Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Aduncum

Đồ án tốt nghiệp 1
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống
tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh
quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết. Hoa
lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích
thước phong phú và đa dạng nên chúng được trồng và sản xuất khá phổ biến.
Dendrobium aduncum hay còn gọi là Hồng câu hay Thạch hộc móc, lan
móc, Hoàng thảo thân gãy, Câu trạng thạch hộc. Đây là loài lan rừng có hoa nhỏ
mọc thành chùm, nằm trong chi Lan Hoàng Thảo. Lan Dendrobium aduncum
hay phong lan nói chung hiện đang được nhiều người ưa chuộng trong nước cũng
như trên thế giới.
Ở Việt Nam phần lớn lan được trồng hiện nay là được đem từ rừng về
hoặc nhân giống bằng phương pháp truyền thống như tách nhánh, gieo hạt,…Tuy
nhiên, việc nhân giống này cho hiệu quả không cao, chất lượng cây giống không
đảm bảo. Do đó, không đáp ứng đủ nhu cầu cho người tiêu dùng trong nước cũng
như xuất khẩu.
Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy invitro vào quá trình nhân giống cây
phong lan là vấn đề đáng được quan tâm và nghiên cứu. Kỹ thuật này không
những giải quyết được những vấn đề khó khăn đang gặp phải trong việc nhân
giống lan mà còn giúp chúng ta chủ động sản xuất một số lượng lớn cây giống có
chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh.
Dựa trên cơ sở đó và kế thừa các công trình nghiên cứu trước chúng tôi
tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan
Dendrobium Aduncum” nhằm tìm được môi trường thích hợp mang lại hiệu quả
cao cho quá trình nhân giống cây Dendrobium aduncum.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về Dendrobium
1.1.1. Phân loại

Phong lan có vùng phân bố rộng lớn. Họ phong lan (Orchidaceae) với 750
chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt
kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm [14].
Việc phân loại phong lan khá phức tạp. Theo truyền thống cổ điển các nhà
khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ
Epiden droideae, phân họ Orchidaceae.
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau:
- Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi).
- Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng).
- Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên).
- Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế).
- Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng).
- Dendrobium (Hoàng thảo dẹt).
- Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá).
- Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng).
- Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ).
- Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu).
- Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung) [7].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái
1.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng
 Rễ: Rễ lan thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một
lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh
sang mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp
không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp.
 Thân: Lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ,
hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ
xuống.
 Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm

chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây
trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra, giả hành còn chứa
diệp lục tố nên có thể quang hợp. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa
dạng từ nhỏ đến lớn, hình cầu thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo
thành thân giả có lá mọc xen kẽ.
 Lá: Các lá lan mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng
một cuống hay thuôn dài thành bẹ ôm thân.
- Hình dạng và cấu trúc của lá rất đa dạng. Lá có hình kim, trụ có rãnh
hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mang nước, nạc, dai, có màu xanh bóng sẫm
hay nhạt là tùy thuộc vào vị trí sống của cây.
- Phiến lá trải rộng hay gập theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp
lại theo gân giữa như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn
những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy [6; 7].
1.1.2.2. Cơ quan sinh sản
 Hoa: Hoa lan Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa
mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn, cả trên
thân ngọn cây gọi là Keikei.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 4
- Biểu hiện trước khi ra hoa có sự khác biệt như: có nhiều loài rụng hết lá
trước khi ra hoa, thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết.
- Hoa mọc thành chùm đơn hay chùm kép hay từng hoa riêng lẻ. Cành hoa
dạng rũ xuống hay thẳng đứng. Giống Dendrobium thường có hoa lâu tàn, trung
bình từ 1-2 tháng. Thời gian nở hoa có khi là suốt năm.
- Cấu trúc hoa thì cực kì phong phú và hấp dẫn về hình dạng cũng như màu
sắc, tuy nhiên chúng luôn có các điểm chung sau:
+) Bao hoa có 2 vòng và 3 mảnh bao gồm 3 cánh đài và 3 cánh tràng. 3
cánh đài thường có dạng 3 cánh hoa giống nhau hay cánh lưng dài hơn 2 cánh
bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. 3 cánh tràng có 2 cánh bên rất giống với
các cánh đài rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng bên được gọi là cánh môi

có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn. Cánh môi có
dạng như: nguyên, chia thùy, khía răng, có ta viền hay chia thành các sợi mảnh.
+) Ở Dendrobium và hầu hết các chi phong lan khác có cấu tạo nhị, nhụy
nằm chính giữa hoa là dấu hiệu cơ bản để định dạng loại hoa phong lan. Trong
khoang nhỏ của cột nhị có đính 1 khối phấn có hàng trăm nghìn hạt phấn dính
lại. Khối phấn có thể chia thành 2 hay 4 được xếp thành từng đôi một trong
khoang. Thường có tinh bột, sáp hoặc có sừng cứng bao quanh khối phấn.
 Trái (quả): Quả lan thuộc loại quả nang. Khi chín các nang bung ra chỉ
còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên
hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát.
 Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên
hạt lan có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa. Sau 12-18 tháng hạt chín
phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp hạt
sẽ nảy mầm [6; 7].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 5
Hình 1.1: Cấu tạo cơ quan sinh sản
a. Cấu tạo hoa chi tiết; b. Quả lan chín
1.1.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium
1.1.3.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ
quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp
tăng lên gấp đôi. Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loại lan như lan
Bạch câu đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6
0
C trong vài giây thì 9 ngày sau sẽ nở
hoa đồng loạt,…
Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ có thể tạm chia Dendrobium thành các nhóm
chính sau:
- Nhóm Dendrobium ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý

tưởng là 15
0
C gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt Nam và
Miến Điện trên cao độ 1000m như: các loài Vảy cá (Dendrobium Linlleyi), Thủy
Tiên Tím (Dendrobium amabile), Long nhãn kim điệp (Dendrobium fimbriatum).
Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25
0
C, thì cây vẫn
sống, nhưng phát triển yếu hơn và hiếm bao giờ ra hoa.
- Nhóm Dendrobium ưa nóng, gồm đa số các giống Dendrobium rừng của
Châu {c, Indonesia, Malaysia và các loài của giống Dendrobium lai hiện được
trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam, nhiệt độ thích hợp cho
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 6
các loài của nhóm này là 25
0
C. Tuy nhiên các giống Dendrobium lai chịu được
một nhiệt độ cao hơn nhiều.
- Ngoài ra còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng
lạnh và vùng nóng, những ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như:
các loài Dendrobium Primulinum, Dendrobium fanmeri, Dendrobium
chrysotoxum nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 20
0
C [6; 7; 20].
1.1.3.2. Độ ẩm
Các cây lan, nhất là phong lan sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước
từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí. Chính độ ẩm quyết định sự hiện
diện của các loài phong lan.
Thông thường độ ẩm tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng
trưởng của nhiều loài. Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự

sinh trưởng của giống Dendrobium vì có thể toàn bộ rễ bị thối và biểu hiện là các
cây con mọc từ phần ngọn của thân. Tuy nhiên độ ẩm lý tưởng nhất vẫn là độ ẩm
của vùng bản xứ mà loài đó được tìm thấy [6].
1.1.3.3. Ánh sáng
Ánh sáng là điều kiện cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây
lan thông qua quá trình quang hợp. Đây là yếu tố quyết định sự trổ hoa của lan.
Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực
tiếp hay khuếch tán. Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%.
Nếu thiếu ánh sáng, cây lan bị thoái hóa r~ rệt, số lượng hoa cũng rất ít,
cây èo ọt. Trái lại, nếu thừa ánh sáng cây xấu đi vì bị vàng lá hoặc các giả hành
trơ trụi, teo lại nhưng cây sẽ thích nghi dần và vẫn đảm bảo cây ra hoa nhiều và
đẹp [6].
1.1.3.4. Nhu cầu phân bón
Dendrobium thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất
nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều dạng phân bón khác nhau. Còn các loại
Dendrobium thân thòng ăn phân yếu phải dùng nồng độ thật loãng.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 7
Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân
trâu bò khô,…có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới hoặc vò
chặt thành từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thu dần dần các dưỡng
chất được phóng thích qua quá trình tưới nước.
Các loại phân vô cơ được dùng, thường có công thức 30-10-10 dùng 3
lần/1 tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít. Trong suốt mùa tăng trưởng (từ đầu
tháng 5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốt
tháng 2) ta bón phân 10-20-30 làm 2 lần/1 tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây
trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay
phân 30-10-10 bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến kho hoa tàn.
Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn
giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kỳ tăng trưởng

hằng năm của nó [6; 7].
1.1.3.5. Sâu bệnh và các vấn đề khác
Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và
môi trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng. Đây là 2
nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại cho các loài dán và cuốn chiếu cắn phá rễ
trong giá thể.
Cách phòng trừ sâu bệnh:
a) Bệnh hại trên lan:
- Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp. gây nên.
Phòng trị: Nên tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ
hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm. Nếu cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi
phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000.
- Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp. gây nên. Bệnh thường phát sinh
mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có
độ ẩm cao. Phun thuốc trừ nấm (như trên).
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 8
- Bệnh thán thư: do nấm Collectotrichicum sp. gây ra. Bệnh phát triển
mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước. Thường cắt bỏ lá vàng rồi phun
thuốc diệt nấm 5 – 7 ngày/1 lần.
- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết
bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều
rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh
khô tóp có màu trắng xám.
 Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng
và tỷ lệ N:P:K phải cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm
bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K
hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ và đọt úng. Phun
thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 lần đến 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất
hiện cần phun nhiều hơn (1 tuần 2 đến 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm

thì trở lại phun theo cách phòng ngừa.
Các thuốc có thể sử dụng là: . Aliette 2/1000; Rovral 2/1000: trừ bệnh thối
đọt, thối cổ rễ ở cây con. . Zineb 2/1000, Maneb 2/1000, Captan 2/1000; Benlate
1/1000; cerezan 1/1000 Các thuốc có chứa gốc Cu (Đồng) chỉ nên sử dụng ở
cây trưởng thành và không nên dùng nhiều lần trong một thời gian ngắn. Lá bị
gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng.
b) Sâu hại lan:
Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non. Phòng trị bằng
cách: Dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng.
Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng. Dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít
nước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [6; 7; 20].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 9
1.2. Một số nghiên cứu về nhân giống lan Dendrobium
1.2.1. Trên thế giới
Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng
tăng nên việc nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium rất được quan tâm và phát
triển mạnh mẽ.
Tháng 6 năm 2006, S. Aktar & cs tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh
học USDA, Sở Công nghệ sinh học, Đại học Nông nghiệp Bangladesh,
Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong môi
trường có chứa nồng độ khác nhau của IBA (0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2.0 mg/l) và 1%
than hoạt tính. Kết quả ra rễ tốt nhất thu được từ môi trường chứa 1,0 mg/l IBA
[11].
Tháng 4 năm 2011, Sana Asghar & cs đã tiến hành nghiên cứu nhân
nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách sử dụng môi
trường có bổ sung benzylaminopurine (BAP) ở các nồng độ 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5
và 3,0 mg/l và kinetin (Kin) cũng như nước dừa (CW) với các thể tích khác nhau
50, 100, 150, 200, 250 và 300 ml. Qua nghiên cứu họ nhận thấy ở môi trường có
chứa 1,5 mg/l BAP kết hợp với Kin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo cây

hoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm rễ
(97,5%) số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA.
Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ
kém [12].
Tháng 8 năm 2010, M. Maridass & cs đã tiến hành nhân giống in vitro
phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiên cứu
này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệu thân rễ
được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùng
với hypoch natri 3% (bổ sung 2-3 giọt Tween 80 EAC ml) trong 20 phút và sau
đó rửa sạch cho 4-5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được trẻ ra cắt miếng
nhỏ (5mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của MS có bổ sung
các kích thích tố như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thành protocorm tốt
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 10
trên môi trường có chứa 2.0μM / l NAA và 1,2 μM / l kinetin. Sau đó protocorm
phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + 0.5μM / l BAP [13].
Năm 2011, trên tạp chí của trường đại học Khoa học & Công nghệ Assam
S. Dutta1, A. Chowdhuryl và cs đã đăng công trình nghiên cứu của mình về việc
phát triển và nhân nhanh giống lan Dendrobium aphyllum. Vật liệu được sử dụng
trong nghiên cứu này là các hạt lan Dendrobium aphyllum. Các quả lan mười lăm
tuần tuổi sau khi khử trùng, các hạt được tách ra và gieo trực tiếp lên môi trường
MS cơ bản. Sau năm tuần theo d~i nhóm nghiên cứu đã ghi nhận kết quả với tỷ lệ
nảy mầm và hình thành protocorm của hạt đạt 90,6%. Các protocorm tiếp tục
được cấy chuyển sang môi trường mới là môi trường MS cơ bản có bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng IAA và Kin riêng rẽ và kết hợp với các nồng độ khác
nhau. Kết quả ghi lại sau hai tuần theo d~i cho thấy các protocorm (PLBs) có sự
phát triển rễ và chồi. Kết quả này có sự khác biệt đáng kể giữa các môi trường.
Từ chiều dài trung bình của rễ và chồi được ghi lại cho thấy sự phát triển tốt nhất
trên môi trường kết hợp MS + 0.05mL (50µg/100mL) IAA+0.15mL
(50µg/100mL) Kin với thông số chiều dài rễ và chồi là (0,50 cm và 0,78 cm)

[14].
Với Maslini Japar Ali, Rosmah Murdad and Mariam Abd. Latip tai trường
Đại học Sabah Malaysia. Vừa qua năm 2011, họ đã tiến hành nghiên cứu xác
định môi trường và điều kiện ánh sáng thích hợp nhất cho sự nảy mầm hạt giống
in vitro của Dendrobium tetrachromum và Dendrobium hamaticalcar. Hạt từ quả
trưởng thành (120 ngày sau khi thụ phấn) được tách và nuôi cấy thí nghiệm trên
các môi trường: ½MS, MS và KC. Những ảnh hưởng của các loại phụ gia hữu cơ
như nước dừa(5, 10, 15, 20%), peptone, chiết xuất từ khoai tây, và men bia nồng
độ khác nhau (1, 2, 4 và 6g/L) đến hạt giống nảy mầm cũng đã được nghiên cứu.
Các kết quả thu được trong các thí nghiệm cho thấy rằng hạt giống các loài
D.tetrachromum nảy mầm rất tốt trên tất cả các môi trường cơ bản đã thử nghiệm
với hơn 50% sự nảy mầm diễn ra khi theo d~i sau 30 ngày và 100% sau 70 ngày.
Đối với D. hamaticalcar, ½MS là môi trường tốt nhất cho nảy mầm hạt giống.
Khi bổ sung CW 15% hoặc 2 GL-1 peptone vào môi trường ½ MS thấy chúng
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 11
tăng cường nảy mầm của hạt giống D.tetrachromum. Tại thời điểm nuôi 30 ngày,
hơn 90% hạt giống đã nảy mầm và nảy mầm 100% được lấy khi nuôi được 50
ngày. Đối D. hamaticalcar, bổ sung 1 g/L men hoặc nước chiết khoai tây 1 g/L
vào ½ MS cũng kích thích nảy mầm hạt giống in vitro. 30 ngày, tỷ lệ nảy mầm
thu được là 88% (nấm men) và 96% (khoai tây) và 100% nảy mầm đã được quan
sát thấy sau 50 ngày. Đối với cả hai loài, 24 giờ chiếu sáng phù hợp cho hạt
giống nảy mầm trong ống nghiệm [15].
Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) khi nghiên cứu để phát triển một
giao thức nhân nhanh một giống Dendrobium primulinum. Lindl có nguy cơ
tuyệt chủng đã nhận thấy: thông qua việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ
0.3 đến 0.5mm trên môi trường MS cơ bản và môi trường MS có bổ sung với sự
kết hợp của các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng NAA, BAP
các protocorm hình thành đã sản xuất chồi và rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng
chồi tăng nhanh nhất trên môi trường MS với BAP (1,5 mg/l) và NAA (0,5

mg/l). Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi
trường MS với nguồn cung cấp ngoại sinh của IAA 0.5 mg/l cây lan ra rễ tốt
nhất. Khi ra cây trên giá thể đất sạch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1. Gần 70% của cây con
sống sót [16].
Trong năm 2007-2008, một nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Quốc gia
Singapore đã phát triển thành công một phương pháp để tạo hoa trong ống
nghiệm giống lan ở vùng nhiệt đới Dendrobium Chao Praya nụ cười
(Dendrobium Pinky, Dendrobium Kiyomi Beauty) với nguyên liệu từ hạt trên môi
trường KC (Knudson năm 1946) [17].
Lá cắt ra từ cây con trong ống nghiệm của giống Vanda Somsri hồng và
Dendrobium Bobby Mesina Red đã được sử dụng trong nghiên cứu để tạo ra PLB
(Protocorm Like Body) của Chong Siang Tee và cs. Và các chồi lá đã được nuôi
cấy trên môi trường MS cơ bản với 3% (w/v) sucrose. Các loại điều hòa sinh
trưởng thực vật như 1-napthaleneacetic acid (NAA), picloram, 6-benzyladenine
(BAP) và kinetin với nồng độ khác nhau (1, 3, 5 mg/L) đã được sử dụng để
nghiên cứu tác động đến sự phát triển PLBs [18].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 12
1.2.2. Ở Việt Nam
Hiện nay, ngoài các có các công trình nghiên cứu về cây lan Dendrobium
trên thế giới, tại nước ta công việc nghiên cứu để nhân nhanh giống lan này cũng
đang rầm rộ phát triển. Dưới đây là một vài công trình nghiên cứu điển hình.
Năm 2006, Trịnh Cẩm Tú và cs đã có công trình “Sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro để nghiên cứu về sự phát triển của phát hoa Dendrobium sonia”.
Công trình này cho ta thấy được sự ra hoa của Dendrobium sp. liên quan đến sự
chuyển tiếp mô phân sinh dinh dưỡng tạo lá và thân sang mô phân sinh sinh dục
tạo hoa. Bên cạnh đó vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh
hưởng đến số lượng hoa cũng được thảo luận [9].
Bùi Thị Tường Thu và cs (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất
điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra một số kết

quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi non, được cắt
thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 10
% CW + 1 g/l peptone + 20 g/l sacchrose + 1 g/l AC. Sau thời gian nuôi cấy 30
ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt. Tỷ lệ tạo soma là 100% trên các mẫu
nuôi cấy. Tế bào soma màu trắng sáng, được tiến hành nhân sinh khối trên 6 môi
trường thực nghiệm và kết quả thu được tế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môi
trường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 10% CW [10].
Các phương pháp nuôi cấy ứng dụng kỹ thuật lát mỏng tế bào ngày càng
được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nguyễn Thanh Tùng và
cs (2010), đã áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in
vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum). Trong nghiên cứu của
nhóm tác giả này đã dùng vật liệu khởi đầu để cắt lát mỏng theo chiều ngang
TCL là chồi in vitro. Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS
có bổ sung thêm 0,5 mg/l BA và tái sinh tốt trên môi trường MS có bổ sung
3mg/l Kin + 0,3 mg/l NAA. Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [8].
Lan Dendrobium là loại cây sống bám trên cây hoặc trên giá thể trồng. Vì
vậy, việc nghiên cứu giá thể trồng thích hợp cho loại lan này là điều hết sức quan
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 13
trọng. Năm 2007, nhóm tác giả tại TP. Hồ Chí Minh do Huỳnh Thanh Hùng chủ
trì đã nghiên cứu và đưa ra một loại giá thể trồng phù hợp với lan Dendrobium.
Tác giả nhận thấy trồng trên giá thể phối hợp giữa phân trùn, sơ dừa, rễ lục bình
và dớn cho cây lan Dendrobium sinh trưởng tốt nhất [1].
Vũ Ngọc Lan và cs (2010), khi nghiên cứu giá thể trồng lan Hoàng thảo
(Dendrobium hancockii) cho thấy loại lan này sống thích hợp nhất trên giá thể gỗ
nhãn [4].
1.4. Các phương pháp nhân giống trên cây lan
1.4.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống
1.4.1.1. Nhân giống vô tính
a) Tách bụi:

- Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng
số lượng cây mới.
- Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được
từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi
con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển
mới tách lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [6; 21].
b) Chiết cành:
Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành (Keikei) một cách tự
nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra khỏi giả hành
để trồng.
- Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ
nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp
một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn [6; 21] .
1.4.1.2. Nhân giống hữu tính
a) Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện.
Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ phấn ấy.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 14
Có 2 phương pháp thụ phấn:
- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm nhụy
của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc
của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan.
- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoa
khác của cùng một cây hay cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côn
trùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống (thường do con người thực hiện).
b) Quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang
ngày hôm sau, các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng. Và để tránh sự thụ phấn
khác do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng
vì hầm hơi sẽ làm hư trái.
Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra thành trái. Mỗi trái có

thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màu
vàng lục thì nên hái trái.
c) Gieo hạt: Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải
được nhiễm một loại nấm ký sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấm
giúp hạt lan nảy mầm. Mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan mà thôi.
- Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium.
- Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis.
- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [6; 21].
1.4.2. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Do các phương pháp nhân giống truyền thống thường cho hiệu quả nhân
giống thấp và chất lượng cây giống không cao nên trong phòng thí nghiệm chúng
tôi đã tiến hành nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp nhân giống vô
tính in vitro. Phương pháp này có các ưu điểm sau:
- Hệ số nhân giống nhanh
- Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 15
- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường)
- Chủ động kế hoạch sản xuất
- Tạo được cây sạch virus
- Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu
quả nhân bằng các phương pháp thông thường sau đó [2].
1.5. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro
1.5.1. Lịch sử
- Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức Schleiden và Schwann đã đề
xướng thuyết tế bào và nêu r~: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn
vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di
truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị
độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể.

- Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden
và Schwann vào thực nghiệm. Tuy nhiên, ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các
tế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium,
Ornithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy,
hơn nữa ông dùng các tế bào mất khả năng tái sinh).
- Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công
trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ của
một cây hoà thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose. Tuy
nhiên, sự sinh truởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc
dù tác giả chuyển qua môi trường mới.
- Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian
dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa
muối khoáng và glucose và nước chiết nấm men. Sau đó, cũng chính White
chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B:
Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid. Đồng thời trong thời gian này, R.J.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 16
Gautheret (ở Pháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (cây
liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào
đầu tiên không vượt quá 8 tháng.
- Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn
Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus
carote ).
- Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kết
quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp được công bố [2].
1.5.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro
 Nhân giống bằng chồi nách
Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng
phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính. Khi các mẫu cấy là chồi
được giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách

lá. Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp
cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc
ba … Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền
trong môi trường mới.
Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho bất kỳ cây
cây trồng sản xuất chồi nách bình thường và phản ứng với cytokinin như: BAP,
Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee) [2].
 Nhân giống bằng chồi đỉnh
Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng
và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm - 0.5
mm) thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việc
phát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh. Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm - 2
mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester,
1983). Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết hợp với
cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền [2].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 17
 Nhân giống bằng chồi bất định
Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô
cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường. Một số các nguyên liệu nuôi cấy
gồm: lá, vẩy, cuống lá…Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ
callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus
và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy. Tuy nhiên chồi bất định có
thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị [2].
1.5.3. Quy trình nhân giống
1.5.3.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
- Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế
cao.
- Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ,
hoa non, lá non,…

- Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch
bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Tùy điều kiện,
giai đoạn này có thể kéo dài 3 đến 6 tháng.
1.5.3.2. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
Mục đích là tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng đưa vào nuôi cấy
in vitro
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu
cầu sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp
- Tỷ lệ sống cao
- Tốc độ sinh trưởng nhanh
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng
nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân,
mảnh lá, rễ…Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi
trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh [2].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 18
1.5.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Quá trình nhân giống in vitro là quá trình tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất.
Để tăng hệ số nhân giống thì thành phần môi trường và các điều kiện nuôi
cấy phải được tối ưu hóa. Môi trường nuôi cấy phải được đưa thêm các chất điều
hòa sinh trưởng: auxin, cytokinin, gibberelin… các chất bổ sung khác như nước
dừa, nước chiết nấm men… kết hợp các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng phù hợp.
Thường thì trong giai đoạn này nên tăng cường thời gian chiếu sáng 16
giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó
tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu
sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hoá. Ánh sáng đỏ
có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó tạo nên sự tích lũy
cytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã góp phần kích
thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro.

Về nhiệt độ phải bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30
0
C. Trường
hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng
từ 32-35
0
C. Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp
cho quá trình tạo cụm chồi phải < 30
0
C.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức
nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện tối thích [2].
1.5.3.4. Giai đoạn 4: Tạo rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên,
nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác
để kích thích tạo rễ. Ở một số loài các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra
đất. Giai đoạn này thường cần từ 2 đến 8 tuần [2].
1.5.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm
Đây là giai đoạn quan trọng bởi cây lúc này sẽ chuyển từ trạng thái dị
dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 19
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp
- Đặc biệt trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trước
những yếu tố bất lợi sau:
+ Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.

+ Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
+ Cháy lá do nắng [2].
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Có 3 nhân tố chính:
- Đảm bảo điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy
1.6.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng
1.6.1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối
khoáng, vitamin…rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc
độ sinh trưởng và phát triển của các loại vi sinh vật này lớn hơn rất nhiều so với
các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ bị nhiễm một vài bào tử
nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường
và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm sẽ
phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không thể phát triển và chết dần.
Do đó, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô tế thực vật đòi hỏi
rất nghiêm khắc [2; 5].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 20
1.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính :
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong các mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử
nấm hoặc vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn hoặc theo bụi lên bề
mặt môi trường [2; 5].
1.6.2. Chọn môi trường dinh dưỡng
Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là
tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể

sinh trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi
tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy
tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay
muốn tái sinh cây hoàn chỉnh.
Hiện nay người ta đã đưa ra rất nhiều loại môi trường khác nhau cho các
thí nghiệm nuôi cấy mô. Tuy nhiên, dù sử dụng môi trường nào đi chăng nữa thì
môi trường đó cũng phải đảm bảo đầy đủ 5 thành phần dinh dưỡng cần thiết sau
cho các mô cấy phát triển bình thường.
- Đường làm nguồn cacbon
- Các muối khoáng đa lượng
- Các muối khoáng vi lượng
- Các vitamin
- Các chất điều hòa sinh trưởng
Ngoài ra, tùy từng nghiên cứu mà có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ
có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA,…) hoặc không xác định
(nước dừa, nước chiết nấm men, nước chiết cà chua…) [2; 5].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 21
1.6.3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên
tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác nhau trong cơ thể thực vật đều có
thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển
mạnh (mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phat triển, thịt quả non,
cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đốt,…) khi đặt vào môi trường có chứa một
lượng chất kích thích sinh trưởng thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Để
nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ý đến
các chồi nách và mô phân sinh ngọn [2; 5].
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 22
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu trong thí nghiệm này là nguồn mẫu invitro giống lan
Dendrobium Aduncum có sẵn trong phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật tại trường
ĐH Bách Khoa Đà Nẵng.
Dendrobium Aduncum là loài lan rừng có hoa nhỏ mọc thành chùm.
Tên Khoa học: Dendrobium aduncum Wall. ex Lindl.
Tên tiếng Việt: Hoàng Thảo Thân gãy, Thập hoa, Hồng câu, Thạch hộc
móc, lan móc, Câu trạng thạch hộc,…
Giới : Thực vật
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Orchidales
Họ : Orchidaceae
Chi : Dendrobium [20; 21].
Hình 2.1: Lan Dendrobium Aduncum
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu
 Quy trình nhân giống cây lan Dendrobium Aduncum
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
4 - 8 tuần
4 - 8 tuần
4 - 8 tuần
4 - 8 tuần
4 -8 tuần
(Nguồn vật liệu tự nhiên)
(Chồi phát sinh từ protocorm)
(Protocorm)
(Nhân chồi)

(Cây hoàn chỉnh)
(Vườn ươm)
Đồ án tốt nghiệp 24
2.2.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS (Murashige and Skoog,1962) là môi trường cơ bản được
dùng để nuôi cấy giống lan Dendrobium aduncum trong suốt quá trình nghiên
cứu. Môi trường có bổ sung riêng rẽ hoặc kết hợp các chất điều hoà sinh trưởng
với nồng độ khác nhau tuỳ theo mục đích của từng thí nghiệm. Nguồn cacbon
được cung cấp bởi đường saccharose, môi trường được làm đặc bằng agar, pH
môi trường được điều chỉnh đến 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121
0
C trong thời
gian 20 phút.
Để nâng cao chất lượng nhân giống chúng tôi có bổ sung vào môi trường
nước dừa (CW - Coconut water) và than hoạt tính (AC - Activated charcoal).
- Môi trường nhân protocorm:
MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) BA + 0,5mg/l NAA + 15% CW + 0,5 % AC +
2% đường + 0,8% agar.
- Môi trường nhân nhanh cụm chồi:
MS + (0,5mg/l →2mg/l) BA + 0,1mg/l NAA + 10% CW + 0,5 % AC +
2% đường + 0,8% agar.
- Môi trường tạo cây hoàn chỉnh:
MS + (0,1mg/l →0,9mg/l) NAA + 0,1mg/l BA + 10% CW + 0,5 % AC +
2% đường + 0,8% agar.
MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) IAA + 10% CW + 0,5 % AC + 2% đường +
0,8% agar.
MS + (0,5mg/l →1,5mg/l) IAA + 0,1mg/l Kin + 10% CW + 0,5 % AC +
2% đường + 0,8% agar.
2.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Các mẫu cấy được nuôi ở nhiệt độ 25

0
C ± 2, ánh sáng 2000-3000 lux, thời
gian chiếu sáng 8-10 h/ngày.
2.3. Thiết kế thí nghiệm
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro
Đồ án tốt nghiệp 25
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với
NAA đến sự nhân nhanh protocorm.
Thí nghiệm được bố trí với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Môi
trường gồm môi trường MS cơ bản, trong đó có 20 g/l saccharose, 8 g/l agar,
15% CW, 0,5 g/l AC và bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng BA (0; 0,5;
1; 1,5) mg/l sử dụng kết hợp với NAA có nồng độ 0,5 mg/l.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức môi
trường cấy 15 mẫu, mỗi mẫu có kích thước 0,5 cm.
Quan sát và ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy.
* Chỉ tiêu theo dõi:
- Kích thước
- Màu sắc
- Trạng thái mẫu protocorm
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với
NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.
Thí nghiệm được bố trí trên 5 loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Trong
môi trường thành phần chính là môi trường MS trong đó có 20 g/l saccharose, 8
g/l agar, 10 % CW, 0,5 g/l AC và bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng là
BA kết hợp với NAA với các nồng độ khác nhau, BA (0; 0,5; 1; 1,5; 2) mg/l kết
hợp với NAA có nồng độ cố định là 0,1 mg/l.
Trong công đoạn này chúng tôi thực hiện cấy các mẫu chồi sau khi đã thu
nhận được ở công đoạn trước - công đoạn nhân nhanh protocorm. Đây là giai
đoạn quan trọng quyết định đến số lượng cây giống đạt được của cả quá trình
nhân giống.

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi môi trường được thực hiện từ
18-20 cụm chồi. Kích thước mỗi cụm là 1 cm. Trên các cụm có mang nhiều
protocorm hoặc các đỉnh chồi phát sinh từ protocorm. Trong thí nghiệm này các
chỉ tiêu được theo d~i sau 4 tuần nuôi cấy.
Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro