Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (417.66 KB, 54 trang )
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan
trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế
bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1960 tại miền
Nam và đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ những cuối
năm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mới phát
triển mạnh mẽ và được đưa vào ứng dụng. Trong đó kĩ thuật ni cấy mơ
tế bào thực vật là một trong những kĩ tht chính. Những thành cơng của
kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu
quả trong nhiều lĩnh vực, trong đó có bảo tồn ex situ những nguồn gen
quý hiếm. Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép chúng ta nhân nhanh một lượng
lớn cây giống trong ống nghiệm mà chỉ cần số lượng mẫu ít (thậm chí chỉ
cần một chồi). Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh trong ống nghiệm nhằm tạo
ra một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền.
Hiện nay, cây Ngưu tất được trồng và mọc chủ yếu ở Sapa, Tam
Đảo, Hà Nội... Do chúng được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền
với nhu cầu ngày càng tăng như: làm giảm cholesterol trong máu, hạ huyết
áp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị các bệnh về khớp…
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất
(Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật” nhằm nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Ngưu tất trong
ống nghiệm.
Nguyễn Trần Dinh
1
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
Mục đích và u cầu
Mục đích
Nghiên cứu quy trình nhân nhanh và bảo tồn cây Ngưu tất trong ống
nghiệm bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Yêu cầu
Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm.
Xác định mơi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Ngưu tất.
Xác định mơi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất.
Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất ra ngoài tự nhiên.
Nguyễn Trần Dinh
2
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất
1.1.1. Đặc điểm sinh học
Tên việt nam: Cây Ngưu tất
Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume
Thuộc họ Giền (Amaranthaceae).
Đặc điểm hình thái:
Ngưu tất là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụ
dài, có nhiều rễ phụ. Thân phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía.
Cành mọc gần như thẳng đứng. Lá mọc đối xứng hoặc hình mác. Gốc
thn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân lá
mặt trên thường có màu nâu tía, mép lá uốn lượn, cuống lá dài từ 1-1,5 cm.
Cụm hoa là một bông dài từ 2-5 cm, mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành,
hoa rất nhiều, thường gập xuống sít vào cuống của cụm hoa, sau khi đã nở
lá bắc dài 3mm, 5 lá dài, 5 nhị, bầu hình trứng. Hoa mọc hướng lên nhưng
khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, hình bầu dục, chỉ chứa
một hạt [29] [30].
Cây thường mọc ở Trung Quốc và Đông Nam Á, trong đó có Việt
Nam. Cây Ngưu tất thích hợp gieo trồng ở điều kiện của nước ta và phát
triển tốt, được trồng nhiều ở vùng núi cao, trung du và đồng bằng nhất là ở
Đồng Bằng Bắc Bộ: Hưng Yên; Hà Nội; các trung tâm nghiên cứu cây
trồng và chế biến cây thuốc [29].
Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn. Đất phù sa cao ráo,
thoát nước rất phù hợp với cây Ngưu tất [32].
Nguyễn Trần Dinh
3
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
Thành phần hóa học
Rễ chứa các Saponin, khi thủy phân cho các Sapogenin là axit
oleanolic. Rễ Ngưu tất có chứa axitd oleanolic 0,096%, saponin toàn phần
4,04% và axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranosid.
Rễ còn chứa ecdysteron và inokosteron. Hàm lượng ecdysteron khoảng
0,037%. Ngồi ra cịn có ecdysteron, inokosteron, glucose, galactose,
rhamnoza, muối kali và một số thành phần khác như betain,
polysaccharide, emodin, physcion [31].
1.1.2. Giá trị cây Ngưu tất
Giá trị y học
Ngưu tất vị đắng, chua, tính bình, quy vào hai kinh can, thận. Tác
dụng hoạt huyết, thông kinh, hoạt lạc, mạnh gân cốt, lợi niệu trừ sỏi, hạ
huyết áp, giảm cholesterol trong máu, giải độc chống viêm [30].
Tác dụng dược lý:
- Chống viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn tính của
phản ứng viêm.
- Gây teo tuyến ức chuột cống đực non. Tác dụng gây teo tuyến ức là
một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch.
- Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây
tăng cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong
cơ thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian
tác dụng kéo dài. Có độc tính thấp.
- Chế phẩm Solamin trong thành phần có Ngưu tất và một số dược
liệu khác đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng
chống viêm và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng. Kết quả tốt nhất và tương đối
nhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Ðối với viêm đa khớp
dạng thấp, chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn
Nguyễn Trần Dinh
4
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt. Khi đã có biến dạng về xương, cơ,
khớp, kết quả kém. Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể.
Công dụng
Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt,
đái ra máu hoặc sỏi, bụng dưới kết hịn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai
không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu
gối nhức mỏi. Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối,
tay chân co quắp hoặc bại liệt [30].
Giá trị kinh tế
Cây Ngưu tất là loại cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉ
cần đất pha cát, tơi xốp, nhiều mùn, đất phù sa cao ráo, thốt nước là có thể
phát triển tốt. Nó khơng địi hỏi tốn cơng chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao
nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng.
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
1.2.1. Lược sử phát triển
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát
triển. Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính tồn
năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Các
giai đoạn chính của kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật [1] [3] [9] [15].
- Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã
đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là thuyết tế bào và nêu rõ:
+ Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức
nhỏ nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó.
Nguyễn Trần Dinh
5
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Người đầu tiên là Haberlandt (1898) đề xuất ra lý thuyết về tính tồn năng
của tế bào, ơng cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết của Schleiden
và Schwann vào thực nghiệm. Ơng đã đề xuất phương pháp ni cấy mơ tế
bào thực vật để chứng minh tính tồn năng của tế bào.
Theo ơng, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang tồn bộ
lượng thơng tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Vì vậy,
khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ
thể hồn chỉnh. Haberlandt đã ni cấy mơ cây một lá mầm nhưng chưa
thành công.
- Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy
đầu rễ cây hịa thảo kéo dài 12 ngày trong mơi trường lỏng gồm có muối
khống, glucose.
- Năm 1934, White (Mỹ) đã ni cấy thành công trong một thời gian
dài đầu rễ cây cà chua với mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose và
nước chiết nấm men. Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế
nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1),
Piridoxin (B6), axit nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc
nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus
nigra. Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung
glucose và cysteinhyochloride.
- Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật
đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và
hình thành rễ.
- Năm 1938 Gautheret đã thành cơng trong việc duy trì sự sinh
trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch
bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần.
- Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh
trưởng của nước dừa trong ni cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này,
Nguyễn Trần Dinh
6
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được
nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành cơng như: α-napthyl axetic axit
(NAA), và 2,4 Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận
thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia
tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó ni cấy.
- Năm 1954, Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin)
là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta
cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngơ có hoạt tính tương tự Kinetin. Cả 2
chất này đều thuộc nhóm Cytokinin.
- Năm 1960, Bergman đã phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên
một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo
trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm
1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào
thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast).
- Guha và Maheswari (1964) công bố tạo thành công cây đơn bội từ
nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược.
- Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn
bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội
vào công tác giống và nghiên cưu di truyền.
- Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ
protoplast thuốc lá giống Xanthi.
- Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
- Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
- Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua
Flav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994
giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản
xuất đại trà tại Na Uy.
Nguyễn Trần Dinh
7
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
Đến nay đã có hàng trăm lồi cây được ni cấy mơ thành cơng với
nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao
phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai
đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã
được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [15].
1.2.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mơ và tế bào thực vật đó
là tính tồn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo
quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế
bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang tồn bộ thơng tin di truyền cần thiết
và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
thể phát triển thành một cơ thể hồn chỉnh.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ và tế bào thực vật là
kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ thuật
ni cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái
của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô
trùng) một cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ
sở đơn vị mơ, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến
cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [1] [13].
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
Mẫu nuôi cấy
Muashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấy
thích hợp, điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao
gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh
trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
+ Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến q trình ni cấy. Với
loài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi
nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi. Hơn
Nguyễn Trần Dinh
8
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến
số lượng và đường kính mơ sẹo qua ni cấy hạt phấn cây cà chua.
+ Cơ quan: Muashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và
mơ đều có khả năng sử dụng để nuôi cấy invitro. Mẫu nuôi cấy in vitro
khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy.
Theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu
ni cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.
+ Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong
năm của mẫu ni cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa và
tuổi của sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý
mẫu nuôi cấy. Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát
sinh trên lá già.
+ Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu
cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên
đồng ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea.
+ Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh
hưởng rất quan trọng đến ni cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu
nuôi cấy nhất là đối với những cây bị bệnh,nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ
có một số lượng lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [13].
Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho ni cấy mơ là từ 20-27oC. Theo
Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát
triển trong q trình ni cấy in vitro qua những tiến trình sinh lý như hơ
hấp hay hình thành tế bào cơ quan.
Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng
trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh.
Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các lồi, có lồi chịu ánh sáng cao,
Nguyễn Trần Dinh
9
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
có lồi chịu ánh sáng thấp hay tối, có lồi chịu ánh sáng trung bình. Việc
ni cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [12].
Môi trường nuôi cấy
Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp trong ni cấy mơ tế bào là
rất cần thiết. Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chất
dinh dưỡng khác nhau. Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vào
sự phân hóa cua mơ cấy, tùy theo trường hợp duy trì mơ ở trạng thái mơ
sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Việc lựa chọn môi trường
cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng ni cấy hoặc thăm dị một số
mơi trường đã cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy.
Chất kích thích sinh trưởng thực vật (KTSTTV)
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trị rất quan trọng trong kĩ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích
ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được q trình phát sinh
hình thái của mẫu ni cấy. Auxin và Cytokinin là hai nhóm chất kích thích
sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng
của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là
khi nó được phối hợp sử dụng với nhóm Cytokinin. Sự áp dụng loại và
nồng độ Auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
+ Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu.
+ Hàm lượng Auxin nội sinh có trong mẫu ni cấy.
+ Sự tác động qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh.
Đặc tính của Auxin
Auxin có vai trị kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Đặc
điểm chung của các Auxin là kích thích sự phân chia tế bào. Các hoocmon
Nguyễn Trần Dinh
10
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
của nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tính
hướng đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn.
Auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bào
làm cho kích thước tế bào tăng lên. Các Auxin thường liên quan đến độ dài
của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, Auxin
được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ.
Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy ô tế bào thực vật:
+ IBA (3-indol Butyric Axit)
+ IAA (Indol-3-Axetic Axit)
+ NAA (α-Naptalen Axetic Axit)
+ 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit)
Đặc tính của Cytokinin
Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnh
hưởng đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi
trong ni cấy mô tế bào thực vật. Các Cytokinin được sử dụng thường
xuyên nhất là:
+ BAP (6-Benzyl Amino Purin)
+ Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin)
+ Zeatin
Hàm lượng của các loại Cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đến
sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ của
chồi ni cấy. Trong các loại Cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hai
loại hay được sử dụng nhiều nhất.
Ngồi hai nhóm Auxin và Cytokinin, trong ni cấy mơ tế bào thực
vật người ta cũng sử dụng thêm Gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào,
qua đó làm tăng kích thước của chồi ni cấy. GA (Gibberellic axit) là loại
Gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm
Nguyễn Trần Dinh
11
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vơ trùng. Vì vậy, muốn
sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vơ trùng, sau đó đưa vào môi
trường nuôi cấy [16].
1.2.4. Các phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân
giống vơ tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng…
Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn
lĩnh vực ứng dụng chính của cơng nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus,
nhân nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp
chất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang
lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [1].
Có ba phương thức để tạo cây in vitro:
a. Hoạt hóa chồi nách
Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi
nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp
này thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:
- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi
ni cấy lồi cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… )
- Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một
lá mầm như lúa, mía…).
b. Tạo chồi bất định
Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan, các bộ phận khác của
cây, khơng phải là phơi. Ví dụ: Chồi hình thành từ callus (mô sẹo).
Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn
thân, mô lá, giẻ hành,… Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản
phân hóa và q trình phân hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc
gián tiếp thơng qua giai đoạn phát triển mô sẹo.
Nguyễn Trần Dinh
12
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
c. Tạo phơi vơ tính
Trong q trình ni cấy in vitro, phơi có thể hình hành từ các tế bào
soma gọi là phơi vơ tính. Các phơi vơ tính có thể tái sinh thành cây hồn
chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo.
Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phơi vơ tính cũng cần thực hiện hai
q trình phản phân hóa và q trình phân hóa để tách các tế bào soma hình
thành phơi trực tiếp hoặc gián tiếp thơng qua giai đoạn phát triển của mơ
sẹo. Sự hình thành phơi trải qua hai bước chính:
Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phơi. Trong
q trình này cần mơi trường giàu Auxin, vì Auxin giúp cho việc cảm ứng
để tạo các tế bào phơi, đồng thời nó cịn giúp kích thích cho q trình phát
triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào
có khả năng phát sinh phơi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân,
khơng có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin.
Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Mơi trường ni cấy
của giai đoạn này phải nghèo hoặc khơng có Auxin, với nồng độ Auxin cao
thích kích thích sự tạo thành phơi nhưng ức chế q trình phân hóa và q
trình phát triển tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết
sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu
nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ức
chế hoặc gây độc [12].
Các bước chính trong nhân giống in vitro
Theo George (1993) q trình nhân giống vơ tính in vitro bao gồm
các bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là
Nguyễn Trần Dinh
13
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc
trồng các cây mệ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc
và phịng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và
sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu
như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng
và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát
triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh
chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng
nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phơi vơ
tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều
kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo ngun tắc chung,
mơi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1:
thì kích thích tạo chồi). Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếu
sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại
đối tượng ni cấy khác nhau địi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi
trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại
cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta khơng bổ sung Auxin.
Bước 5: Đưa cây ra ngồi vườn ươm
Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải
đảm bảo một số yêu cầu sau:
- Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá.
- Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt.
Nguyễn Trần Dinh
14
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ
dinh dưỡng thích hợp.
1.2.5. Phương pháp nhân đa chồi
Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các
nách lá cấy vào môi truờng có chứa Cytokinin với nồng độ cao. Vai trị của
Cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có
thể phát triển. Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang mơi trường mới
có bổ sung Cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác. Sau đó các chồi này
được chuyển sang mơi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ
hồn chỉnh.
Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì:
- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác.
- Tốc độ nhân giống cao.
- Các cây đồng đều về mặt di truyền.
- Cây con tăng trưởng rất tốt.
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:
- Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ).
- Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn ni
cấy, những mơ cấy cịn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởng
thành.
- Thơng thường trong q trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxin
với nồng độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ
Auxin/Cytokinin thường 1/10.
- Đôi khi nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độ
Cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên.
- Trong trường hợp chồi bên khơng tăng trưởng được thì cần phải cắt
bỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển.
Nguyễn Trần Dinh
15
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Khơng nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin
q cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.
- Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên
bằng cách cấy vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng này cần lắc hay
khơng lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm.
- Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi.
Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp
dụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường được thực hiện
theo các bước như sau [5].
Cây tự nhiên
Khử trùng mẫu
Nhân đa chồi
Trồng cây ngoài
Trồng cây trong
Tạo cây in vitro
tự nhiên
bầu
hoàn chỉnh
Sơ đồ tổng qt nhân nhanh trong phịng thí nghiệm
1.2.6. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm một loạt các kỹ thuật khác
nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm [12].
Kỹ thuật
Nuôi cấy hạt giống
(Seed culture)
Nguyễn Trần Dinh
Ứng dụng
- Tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy
mầm trong điều kiện bình thường.
- Thúc đẩy quá trình nảy mầm bằng cách bổ
sung các chất điều tiết sinh trưởng.
- Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy mô phân
sinh hoặc các bộ phận khác.
16
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
Hoa cái
(Bầu quả, noãn)
- Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa.
- Tạo cây đơn bội.
- Tạo đa phôi.
Hoa đực
(Bao phấn và hạt phấn)
- Tạo mô sẹo và cây đơn bội.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử.
Phôi hợp tử
- Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa.
- Nhân các dòng lai xa.
- Phá sự ngủ, nghỉ của hạt.
Mơ sẹo
- Tạo phơi vơ tính.
- Ni cấy tế bào đơn và tách tế bào trần.
- Tạo cây có biến dị soma.
Tế bào
- Tạo đột biến ỏe mức độ tế bào.
- Tạo tế bào trần để lai vơ tính.
- Biến nạp gen.
- Nuôi cấy tế bào đơn.
Đỉnh chồi
(Đỉnh sinh trưởng)
- Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di
truyền.
- Làm sạch virus.
- Nghiên cứu sinh lý phát triển.
Phân hóa phơi vơ tính
(Somatic
embryogenesis)
- Là đường hướng tái sinh chủ yếu ứng dụng:
+ Nhân nhanh
+ Sản xuất hạt nhân tạo
- Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả
năng tạo phơi.
- Cho phép cơ khí hóa q trình ni cấy và sử
dụng bioreactor.
Đột biến soma
- Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý
tưởng song cũng thiếu một số tính trạng mong
muốn.
- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp
chất sơ cấp và thứ cấp.
- Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng
bệnh, chống chịu ngoại cảnh tốt hơn.
- Tạo các biến dị di truyền khơng qua lai hữu
tính ở những dòng ưu tú.
Nguyễn Trần Dinh
17
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Nguyễn Trần Dinh
Viện Đại Học Mở Hà Nội
18
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3. Thành tựu và các phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật in vitro
1.3.1 Thành tựu
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những
phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó
nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và
ứng dụng thành cơng trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật.
Trong nước:
Tác giả Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công
nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte) ở VQG
Cúc Phương, nghiên cứu này đã sử dụng phôi hạt xanh của quả Vù hương
để nuôi cấy và tạo đa chồi bằng kỹ thuật tách phôi hạt xanh, các cây có
nguồn gốc từ ni cấy mơ đã được trồng trở lại rừng tự nhiên và cây con
phát triển bình thường. Cây Vù hương có tên trong danh sách các loài bị đe
dọa ở Việt Nam [2].
Tác giả Hoàng Thị Nga (2011), nghiên cứu xây dựng thành cơng
quy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào thực vật [8].
Những nghiên cứu của Trần Văn Minh và cs cũng đã thành công
trong việc nhân giống và bảo tồn nhiều loài cây quý hiếm như: Cây Trầm
hương, cây Giá tỵ (Tectona grandis Linn F) và cây Lát hoa Côn Đảo
(Chukrasia tabularis A. Juss). Thành công trong việc nhân giống in vitro
cây Trầm hương có ý nghĩa hết sức to lớn, nó cho phép phục hồi, phát triển
cho những khu vực trồng Trầm hương thuận lợi. Hơn thế nữa, việc sử dụng
cây giống có nguồn gốc từ ni cấy mơ có chất lượng cao sẽ giúp cho
người trồng rừng Trầm hương tốt và đồng nhất về kiểu gen [6] [7].
Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2003) đã nuôi cấy cây Lõi thọ
(Gmelina arborea Roxb) bằng phương pháp quang tự dưỡng. Đặc diểm
chính của phương pháp này là không sử dụng đường, vitamin và hạn chế sử
Nguyễn Trần Dinh
19
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong mơi trường nhân giống.
Đồng thời tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình ni cấy sử dụng khí CO2
có sẵn trong khơng khí làm nguồn cacbon chính cho q trình tăng trưởng
và phát triển của cây. Cây Lõi thọ đã phát triển rất tốt trong điều kiện
quang tự dưỡng [10].
Viện nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen ở VQG Bạch Mã đã nghiên cứu
thành cơng và bảo tồn một số lồi q hiếm có nguy cơ tuyệt chủng như:
- Hồng Đàn giả (Dacrydyum elatum (Roxb) Wallich ex Hooker) là đối
tượng quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, phân bố trên các đỉnh núi cao ở
VQG Bạch Mã.
- Cây Hồi hoa nhỏ (Illicium parvifolium Merr) là lồi thực vật q
hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, thuộc dạng nguy cấp. Đây là lồi có giá
trị trong sản xuất tinh dầu hồi, đã có chương trình khoanh vùng bảo vệ
nghiêm ngặt những khu vực có sự phân bố của cây này theo hướng bảo tồn
in situ ở VQG Bạch Mã [4].
- Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L) được sử dụng như
là một vị thuốc trong việc phòng và chữa trị một số loại ung thư. Cây Trinh
nữ hồng cung có củ giống củ hành, chùm hoa giống chùm hoa cây láng
trắng, thường được trồng làm cảnh hoặc làm thuốc. Trong lĩnh vực làm
thuốc, người ta dùng lá cây Trinh nữ hoàng cung thái nhỏ rồi sao vàng sắc
uống để đề phòng và chữa trị ung thư tử cung, u tiền liệt tuyến. Tác giả Lưu
Trường Sinh và cs đã nhân giống thành cơng cây Trinh nữ hồng cung theo
phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương
pháp truyền thống [11].
- Berberin được chiết xuất từ cây Hoàng liên gai (Berberis
wallichiama DC) để làm thuốc điều trị các bệnh đường ruột và đau mắt hột
nhưng do khai thác quá mức nguồn nguyên liệu này trong tự nhiên đã bị
cạn kiệt. Vì vậy, các nhà khoa học Viện công nghệ sinh học đã lấy quả
Nguyễn Trần Dinh
20
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
xanh của cây Hoàng liên gai ở vùng núi Sapa, tách lấy phôi và đưa vào
nuôi cấy đẻ tạo mô sẹo và thu sinh khối. Sau một thời gian ngắn, sinh khối
thu được từ rễ cây Hoàng liên gai tăng gấp 10 lần so với số lượng mẫu ban
đầu. Đặc biệt khối mơ tế bào này chứa berberin có chất lượng tương đương
với rễ cây Hồng liên gai trong tự nhiên. Vì vậy các kết quả nghiên cứu
thành công này của Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và công nghệ
Việt Nam) không chỉ giúp các cơ quan sản xuất chủ động nguồn dược liệu
mà cịn góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý của nước ta [1] [2].
Thế giới:
- Tác giả Pereira AM và cs (2003) đã nhân và bảo tồn cây thuốc
Anemopaegma arvense, nghiên cứu này đã nuôi cấy để bảo tồn cây A.
arvense trong ống nghiệm trên mơi trường MS có chứa 4% đường sorbitol,
kết quả cho thấy sau 6 tháng mới cần phải cấy chuyển một lần [28].
- Các nhà khoa học Đức đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi
cấy mô tế bào thực vật trong việc phục tráng và nhân giống một số loài
thuộc chi Grevillea, trong đó có một số lồi gần như là tuyệt chủng:
Grevillea scapgera, Grevillea banksii, Grevillea batrachioides [26].
- Tác giả Joshi và cs đã nhân giống thành công giống cây
Saussurea obvallata, một loại dược thảo quý hiếm bằng việc áp dụng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật . Sau thời gian 15 ngày nuôi cấy
và 12 ngày thích nghi với điều kiện mơi trường bên ngồi có 66,7% cây
đã thích nghi với mơi trường tự nhiên [22].
- Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành cơng quy trình tái
sinh một số giống tre q như: Dendrocalamus asper (tre Mạnh tơng),
Bambusa multiplex (cây Hóp) thơng qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên [27].
- Năm 2003, Bedir E và cs đã nhân giống in vitro thành công giống
Hydrastis canadensis, một lồi thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc
nước Mỹ [18].
Nguyễn Trần Dinh
21
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Gần đây các tác giả Balaraju và cs (2008) cũng đã nhân giống và tái
sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnuscastus bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung
0,1mg/l IBA [17].
- Các tác giả Nishritha B và cs (2008) đã nhân giống in vitro thành
công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn. Cùng
năm đó Mukherjee và cs cũng đã nhân giống in vitro loài Aloe vera sp [26].
- Bên cạnh đó tác giả Park SU và cs (2009) cũng đã tái sinh thành
cơng lồi Rehmannia glutinosa L q hiếm đang bị khai thác q mức [27].
- Ngồi ra vẫn cịn nhiều loại cây dược liệu quý hiếm khác cũng đã
được nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia
inermis Linn, Saussurea lappa… [19]
1.3.2. Phương pháp bảo tồn thực vật quý hiếm
Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: in situ và ex situ.
Bảo tồn in situ
Đây là biện pháp bảo tồn huữ hiệu nhất, đặc biệt với những lồi cây
bản địa có sự phân bố tập chung và có khả năng tái sinh tự nhiên. Bảo tồn
in situ được đề xuất cho hầu hết các loại cây rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi
vì các lồi cây này thường là khó tạo thành rừng khi trồng đơn lồi hoặc
khó tái sinh ngồi mơi trường sống tự nhiên [25].
Bảo tồn in situ còn bao hàm các quần thể tái sinh nhân tạo bằng
nguồn hạt giống thu hái tại chỗ từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có định
hướng. Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các
loài cây có phân bố rải rác. Như vậy, quần thể bảo tồn được dùng làm
nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làm
giàu rừng và cải thiện di truyền.
Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình
thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm:
Nguyễn Trần Dinh
22
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
- Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho các loài sao cho
các cá thể vẫn giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài.
- Kết hợp bảo tào với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái
sinh nhân tạo, xây dựng quần thể bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng
giống và phục vụ trồng rừng [1].
Bảo tồn ex situ
Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu
nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây
sống (Vườn thực vật), rừng trồng với mục đích bảo tồn (quần thể bảo tồn
ex situ, ngân hàng hạt giống, phấn hoa hay ni cấy mơ).
Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là:
- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu
- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài
- Làm tăng số lượng mẫu thu thập
Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loài cây trồng chủ yếu, các
lồi cây đó đã biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên
khơng được bảo vệ an tồn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá
hoại của động vật hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể
ngoại lai khác [19] [21].
Nguyễn Trần Dinh
23
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Nguyễn Trần Dinh
Viện Đại Học Mở Hà Nội
24
Lớp CNSH 07-02
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Giống cây Ngưu tất do Trung tâm ni cây mơ thực vật Thanh Hóa
cung cấp.
Dụng cụ, hóa chất:
Dụng cụ nghiên cứu là các dụng cụ như panh, dao, kéo, box cấy vô
trùng, đèn UV, cân kĩ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi
hấp tiệt trùng, máy đo pH, máy khuấy từ…
Hóa chất: Môi trường cơ bản MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các
muối đa lượng, muối vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige
và Skoog (1962) [24], đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh
trưởng như BAP, IAA, NAA, Kinetin, IBA,…
Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25-27oC, chế độ chiếu sáng 12/12h
với cường độ chiếu sáng là 2000lux.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật
và Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện từ 5/2010 - 5/2011, theo đơn
đặt hàng của Trung tâm nuôi cấy mơ thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học và
Cơng nghệ Thanh Hóa.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí
nghiệm khác nhau, có cơng thức đối chứng;
- Số mẫu của mỗi cơng thức đủ lớn;
- Thí ngiệm được lập lại ít nhất ba lần;
Nguyễn Trần Dinh
25
Lớp CNSH 07-02
