Luận văn : KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ part 4 docx

21
 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm:
Tỉ lệ mẫu sống = (số mẫu sống/tổng số mẫu) * 100
Tỉ lệ mẫu sạch nấm khuẩn = (số mẫu sạch/tổng số mẫu) * 100
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự
tạo mô sẹo từ lá:
 Bố trí thí nghiệm:
- Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh
trƣởng là BA và IBA.
+ Chất kích thích sinh trƣởng BA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 3mg/L
+ Chất kích thích sinh trƣởng IBA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L
- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần
lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 chai ứng với một nghiệm thức, mỗi bình đƣợc cấy 4 mẫu.
- Tổng số chai: 81
- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 36
- Tổng số mẫu cho cả thí nghiệm: 324
 Tiến hành:
Do chồi tiêu vô mẫu lâu mọc lá mà thời gian làm thí nghiệm thì có giới hạn
nên chúng tôi sử dụng nguồn mẫu lá tiêu in vitro sạch có sẵn trong phòng thí nghiệm
để thực hiện thí nghiệm này.
Chuẩn bị mẫu: Lấy lá của cây tiêu in vitro sạch cắt ra thành các mẫu nhỏ
khoảng 0,5 × 0,5 cm, đặt mặt trên của lá trên môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác
chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.

22
Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2
Nghiệm
thức

BA (mg/L)

IBA (mg/L)

Mẫu cấy

Số chai

Số mẫu
MS1
MS2
MS3
MS4
MS5
MS6
MS7
MS8
MS9
0
0
0
1
1

1
3
3
3
0
1
2
0
1
2
0
1
2
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
lá tiêu
9
9
9
9
9
9
9
9

9
36
36
36
36
36
36
36
36
36

 Điều kiện thí nghiệm:
Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng
saccharose + BA + IBA với sự thay đổi hàm lƣợng của BA và IBA.
Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121
o
C trong thời gian 25 phút.
pH môi trƣờng: 5.8
Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml
Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn
Nhiệt độ: 25 ± 2
0

C
Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian theo dõi thí nghiệm: 45 ngày
 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm:
Ngày xuất hiện mô sẹo: Ngày đầu tiên nhìn thấy mô sẹo
Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo của từng nghiệm thức bằng
cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng

Hệ số tăng trƣởng của mô sẹo:
HSTTMS = Ln(m
c
) – Ln(m
đ
) / số ngày theo dõi
m
đ
: trọng lƣợng của mẫu lá khi cấy
m
c
: trọng lƣợng của mô sẹo khi kết thúc thí nghiệm
23
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo
 Bố trí thí nghiệm: Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất
kích thích sinh trƣởng là BA và TDZ hoặc Ki.
- Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 5 chai tƣơng ứng với một nghiệm thức, mỗi chai cấy 3 mô
sẹo.
- Tổng số chai trong thí nghiệm: 75
- Tổng số mẫu cấy: 225
Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3
Nghiệm
thức

BA(mg/L)

TDZ(mg/L)

Ki(mg/L)

Mẫu cấy

Số chai

Số mẫu
C1
C2
C3
C4
C5
3
3
3
3
3
0,1
0,3
0,5
0
0
0
0
0
1
0
mô sẹo
mô sẹo
mô sẹo
mô sẹo

mô sẹo
15
15
15
15
15
45
45
45
45
45

 Tiến hành:
Chuyển các mô sẹo có khả năng phát triển thành chồi sang các chai đã chuẩn bị
sẵn môi trƣờng nhân chồi. Các thao tác đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.
 Điều kiện thí nghiệm:
Môi trƣờng: Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L
Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 3mg/L BA + TDZ hoặc Ki với sự thay đổi về
nồng độ của TDZ và Ki, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 121
0
C trong 25 phút.
pH môi trƣờng: 5,8
Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml
Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m
2
.s
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày
Nhiệt độ nuôi: 25 ± 2
0

C
Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian thí nghiệm là 60 ngày
24
 Chỉ tiêu theo dõi:
Số chồi mới: Đếm số chồi mới xuất hiện ở mỗi cụm chồi
Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi: Cân các cụm chồi bằng cân phân tích trong điều kiện
vô trùng.
Hệ số nhân chồi/tháng:
HSNC/tháng = Số chồi mới xuất hiện/tháng
3.5 Phân tích thống kê:
Xử lý số liệu thống kê bằng ANOVA trong phần mềm STATGRAPHICS7.0

25
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy
Kết quả xử lý chồi mẫu tiêu bằng hai loại kháng sinh Tetracylin và
Streptomycin.
Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin
Nghiệm thức
Tỉ lệ mẫu sống
(%)
Tỉ lệ mẫu sạch
(%)
T2
T6
T10
30.95
23.19
29.77
17.86
a

21.74
c
21.43

b

ANOVA
ns
**
Ghi chú ns: không khác biệt
**: khác biệt rất có ý nghĩa
Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một mẫu tự khác biệt rất
có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01.
Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
Nhìn chung, khi tăng thời gian xử lí thì tỉ lệ mẫu sống giảm.
Sau khi xử lí mẫu bằng Tetracylin với các khoảng thời gian 2 giờ, 6 giờ và 10
giờ thì tỷ lệ mẫu sống không cho sự khác biệt giữa các nghiệm thức mà đây chỉ là
sự thăng giáng ngẫu nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Thí nghiệm khử trùng bằng Tetracylin cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sạch sai khác rất
có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Trong đó nghiệm thức T6 cho tỉ lệ
mẫu sạch cao nhất (21.74%), nghiệm thức T10 cũng cho tỉ lệ mẫu sạch khá cao
(21.43%) và nghiệm thức T2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp nhất (17.86%).






26
Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin
Nghiệm thức
Tỉ lệ mẫu sống
(%)
Tỉ lệ mẫu sạch

(%)
S2
S6
S10
28.3
b

20.03
a
16.3
a
12.12
a
16.7
b
16.7
b

ANOVA
*
*
Ghi chú *: khác biệt có ý nghĩa.
Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý
nghĩa ở mức 0.01< P ≤ 0.05.
Kết quả bảng 4.2 cho thấy:
Cả 3 nghiệm thức trong thí nghiệm khử trùng mẫu bằng Streptomycin đều cho
chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức
0.01 < P ≤ 0.05.
Nghiệm thức S6 và S10 cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt
thống kê theo thứ tự lần lƣợt là 20.03% và 16.3%, nhƣng khác biệt có ý nghĩa về

mặt thống kê so với chỉ tiêu mẫu sống của nghiệm thức S2 (28.3%).
Tỉ lệ mẫu sạch của nghiệm thức S6 và S10 cho kết quả không khác biệt về mặt
thống kê, nhƣng khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức S2. Nghiệm thức S6 và
S10 đều cho tỉ lệ mẫu sạch đạt 16.7%, còn nghiệm thức S2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp
nhất chỉ đạt 12.12%.
Kết luận: Cả 2 nghiệm thức T6 và S6 cho tỉ lệ mẫu sạch tốt hơn các nghiệm
thức còn lại.
Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin
trong thời gian 6 giờ
Thời gian xử lí
6 giờ
Kháng sinh
Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%)
Tetracylin
Streptomycin
23.19
20.03
21.74
b
16.7
a
ANOVA
ns
**


27
Ghi chú ns: không khác biệt
**: khác biệt rất có ý nghĩa
Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý

nghĩa ở mức P ≤ 0.01.
Kết quả bảng 4.3 cho thấy:
Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt thống kê so
với tỉ lệ mẫu sống của kháng sinh Streptomycin.
Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống
kê so với tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Tetracylin cho hiệu
quả khử trùng đạt 21.74% trong khi hiệu quả khử trùng của Streptomycin chỉ đạt 16.7%.
Kết luận sơ bộ: Thời gian khử trùng của cả Tetracylin và Streptomycin đều cho
hiệu quả tốt nhất ở mức 6 giờ. Nhƣng kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch
(21.74%) cao hơn tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin (16.7%).
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự
tạo mô sẹo từ lá:
Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá
Nghiệm thức
MS1
MS2
MS3
MS4
MS5
MS6
MS7
MS8
MS9
Ngày xuất hiện
MS (NSC)
13
11
13
17
17

10
16
7
16

Kết quả thí nghiệm cho thấy nhìn chung khi tăng hàm lƣợng IBA trong môi
trƣờng nuôi cấy thì mô sẹo xuất hiện sớm hơn do sự kích thích phân chia tế bào của
chất kích thích sinh trƣởng.
Môi trƣờng bổ sung 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS8) xuất hiện mô
sẹo sớm nhất vào ngày thứ 7 sau khi cấy, đồng thời mô sẹo phát triển rất tốt và có khả
năng phát triển thành chồi.
Ngoài ra, ở các nghiệm thức MS5 và MS9 mô sẹo xuất hiện muộn hơn vào
ngày thứ 17 và 16 sau cấy ở những nghiệm thức này mô sẹo cũng phát triển tốt và có
khả năng phát triển thành chồi.
Nghiệm thức MS1 do môi trƣờng không có BA và IBA nên mô sẹo hình thành
ít và nhanh thoái hoá, nghiệm thức này có mô sẹo vào ngày thứ 13.
28
MS2 và MS3 do không có BA nên nó kích thích tạo rễ nhiều hơn tạo mô sẹo
nên các mẫu lá trong các nghiệm thức này lần lƣợt sau 11 và 13 ngày mô sẹo hình
thành ít đồng thời có rễ phát triển.
Sau 17 ngày nuôi cấy nghiệm thức MS4 (1mg/L BA + 0mg/L IBA) mới xuất
hiện mô sẹo, trễ hơn nghiệm thức MS7 (3mg/L BA + 0mg/L IBA) một ngày do trong
môi trƣờng của nghiệm thức MS7 có hàm lƣợng BA cao hơn nghiệm thức MS4.
Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày
thứ 45 sau cấy
Nghiệm
thức
TLMS
(gam)
HSTTMS

MS1
MS2
MS3
MS4
MS5
MS6
MS7
MS8
MS9
0.084
a
0.077
a
0.09
a
0.096
a
0.367
c
0.17
b
0.072
a
0.42
d
0.393
d

0.005
bc

0.003
ab
0.007
cd
0.009
d
0.047
f
0.025
e
0.0009
a
0.051
g
0.049
fg
ANOVA
**
**
Ghichú ** là khác biệt rất có ý nghĩa
Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý
nghĩa ở mức P ≤ 0.01.
NT: nghiệm thức
TLMS: trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo
HSTTMS: hệ số tăng trƣởng của mô sẹo
Kết quả thí nghiệm cho thấy trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng trƣởng mô sẹo
giữa các nghiệm thức khác biệt rất có nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01.
Bảng 4.5 cho thấy môi trƣờng cho kết quả trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng
trƣởng mô sẹo cao nhất là môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức
MS8), tiếp đó là môi trƣờng 3mg/L BA + 2mg/L IBA (nghiệm thức MS9) và môi

trƣờng 1mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS5) cũng cho kết quả rất tốt.
29
Kết quả về chỉ tiêu TLMS: Nghiệm thức MS8 và MS9 cho TLMS không khác biệt
nhau (lần lƣợt là 0.42g và 0.393g), nhƣng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với
các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5 cho chỉ tiêu TLMS cũng khá cao (0.367g),
nghiệm thức MS6 cho chỉ tiêu TLMS là 0.17g. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3,
MS4, và MS7 cho chỉ tiêu TLMS rất thấp (theo thứ tự lần lƣợt là 0.084g, 0.077g, 0.09g,
0.096g và 0.072g) và các nghiệm thức này cho kết quả không khác biệt về mặt thống kê.
Kết quả về chỉ tiêu HSTTMS: Nghiệm thức MS8 cho kết quả cao nhất (0.051),
kết quả này không sai khác với nghiệm thức MS9 (0.049) về mặt thống kê, nhƣng
nghiệm thức MS8 lại khác biệt rất có ý với các nhiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5
(0.047) cho kết quả không sai khác so với nghiệm thức MS9, nhƣng nghiệm thức này
lại khác biệt rất có ý nghĩa với nghiệm thức MS8. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3,
MS4, MS6 và MS7 cho kết quả thấp mặc dù các nghiệm thức này sai khác với nhau
theo thứ tự các nghiệm thức này cho các kết quả nhƣ sau: 0.005, 0.003, 0.007, 0.009,
0.025 và 0.0009.
Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3 tạo mô sẹo rất kém và các mẫu có sự xuất
hiện rễ do tác dụng kích thích tạo rễ của IBA.
Ở nghiệm thức MS7 chúng tôi nhận thấy mô sẹo hình thành rất kém, sau khi
cấy khoảng một tuần thì các mẫu hoá vàng và một số mẫu bị chết.
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo
Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng hình thành
chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày
Nghiệm
thức
Số chồi
(chồi)
TLTCC
(gam)
HSNC

(chồi/tháng)
C1
C2
C3
C4
C5
16
a
27
b
10
c
9
d
8
d

1.2367
c
2.2
d
1.08
b
1.098
a
0.965
a

8
b

13.5
c
5.2
a
4.7
a
4
a

ANOVA
**
**
**
Ghichú **: là khác biệt rất có ý nghĩa.
Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý
nghĩa ở mức P ≤ 0.01.
30
NT: nghiệm thức
HSNC: hệ số nhân chồi
TLTCC: trọng lƣợng tƣơi cụm chồi
Kết quả thí nghiệm cho thấy nhìn chung khi tăng hàm lƣợng TDZ hoặc Ki trong
môi trƣờng có hàm lƣợng 3mg/L BA thì tế bào phân chia nhanh và sớm tạo chồi.
Kết quả bảng 4.6 cho thấy sự khác biệt về chỉ tiêu số chồi và trọng lƣợng tƣơi
cụm chồi và hệ số nhân chồi của nghiệm thức C1 (3mg/L BA + 0,1mg/L TDZ) và C2
(3mg/L BA + 0,3mg/L TDZ) so với các nghiệm thức C3, C4, C5 là có sự khác biệt rất
có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01.
Trong cả 5 nghiệm thức thì nghiệm thức C2 cho số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm
chồi và hệ số nhân chồi cao nhất (lần lƣợt là 27 chồi, 2.2g và 13.5 chồi/tháng) và có sự
sai khác rất lớn so với các nghiệm thức còn lại.
Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy nghiệm thức C1 (3mg/L

BA + 0,1mg/L TDZ) cho các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số
nhân chồi lần lƣợt là 16 chồi, 1.2367g và 8 chồi/tháng; đồng thời nghiệm thức C3
(3mg/L BA + 0,5mg/L TDZ) cũng cho các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm
chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 10 chồi, 1.08g và 5 chồi/tháng.
Còn ở nghiệm thức C4 (3mg/L BA + 1mg/L Ki) cho các chỉ tiêu về số chồi,
trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 9 chồi, 1.098g và 4.5
chồi/tháng; đồng thời nghiệm thức C5 (3mg/L BA + 0mg/L Ki) cho hiệu quả nhân
chồi thấp nhất, với các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân
chồi lần lƣợt là 8 chồi, 0.965g và 4 chồi/tháng. Hai nghiệm thức này cho hiệu quả nhân
chồi thấp nhất do hàm lƣợng Ki trong môi trƣờng nuôi cấy thấp nên quá trình phân
chia tế bào theo hƣớng tạo chồi giảm so với các nghiệm thức khác.