Điều kiện kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật slide - Bài giảng quan trọng

LOGO
Chương 2. ĐIỀU KIỆN KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TÉ BÀO THỰC VẬT
*PowerPoint 2002 and up required to use the template.
Các nội dung chính

2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng

2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô
và tế bào thực vật

2.1.2 Khử trùng

2.1.2.1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy

2.1.2.2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ
khác

2.1.2.3 Khử trùng mẫu cấy thực vật

2.2.1 Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế
bào thực vật

2.2.1.1 Các chất khoáng

2.2.1.2 Các nguyên tố đa lượng

2.2.1.3 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )

2.2.1.4 Các vitamin


2.2.1.5 Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô

2.2.1.6 Các chất điều hoà sinh trưởng

2.2.1.7 Các chất kháng sinh

2.2.2. Các chất khử trùng

2.3 Độ pH môi trường

2.4 Các tác nhân làm rắn môi trường

2.5 Một số loại môi trường cơ bản

2.6 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

2.6.1 Các thiết bị , dụng cụ cần thiết của phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô

2.6.1.1 Phòng rửa và cất nước:

2.6.1.2 Phòng sấy hấp:

2.6.1.3 Phòng chuẩn bị môi trường:

2.6.1.4 Phòng cấy vô trùng

2.6.1.5 Phòng nuôi mẫu cấy:

2.6.1.6 Phòng sinh hóa :

Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô
và tế bào thực vật
- mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô
và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt
Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.2 Khử trùng

2.1.2.1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy
Hơi formon
Đèn cực tím
Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.2.2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác
Dụng cụ:
-Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng
-vô trùng bằng cách sấy ở 160
0
C/giờ
-nhúng vào cồn 95
0
và đốt trên ngọn lửa đèn cồn
Nút đậy:
-bông không thấm nước
-nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 120
0
C mà không bị biến dạng
Môi trường

-môi trường khoáng được hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm
-phin lọc micropore
Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.2.3 Khử trùng mẫu cấy thực vật

Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:

Đỉnh sinh trưởng thân, rễ

Chồi bên

Tượng tầng

Vảy củ

Chồi ngọn

Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân

Chồi nảy từ củ
Bảng 2.2. Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử
lí mô cấy thực vật
Stt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử
trùng (phút)
Hiệu quả
1 Hypochlorite
calcium
9-10% 5-30 Rất tốt
2 Hypochlorite

sodium
0,5-5% 5-50 Rất tốt
3 Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt
4 Oxy già 3-12% 5-15 Tốt
5 Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt
6 Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt
7 Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá
Quy trình khử trùng bề mặt

1. Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao
tác với dung dịch khử trùng.

2. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10 - 30
phút.

3. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng
trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ
trong thời gian khử trùng.

4. Chắt dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần
bằng nước cất vô trùng.
Quy trình khử trùng thường được áp
dụng:

1. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy khoảng 30
phút.

2. Nhúng ngập mẫu trong cồn 70%.

3. Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 10%

cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 15 phút.

4. Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 5%
cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 10 phút.

5. Rửa lại mẫu 3 lần với nước cất vô trùng.
Môi trường Nuôi cấy mô tbtv

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino axít

- Nguồn các- bon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch
chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối
khô

- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các
loại thạch (agar)
Tại sao cẩn
những chất này?
Các muối khoáng đa lượng và vi
lượng

- Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P ) cho sự tổng hợp

các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần
không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều
chất hữu cơ khác. Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở
thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định
màng sinh học.

- Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều
enzym (là các co-factor): Magie, kẽm, sắt và nhiều nguyên tố vi
lượng là những phần quan trọng của các enzym.

- Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp
suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của
thực vật. Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc
của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.
2.2.1.1.1 Các nguyên tố đa lượng

NH4NO3 Ammonium nitrate

KNO3 Potassium nitrate

CaCl2 -2 H2O Calcium chloride (Anhydrous)

MgSO4 -7 H2O Magnesium sulfide (Epsom Salts)

KH2PO4 Potassium hypophosphate

FeNaEDTA Fe/Na ethylene-diamine-tetra acetate

H3BO3 Boric Acid


MnSO4 - 4 H2O Manganese sulfate

ZnSO4 - 7 H2O Zinc sulfate

KI Potassium iodide

Na2MoO4 - 2 H2O Sodium molybdate

CuSO4 - 5 H2O Cupric sulfate

CoCl2 - H2O Cobaltous sulfide(C)
a. Nguồn carbon (C)

Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu
và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi
trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi
xanh có khả năng quang hợp

nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ
thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm
xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12%

lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,
melibiose và trehalose, tinh bột, pectine, dextrine ??
b. Nitơ (N):

Nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium
(NH4+). Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat
(KNO3), nitrat amon (NH4NO3) và canxi nitrat
(Ca(NO3)2.4H2O). Những hợp chất này cung cấp nitơ

vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ
phức tạp.

Nitrogen – ảnh hưởng chỉ số phát triển của cây, đặc
biệt trong quá trình phát triển của nhân, protein, diệp lục,
amino acid và các hocmon.

Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường
nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục
đích nghiên cứu.
c. Phospho (P):

Phosphorus – có nhiều trong đỉnh sinh trưởng, các mô
phát triển nhanh, quan trọng trong quá trình quang hợp,
hô hấp.

Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng
hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.

Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp
dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium
hay sodium.

Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ
làm giảm sự tăng trưởng của mô, Nồng độ ion
photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9 mM,
trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa
photphate khoảng 1.3 mM.
d. Lưu huỳnh (S):


Sulfur – Tham gia trong chuyển hóa của ti
thể và hệ thống quang tông hợp, thành
phần của aminoacids và enzimes

Lưu huỳnh như SO
4
2-
được hấp thụ ở rễ cây với
tốc độ chậm. Giống như nitrat, lưu huỳnh phải
được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp
các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít,
protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa khử
được kết hợp trong các sulpholipid và các
polysaccharid.
e. Kali (K):

Potassium – cần thiết cho phân chia tế bào, mô phân
sinh, tham gia chu trình C, Protein và quang tổng hợp.

K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân
bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển
qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa
pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự
thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ
dẫn đến tình trạng thiếu nước.

K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl. 6H2O,
KH
2
PO

4
f. Canxi (Ca):

Calcium – tham gia biệt hóa thành tế bào,
phát triển lá và rễ. Đặc biệt trong chuyển hóa
đường, amino acids

Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự
phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng
của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là
auxin và cytokinin.
g. Magiê (Mg):

Magnesium – tham gia qt quang tự dưỡng
và hệ thống hô hấp, hoạt hóa photphate và vận
chuyển photphate và tinh bột.

Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa
Mg với nồng độ không thay đổi nhiều trung bình
là 6,8mM. MgSO4 là nguồn bổ sung ion Mg+
duy nhất cho mô cấy.
2.2.1.1.2 Các nguyên tố vi lượng (Fe,
B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa
lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM. Các
nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi
trường ở nồng độ < 0.5 mM.

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng

không thể thiếu cho sinh trưởng
a. Sắt (Fe):

Trong cây, sắt chủ yếu được gắn với các phức
chất. Hàm lượng Fe2+, Fe3+ tự do rất thấp (10-
10 mM). Hầu hết thực vật chỉ hấp thu Fe2+. Do
đó, Fe3+ cần được khử thành Fe2+ ở bề mặt rễ
trước khi nó được chuyển vào trong tế bào chất

– tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và
quang tự dưỡng. Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA
.
b. Bo (B):

Bo cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh
trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng
hợpcác base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như
cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid
phenolic.

Boron - tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp.
Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon