Môi trường nuôi cấy thực vật

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật
vật
Tạ Ngọc Ly
Tạ Ngọc Ly
Các thành phần chính
Các thành phần chính
- Đường:sucrose và glucose, 2%
- Các muối khoáng đa lượng
- Các muối khoáng vi lượng
- Các vitamin
- Các chất sinh trưởng
Chức năng của các khoáng chính
Chức năng của các khoáng chính

Nitrogen
Nitrogen
– ảnh hưởng chỉ số phát triển của
– ảnh hưởng chỉ số phát triển của
cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của
cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của
nhân, protein, diệp lục, amino acid và các
nhân, protein, diệp lục, amino acid và các
hocmon
hocmon
.
.

Phosphorus
Phosphorus

– có nhiều trong đỉnh sinh
– có nhiều trong đỉnh sinh
trưởng, các mô phát triển nhanh, quan trọng
trưởng, các mô phát triển nhanh, quan trọng
trong quá trình quang hợp, hô hấp.
trong quá trình quang hợp, hô hấp.



Potassium
Potassium
– cần thiết cho phân chia tế bào,
– cần thiết cho phân chia tế bào,
mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein
mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein
và quang tổng hợp
và quang tổng hợp
.
.

Calcium
Calcium
–
–
tham gia biệt hóa thành tế bào, phát triển lá
tham gia biệt hóa thành tế bào, phát triển lá
và rễ. Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids
và rễ. Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids

Iron

Iron


– tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và quang tự
– tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và quang tự
dưỡng. Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA
dưỡng. Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA
.
.



Magnesium –
Magnesium –
tham gia qt quang tự dưỡng và hệ thống
tham gia qt quang tự dưỡng và hệ thống
hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và
hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và
tinh bột.
tinh bột.

Sulfur
Sulfur
– Tham gia trong chuyển hóa của ti thể và
– Tham gia trong chuyển hóa của ti thể và
hệ thống quang tông hợp, thành phần của
hệ thống quang tông hợp, thành phần của
aminoacids và enzimes
aminoacids và enzimes
.

.



Manganese
Manganese
– tạo mối quan hệ giữa các enzymes
– tạo mối quan hệ giữa các enzymes
và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và
và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và
hô hấp
hô hấp
.
.



Molybdenum
Molybdenum
– tham gia trong enzime phân hủy nitrate và
– tham gia trong enzime phân hủy nitrate và
amonium. Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô
amonium. Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô
cơ sang phot phat hữu cơ.
cơ sang phot phat hữu cơ.

Zinc – tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và
Zinc – tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và
lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon
lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon

.
.

Boron
Boron
-
-
tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và
tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và
lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon
lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon



Copper – liên quan trong quang tổng hợp và hệ thống
Copper – liên quan trong quang tổng hợp và hệ thống
hô hấp. Hỗ trợ tổng hợp chlorophyll và sử dụng như 1
hô hấp. Hỗ trợ tổng hợp chlorophyll và sử dụng như 1
tác nhân phân giải
tác nhân phân giải
Nguồn nitrogen

Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen
khoáng như ammonium và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các
dạng nitrogen hữu cơ như acid amin. Tỷ lệ nitrogen dạng
ammonium và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng thái phát
triển của mô.

Nitrat được cung cấp dưới dạng muối nitrat Ca(NO
3

)
2
.4H
2
O,
KNO
3
, NaNO
3
hoặc NH
4
NO
3
. Ammonium cung cấp dưới dạng
muối (NH
4
)
2
SO
4
hoặc NH
4
NO
3
.Trong một số ít trường hợp có thể
cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO
3
-
và NH
4

+
trong
môi trường thay đổi từ 3 đến 6 mM, thông thường khoảng 20
mM
Nguồn phospho

Hai dạng muối phospho thường dùng nhất
là NaH
3
PO
4
.7H
2
O và KH
2
PO
4
. Nồng độ
phospho trong môi trường biến thiên từ
0,15 đến 4 mM, thường khoảng 1 mM
Nguồn potasium

Người ta cung cấp kali cho mô nuôi cấy
dưới dạng KNO
3
, KCl, KH
2
PO
4
. Nồng độ K

+

trong môi trường biến thiên từ 2÷25 mM,
trung bình khoảng 10 mM.

Nguồn calcium
Calci được cung cấp
dươi dạng muối
Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.
6H
2
O hoặc
CaCl
2
.2H
2
O. Nồng độ
Ca
2+
trong môi trường
nuôi cấy từ 1-3,5 mM,
trung bình là 2mM.


Nguồn magnesium
Magne được cung cấp dưới
dạng MgSO
4
.7H
2
O, với
nồng độ trong môi
trường từ 0,5 đến 3 mM
Nguồn ferric

Những môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng
clorua sắt FeCl
2
, FeCl
3
.6H
2
O, FeSO
4
.7H
2
O,
Fe
2
(SO
4
)
3

, Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay, hầu hết các
phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat
kết hợp với Na
2
-Ethylen diamin tetraacetat (Na
2
- EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và
giải phóng dần dần ra môi trường theo nhu cầu
của mô thực vật.
Các muối khoáng vi lượng
Tên vi lượng Dạng sử dụng
Nồng độ µM
Mangan (Mn)
MnSO
4
.4H
2
O
15 ÷ 100
Bo (B)
H
3
BO
3

6 ÷ 100
Kẽm (Zn)
Zn(SO
4
).7H
2
O
15 ÷ 30
Đồng (Cu)
CuSO
4
.5H
2
O
0.04 ÷ 0,08
Coban (Co)
CoCl
2
.6H
2
O
0,1 ÷ 0,4
Iode (I) KI 2,5 ÷ 20
Molypden (Mo)
(NH
4
)
6
Mo
7

O
24
.4H
2
O
NaMoO
4
.2H
2
O
0,007 – 1
Nguồn khoáng Vai trò trong thực vật
Nitrogen Thành phần của protein, acid nucleic và một số coenzymes. Là
yếu tố khoáng được yêu cầu nhiều nhất cho thực vật
Potassium Điều hòa áp suất thẩm thấu, là cation vô cơ đặc trưng
Calcium Sinh tổng hợp hợp vách tế bào, chức năng của màng tế bào, tín
hiệu nội bào
Magnesium Cofactor của enzyme, thành phần của chlorophyll
Phospho Thành phần của nucleic acids, chuyển hóa năng lượng, thành
phần trung gian trong hô hấp và quang hợp
Sulphur Thành phần của một số amino acid (như methionine, cysteine)
và một số cofactor
Clo Cần thiết cho quá trình quang hợp
Sắt Thành phần của cytochrome trong chuỗi chuyển điện tử
Mangan Cofactor của enzyme
Coban Thành phần của một tố vitamin
Đồng Cofactor của enzyme, tham gia vào chuỗi chuyển điện tử
Kẽm Cofactor của enzyme, tham gia sinh tổng hợp chlorophyll
Molybden Cofactor của enzyme, thành phần của enzyme nitrate
reductase

Các vitamin
Tên vitamin Nồng độ (ppm)
Myo – Inositon 100
Acid nicotinic (Vitamin B
5
hay PP)
0,5 ÷ 1
Pyridoxin HCl (Vitamin B
6
)
0,005 ÷ 0,5
Thiamin HCl (Vitamin B
1
)
10 ÷ 50
Panthothenate calci (Vitamin B
3
)
1 ÷ 5
Riboflavin (Vitamin B
2)
1 ÷ 5
Biotin (Vitamin H hay B
8
)
0,1 ÷ 1
Acid folic (Vitamin Bc) 0,1 ÷ 1
Chất điều hòa sinh trưởng thường sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật
Nhóm chất Tên hóa chất Viết tắt Trọng

lượng phân tử
Dung dịch
Stock
Auxin
p-chlorophenoxyacetic acid pCPA 186.6
Tất cả các
auxin hòa tan trong
NaOH loãng hay
trong dung dịch
ethanol
2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid
2,4-D 221.0
Indole-3-acetic acid IAA 175.2
Indole-3-butyric acid IBA 203.2
1-Naphthaleneacetic acid NAA 186.2
2-Napthoxyacetic acid NOA 202.2
Cytokinin
6-Benzylaminopurine BAP 225.2
Tất cả các
cytokinin hòa tan
trong NaOH loãng
hay trong dung dịch
ethanol
N-Isopenteylaminopurine 2iP 203.3
6-Furfurylaminopurine
(Kinetin)
K 215.2
Zeatin Zea 219.2
Gibberellin Gibberellic acid

GA
3
346.4
Hòa tan trong
nước
Abscisic acid Abscisic acid ABA 264
Hòa tan dung
dịch ethanol
Các hợp chất tự nhiên
Các hợp chất tự nhiên

Nước dừa (Coconut endosperm)
Nước dừa (Coconut endosperm)

Nhũ tương cá (Fish emulsion)
Nhũ tương cá (Fish emulsion)

Protein thủy phân(Protein hydrolysates)
Protein thủy phân(Protein hydrolysates)

Nước ép cà chua(Tomato juice)
Nước ép cà chua(Tomato juice)

Nước chiết nấm men(Yeast extracts)
Nước chiết nấm men(Yeast extracts)

Khoai tây (Potato agar)
Khoai tây (Potato agar)
Than hoạt tính
Than hoạt tính


Sử dụng như tác nhân khử độc, khử nước
Sử dụng như tác nhân khử độc, khử nước
độc từ mô nuôi cấy. Nồng độ hay dùng là
độc từ mô nuôi cấy. Nồng độ hay dùng là
0,3% hoặc thấp hơn.
0,3% hoặc thấp hơn.

Than sử dụng cho nuôi cấy mô
Than sử dụng cho nuôi cấy mô
–
Khử sạch acid và phải trung tính
Khử sạch acid và phải trung tính
–
Không sử dụng lại
Không sử dụng lại

Vấn đề lựa chọn môi trường

Phương pháp pha chế môi trường
Thành phần môi trường MS
Thành phần môi trường MS
Muối khoáng Nồng độ Nồng độ
Đa lượng (mg/l) Vi lượng (mg/l)
Potasium nitrate (KNO
3
) 1,900 Manganese sulfate (MnSO
4
. 4H
2

O) 22.3
Amonium nitrate (NH
4
NO
3
) 1,650 Boric Acid (H
3
BO
3
) 6.2
Calcium chloride (CaCl
2
.H
2
O) 440 Colbalt chloride (CoCl
2
.6H
2
O) 0.025
Magnesium sulfate
(MgSO
4
.7H
2
O)
370 Cupric Sulfate (CuSO
4
.5H
2
O) 0.025

Potassium phosphate (KH
2
PO
4
) 170 Ferrous sulfate (FeSO
4
.7H
2
O) 27.8
Potassium Iodine (KI) 0.83
Sodium molybdate (Na
2
MoO
4
.2H
2
O) 0.25
Zinc Sulfate (ZnSO
4
.7H
2
O) 8.6
Na
2
EDTA.2H
2
O 37.2
Các chất hữu cơ
Myo-inositol 100 mg/l Nicotinic aAcid 0.5 mg/l
Pyridoxine HCl 0.5 mg/l Thiamine HCl 0.1 mg/l

IAA 1-30 mg/l Kinetin 0.04-10
Glycine (recrytallized) 2.0 g/l Edamine 1.0 g/l
Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l
Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS
nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Tên hoá chất
Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x20) (mg/lít)
- MgSO
4
.7H
2
O 370 7.400
- KH
2
PO
4
170 3.400
- KNO
3
1.900 38.000
- NH
4
NO
3
1.650 33.000
- CaCl
2

.2H
2
O 440 8.800
Pha stock khoáng vi lượng
Tên hoá chất
Nồng độ
môi trường
nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung
dịch stock (x100)
(mg/lít)
Nồng độ dung
dịch stock(x1000)
(mg/lít)
H
3
PO
3
6,2 6200
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 22300
ZnSO
4
.4H
2
O 8,6 8600

Na
2
MoO
4
.2H
2
O
0,25 250
KI 0,83 830
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 25 2500
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 25 2500
Tên hoá chất
Nồng độ môi
trường nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x200) (mg/lít)
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 5560

Na
2
EDTA 37,3 7460
Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ
đậm đặc 500 lần (x500)
Tên hoá chất
Nồng độ môi
trường nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x500) (mg/lít)
Acid nicotinic 0,5 250
Thiamin HCl 0,1 50
Pyridoxin HCl 0,5 250
Myo-inositol 100 50.000
Glycine 2 1.000
Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)
Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:
- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher.
- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn
- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều.
- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều.
- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều.
- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500.
- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy.
- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000
ml
- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8.
- Bổ sung 6-8 g agar.
- Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy,

cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50
o
C. Hấp khử trùng
(đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung
vào môi trường sau khi hấp). Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25
o
C.
Thời gian hấp tiệt trùng (ở 121
o
C) môi trường
nuôi cấy mô thực vật
Thể tích môi
trường trong bình
chứa (ml)
Thời gian hấp
tối thiểu (phút)
Thể tích môi
trường trong bình
chứa (ml)
Thời gian hấp
tối thiểu (phút)
25 20 500 35
50 25 1.000 40
100 28 2.000 48
250 31 4.000 63
Chọn mô cấy
Chọn mô cấy
Nguồn gốc mẫu cấy
Kích thước
mẫu

Mẫu được tách
Đỉnh sinh trưởng (Meristem) 0,5 ÷ 1 mm Tế bào đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh (Shoot tips) 0,5 ÷ 1 cm Chóp đỉnh có chứa một phần thân
Chồi bên (Axillary bud) 0,5 ÷ 1 cm
Chồi bên có chứa một phần thân, lá
và chồi nách
Mẫu lá (Leaf partioles) 0,2 ÷ 0,3 cm
Mẫu lá được cắt nhỏ, phân nửa được
cấy chìm vào môi trường
Phiến lá (Leaf blades) 0,2 ÷ 1 cm
Phiến lá non được đặt trên môi
trường, mặt dưới đặt trên mặt thạch
Rễ (Roots) 0,5 ÷ 1 cm Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch
Dạng hành (Bulbs) 1 ÷ 2 cm
Mẫu được đặt trên mặt hay được cấy
chìm phân nửa vào môi trường
Hạt nảy mầm (Seedings) 2 ÷ 3 mm Chồi non
Hạt phấn (Anthers) 0,1 ÷ 0,5 mm Hạt phấn trong túi phấn