho rằng nó không đóng vai trò chính trong cơ chế thay thế tế bào
bình thường ở gan. Trong những thử nghiệm trên động vật, phẫu thuật cắt bỏ một
phần gan (partial hepatectomy-PH), tế bào gan có khả năng tái tạo lại những tế bào
chức năng. Đây không chỉ là lý thuyết, thực tế chúng tạo thành một quần thể tế bào
giống như trong những mô khác đã được xác nhận như da, tủy xương hay đường
ruột. Nếu cắt bỏ hai phần ba gan, mỗi tế bào gan chỉ cần phân chia nhiều nhất hai
lần để khôi phục lại gan. Ở điều kiện bình thường, sự tái sinh gan xảy ra từ những tế
bào gan nguyên thủy và những loại tế bào khác tồn tại trong gan mà không cần đến
thành phần tế bào gốc.
9




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Người ta kết luận rằng ở gan, những tế bào đã biệt hoá ở trạng thái nghỉ sẽ tái
bản nhanh chóng sau khi cắt một phần mô, trong khi những tế bào tiền thân của gan
(oval cell) chỉ tăng sinh và tạo dòng trong những trường hợp mà sự tăng sinh của tế
bào gan bị ngăn cản hay bị trở ngại. Mặc dù tế bào gốc tuỷ xương có khả năng sinh
ra tế bào ovan và tế bào gan, nhưng sự chuyển biệt hoá này rất hiếm và kém hiệu

quả.
1.2. Xơ gan
Bệnh gan được phân loại theo nguyên nhân lẫn tác động của nó đến gan. Các
nguyên nhân bao gồm nhiễm trùng, tổn thương, phơi nhiễm các thuốc hay chất độc,
quá trình tự miễn dịch hoặc thiếu hụt gen (như hemochromatosis). Những nguyvên
nhân này có thể dẫn tới viêm gan, xơ gan, sỏi mật, gan nhiễm mỡ và ung thư gan.
Sự thiếu hụt về gen có thể ngăn chặn các chức năng quan trọng của gan và dẫn tới
tích tụ các chất gây hại như đồng và sắt.
Xơ gan hay chai gan (cirrhosis) là kết quả sau cùng của nhiều loại bệnh gan
mãn tính khác nhau. Thuật ngữ “cirrhosis” được đưa ra bởi Laennec vào năm 1826.
Nó bắt nguồn từ chữ Hy Lạp “scirrhus” dùng để mô tả bề mặt màu cam hay vàng
nâu của gan khi mổ khám nghiệm tử thi.
1.2.1. Bệnh nguyên
Xơ gan là hậu quả của nhiều nguyên nhân khác nhau. Ở các nước phát triển,
hầu hết các trường hợp là do gan nhiễm mỡ do nghiện rượu (ASH) hay viêm gan C.
Ở một phần Châu Á và Châu Phi, xơ gan thường do viêm gan B. Tổn thương ống
mật cũng có thể gây ra xơ gan như tắc nghẽn ống mật cơ học, xơ gan mật nguyên
phát (PBC-Primary biliary cirrhosis), và viêm xơ chai đường mật nguyên phát
(PSC-primary sclerosing cholangitis). Nhiều trường hợp xơ gan không rõ nguyên
10




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

nhân có vẻ là do các bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD – Nonalcoholic
fatty liver disease).
Ngoài ra còn có các nguyên nhân khác: viêm gan tự miễn, các bệnh di truyền
(xơ hóa nang, thiếu alpha-1 antitrypsin, hemochromatosis, bệnh Wilson, chứng loạn

chuyển hóa cacbon hydrat bẩm sinh và những bệnh tích trữ glycogen), thuốc, chất
độc, nhiễm ký sinh trùng (sán máng),
1.2.2. Bệnh học
Xơ gan (cirrhosis) là một giai đoạn muộn của chứng xơ hóa gan (fibrosis) mà
kết quả là sự biến dạng (bóp méo) lan rộng của cấu trúc gan. Bản chất của sự xơ hóa
là quá trình chữa lành vết thương quá mức, trong đó mô liên kết được tạo ra quá
nhiều trong gan, sản xuất ra một lượng chất nền ngoại bào khác thường cả về lượng
lẫn thành phần tạo nên các mô sẹo (xơ). Khởi sự cho xơ hóa là tổn thương gan mãn
tính do nhiều nguyên nhân gây ra sự hoại tử hay apoptosis của tế bào gan.
Xơ gan được mô tả là những khối u (mô sẹo) nhỏ lan rộng khắp lá gan kết hợp
với sự xơ hóa, các khối u tái sinh này được bao quanh bởi mô xơ dày đặc. Sự xơ
hóa và hình thành các mô sẹo gây biến dạng cấu trúc bình thường và khả năng tái
sinh của các tế bào gan, làm tắc nghẽn các dòng máu từ ruột đến gan. Do đó, xơ hóa
góp phần gây ra thiếu máu cục bộ tế bào gan (gây ra loạn chức năng) và huyết áp
cao ở cửa gan.
1.2.3. Bệnh sinh [47] [50]
1.2.3.1. Cơ chế phát sinh xơ hóa ở gan
Có 4 thay đổi cơ bản nhất trong mô gan xơ hóa so với gan bình thường: (1) sự
tái sắp xếp mô học; (2) sự thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM –
Extracellular matrix) ; (3) sự tăng hàm lượng ECM; (4) sự thay đổi thành phần của
ECM.
11




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Xơ hóa gan là kết quả của đáp ứng chữa lành đối với tổn thương lặp đi lặp lại
của gan. Sau một tổn thương gan cấp tính (như viêm gan siêu vi), các tế bào nhu mô

tăng sinh và thay thế các tế bào hoại tử hay apoptosis. Quá trình này liên quan đến
phản ứng viêm và sự tích tụ có giới hạn của ECM. Nếu tổn thương gan vẫn tiếp
diễn, cuối cùng sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay
thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen. Sự phân bố sợi phụ
thuộc vào căn nguyên của sự tổn thương. Trong viêm gan siêu vi và các rối loạn ứ
mật mãn tính, mô xơ ban đầu hình thành ở quanh khoảng cửa, trong khi ở bệnh gan
do rượu, mô xơ ban đầu xuất hiện ở quanh tĩnh mạch trung tâm và quanh các xoang
mao mạch (Pinzani, 1999). Khi xơ hóa phát triển, bệnh tiến triển từ các dải collagen
thành sự xơ hóa bắt cầu (bridging fibrosis) dẫn tới hình thành xơ gan (cirrhosis).

Hình 1.4. Các thay đổi trong cấu trúc gan với sự xơ hóa phát triển (b) so với gan bình thường
(a) [47].
Theo sau tổn thương gan mãn tính, các tế bào lympho thâm nhập vào nhu mô gan. Một vài tế bào
gan bị apoptosis và các tế bào Kupffer hoạt hóa, phóng thích các chất môi giới sinh xơ hóa. Tế bào
hình sao tăng sinh và trải qua sự hoạt hóa kiểu hình, tiết ra lượng lớn các protein chất nền ngoại
bào. Sự co rút của các tế bào hình sao gây sự tăng cản trở dòng máu trong xoang mao mạch.
12




Trần Hồng Diễm Tổng quan tài liệu

Xơ hóa gan liên quan đến những thay đổi chủ yếu về cả lượng lẫn thành phần
ECM (Benyon và Iredale, 2000). Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan cao
xấp xỉ 6 lần so với gan bình thường, bao gồm collagen (tuýp I, III và IV),
fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan và proteoglycan. Sự tích tụ ECM
là kết quả của cả sự tăng tổng hợp lẫn sự giảm thóai biến chất nền (Arthur M.J,
2000). Sự giảm hoạt động của các MMP (matrix metalloproteinase) phân giải chất
nền chủ yếu là do sự biểu hiện vượt mức của các tác nhân ức chế đặc trưng (các

TIMP). Tế bào hình sao là các tế bào sản xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn
thương (Gabele và cộng sự, 2003). Trong gan bình thường, tế bào hình sao cư trú ở
khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu. Sau tổn thương mãn tính, các tế
bào hình sao hoạt hóa và chuyển biệt hóa thành các nguyên bào sợi cơ (MFB -
myofibroblast) nhờ những chất môi giới gây viêm (như TGF- β) (hình 1.5). Sự hoạt
hóa tế bào hình sao dẫn đến sự biểu hiện của α-smooth muscle actin và sự biến mất
các không bào mỡ kết hợp với sự giảm lượng retinoid. Tế bào hình sao có đặc tính
co rút, tiền viêm và phát sinh xơ hóa (Milani và cộng sự, 1990; Marra, 1999).

Hình 1.5. Bệnh sinh của sự xơ hóa gan (sự phát sinh xơ hóa) [50].
(*) là hình quan sát bằng kính hiển vi điện tử của tế bào hình sao với nhiều giọt mỡ tạo thành vết
lõm trong nhân.