Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -1- GVHD: TS. Đặng Đức Long
LỜI MỞ ĐẦU
Probiotic là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng
cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotic giúp hoàn
thiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh về tiêu hóa do vi khuẩn gây ra, giúp cải thiện
tình trạng không hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hại
cho vật chủ.
Với sự phát triển của khoa học công nghệ cũng như trình độ dân trí ngày
càng được nâng cao nên probiotic đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực như thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic trong dược
phẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động
đến sức khỏe con người.
Trong số các vi sinh vật được dùng để sản xuất probiotic thì các vi khuẩn
lactic được sử dụng phổ biến như : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Lactobacillus thì chế phẩm MRS vẫn được coi là môi trường chuẩn. Tuy nhiên
chế phẩm MRS rất đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thành
cao và khó được áp dụng rộng rãi. Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu
rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối Lactobacillus
plantarum chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ
tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic”.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -2- GVHD: TS. Đặng Đức Long
PHẦN 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử của probiotic
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không
phải là mới. Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào
khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa
lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt. Các nhà khoa học đầu tiên,
như Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất

dinh dưỡng và thuốc của nó, có thể chữa trị rối loạn ruột và dạ dày.
Khoa học giải thích cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic có trong
sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi nhà sinh lý học
người Nga, Eli Metchnikoff. Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sống
khỏe mạnh và lâu dài của nông dân Bungari là do sự tiêu thụ các sản phẩm sữa
lên men. Ông cho rằng các vi sinh vật trong sản phẩm sữa lên men có ảnh
hưởng tốt đến hệ vi sinh vật kết, giảm hoạt động của vi khuẩn độc, nhờ đó kéo
dài tuổi thọ.
Một điều thú vị là một vài năm trước bài thảo luận của Metchnikoff,
Henry Tissier đã phân lập ra Bifidobacteria từ phân của trẻ được nuôi bằng
sữa mẹ và nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột.
Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào sự ảnh hưởng của
Bifidobacteria đến sức khỏe của những đứa trẻ được nuôi từ sữa mẹ và những
đứa trẻ được nuôi bằng sữa hộp.
Mặc cho sự diễn ra chiến tranh Thế giới thứ nhất và sự ra đi của
Metchnikoff làm giảm sự quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông, nhưng
nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotic rõ ràng đã được thành lập. Các
kiến thức có được thông qua những nghiên cứu đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành
công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ các quan sát từ sớm của Metchnikoff và
các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotic với sản phẩm lên men đã tiếp
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -3- GVHD: TS. Đặng Đức Long
tục cho đến tận hiện tại. Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày
hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại.[6]
1.2. Định nghĩa probiotic
Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), probiotic là những vi
sinh vật còn sống. Khi được đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ, chúng sẽ có lợi
cho sức khỏe. Đường ruột có nhiều loại vi khuẩn tốt, xấu tạo thành một hệ
sinh thái đông đúc. Những probiotic này có nhiệm vụ chiến đấu, ngăn chặn sự
xâm lấn của vi khuẩn có hại giúp cơ thể không bị mắc bệnh. Do đó, dù không

phải là một chất bổ nhưng nó thật sự rất quan trọng. [7]
1.3. Cơ chế tác động của probiotic
 Tác động kháng khuẩn của probiotic
Sở dĩ các vi khuẩn probiotic có khả năng kháng khuẩn là do trong quá trình
trao đổi chất đã tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như axit hữu cơ (axit
lactic và axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO
2
,
reuterin, bacteriocin Các sản phẩm trao đổi chất này chính là “vũ khí” kháng
khuẩn của probiotic. [8]
- Khả năng kháng khuẩn của các acid hữu cơ
Các acid hữu cơ được sinh ra bởi vi khuẩn lactic chủ yếu là acid lactic và
acid acetic, các acid này góp phần làm giảm pH tiêu diệt các vi khuẩn có hại
như E.coli, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius Do nội bào vi
khuẩn có pH=7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài,
H
+
từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi
khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H
+
ra khỏi tế bào làm cho vi
khuẩn mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì ức chế quá trình đường phân làm
cho tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các
anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào. Những nguyên
nhân này làm cho vi khuẩn bị chết. [8]
- Khả năng kháng khuẩn của probiotic nhờ tiết ra độc tố bacteriocin
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được ribosome tổng
hợp từ các chuỗi peptide hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+).
Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây thối rữa và các
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -4- GVHD: TS. Đặng Đức Long
mầm bệnh phổ biến do vi khuẩn Listeria monocytogenes và Staphylococcus
aureus.
Cơ chế tác động của bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các
enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, chúng xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy
proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào,
do đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục được dẫn đến tế bào bị phá vỡ.
- Các lợi khuẩn probiotic còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí
bám dính để ngăn chặn sự xâm nhập của hại khuẩn vào đường ruột. Ngoài ra,
probiotic còn có tác động kháng độc tố của hại khuẩn. [8]
 Tác động trên mô biểu bì ruột
- Đẩy mạnh sự liên kết chặt chẽ giữa những tế bào biểu mô.
- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả của phản ứng viêm do sự
lây nhiễm vi khuẩn.
- Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy. [9]
 Tác động lên hệ miễn dịch
Probiotic được xem như là phương tiện phân
phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Cụ
thể:
- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để
làm giảm đáp ứng viêm.
- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng.
- Cải thiện hệ vi sinh vật
đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón [9]
 Tác động đến vi khuẩn đường ruột
Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn
đường ruột. Khả năng sống sót của probiotic
được tiêu hóa ở những bộ phận khác nhau của hệ
tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống. Khi tập
trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng

tạm thời của hệ sinh thái đường ruột và giúp
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
Hình 1.2. Tác dụng của probiotic
lên vi khuẩn đường ruột
Hình 1.1. Tác động của probiotic lên hệ
miễn dịch
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -5- GVHD: TS. Đặng Đức Long
cho sự tiêu thụ thức ăn. Tuy nhiên, các lợi khuẩn này chỉ lưu trú tạm thời ở đây,
và khi thức ăn đã được tiêu thụ thì số lượng vi khuẩn probiotic sẽ giảm xuống.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường
ruột. Chúng có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa, do đó sẽ gây cản trở cho
hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung
nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi
khuẩn gây hại.
1.4. Chức năng của probiotic
 Thủy phân lactose, tăng sự hấp thụ lactose
Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme thủy phân lactose thành
glucose và galactose.
Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hóa hầu hết lượng lactose không
được hấp thụ ở ruột non. [9]
 Làm giảm một số bệnh đường tiêu hóa:
- Bệnh ung loét
Bệnh ung loét trong hệ thống tiêu hóa (do vi khuẩn Helicobacter pylori gây
ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữa
lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột.
Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và
làm giảm hoạt tính của enzyme urease cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh
lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. [9]
- Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật

Kích thích hệ thống miễn dịch sản xuất IgA đặc hiệu chống lại sự nhiễm vi
sinh vật gây bệnh.
Ngăn chặn sự bám dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh đường
ruột như Samonella, E.coli, Shingela. [9]

 Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -6- GVHD: TS. Đặng Đức Long
- Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pH
môi trường gây ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính
acid.
- Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin): Bacteriocin là các
peptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của
protein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acid
hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine
- Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bám
dính và phát triển của các vi sinh vật gây bênh.
- Tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh
vật gây bệnh. [9]
Chống dị ứng thức ăn
Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật
đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích
thích hệ thống miễn dịch.
Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng có số
lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những
người thường bị dị ứng. [9]
 Tổng hợp một số vitamin
Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau. Việc
hấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khả
năng sinh vitamin rất quan trọng. Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin

B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K.
Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin
K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được
các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K. [9]
 Giảm cholesterol
Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn
(coprostanol) do đó sẽ cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -7- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm cho
cholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau:
- Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột
- Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất
này vào cơ thể.
- Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân.
- Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ.
- Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol,
việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân
bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe. [9]
 Ngăn chặn ung thư
- Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư.
- Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm
mống gây ung thư.
- Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u.
- Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân
gây ung thư (β-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và β-glucosidase)
và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. [9]
1.5. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm Probiotic
 Về mặt sản xuất:
- Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men

đơn giản và rẻ tiền
- Có thể tồn tại trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí
- Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà
không bị giảm số lượng đáng kể
- Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng
- Có thể sống sót dưới những điều kiên biến đổi khác nhau trong chế biến
thực phẩm bao gồm các quá trình nhiệt độ cao trên 45
0
C, cũng như chịu đựng
được nồng độ ethanol và sodium chloride cao. [9]

SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -8- GVHD: TS. Đặng Đức Long
 Khả năng sống sót trong ruột
- Khả năng chịu được các dịch tiêu hóa
Acid dạ dày và muối mật ảnh hưởng mạnh đến sự sống sót của vi sinh vật.
Các chủng có khả năng phát triển và thực hiện quá trình trao đổi chất dưới sự có
mặt của lượng mật sinh lý (lượng mật bình thường trong cơ thể người) thì có
khả năng sống sót tốt hơn trong suốt quá trình ở trong đường ruột.
- Khả năng cư trú trong ruột:
Những chỗ cư trú gần các mô bào và màng nhầy trong hệ thống ruột khá
giàu dinh dưỡng, đối với một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột thì khả năng
bám dính được xem là điều kiện tiên quyết đối với việc xâm chiếm và lây
nhiễm.
Khi các vi khuẩn có lợi có khả năng bám chặt vào các tế bào bên trong
đường ruột, chúng sẽ có khả năng cạnh tranh và góp phần tiêu diệt vi sinh vật
có hại. [9]
 Đặc tính riêng
- Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát
triển.

- Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K)
- Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonenella typhimurium,
Clostridium pefringens, Escherichia coli…
- Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin
- Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác. [9]
 Tính an toàn
- Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. [9]
1.6. Một số lĩnh vực ứng dụng của probiotic
 Trong dược phẩm
- Probiotic là những thực phẩm chức năng y tế, nâng cao chất
therapeutically sử dụng để ngăn ngừa tiêu chảy, cải thiện khả năng sử dụng
lactose và kháng khuẩn. Chúng cũng có tiềm năng để ngăn ngừa bệnh ung thư
và giảm cholesterol. Lactobacillus, Bifidobacterium và một số vi khuẩn có lợi
khác được đưa vào cơ thể và tạo ra hiệu quả bằng cách thay đổi thành phần của
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -9- GVHD: TS. Đặng Đức Long
hệ vi sinh vật đường ruột. Chế phẩm sinh học probiotic có khả năng chống
nhiễm trùng do vi khuẩn và vius, chống ung thư, kích thích hoạt động của hệ
miễn dịch, làm giảm cholesterol… [10]
- Ứng dụng của probiotic trong điều trị các chứng bệnh dạ dày, viêm ruột
kết (gọi chung là IBS): nguyên nhân của bệnh này là do hiện tượng không dung
nạp thức ăn, gây lên men và tạo ra các chất độc nhưng không có đủ các enzyme
để phân hủy hết các chất độc này và ảnh hưởng đến sức khỏe.
Theo điều tra nghiên cứu thì sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như : acid dạ dày, nhu động ruột, muối mật, pH trong
môi trường ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của giữa lợi khuẩn và hại khuẩn.
Thuốc kháng sinh có thể chữa được các bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhưng người
ta đã chứng minh rằng kháng sinh làm ảnh hưởng đến sự cân bằng hệ vi sinh
vật đường ruột bằng cách ức chế quá trình trao đổi chất của cả lợi khuẩn và hại
khuẩn.

Qua phân tích, các nhà khoa học đã kết luận rằng có sự thay đổi đáng kể
tổng số vi sinh vật trong ruột của những người bị chứng bệnh IBS. Trong đó,
lượng Lactobacillus và Bifidobacteria giảm rất nhiều so với người khỏe mạnh,
thay vào đó là sự thống trị của các hại khuẩn như E.coli, Streptococus,
Clostridium và hiện tượng đầy hơi cũng là hiện tượng phổ biến thường gặp ở
những người bị bệnh này.
Khi sử dụng thuốc kháng sinh một thời gian sau sẽ xảy ra hiện tượng kháng
thuốc, gây vô hiệu hóa tác dụng của thuốc. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm
probiotic cho những người mắc chứng không dung nạp thức ăn này thì sau hai
tuần bệnh thuyên giảm rõ rệt và không có sự thay đổi các thông số sinh hóa
cũng như huyết học trong suốt quá trình nghiên cứu.
Khi thử nghiệm sử dụng chế phẩm men vi sinh với L.plantarum chiếm thành
phần chủ yếu cho các bệnh nhân IBS thì triệu chứng đầy hơi chỉ giảm được
50% trong tổng số bệnh nhân. Do đó, phải kết hợp sử dụng nhiều chủng vi sinh
vật probiotic thì mới giải quyết triệt để bệnh này. [11]
 Trong thực phẩm
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -10- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Sử dụng vi khuẩn để muối chua rau quả, ủ chua thức ăn gia súc, làm chin
sinh học các loại quả: tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át cả vi sinh vật gây
thối. Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm. Chuyển rau quả về dạng
“chín sinh học” do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng. Một số chủng dùng để sản
xuất sữa chua đặc như: Lactobacillus bulgaricus, Strepticoccus faecalist…Một
số chủng được thêm vào sữa bột: Lactobacillus, Bifidobacterium…Tại những
nước phát triển, đã có nhiều ứng dụng bổ sung probiotic vào nhiều loại thực
phẩm như sữa chua ăn, phomat, kem, sản xuất nước ép trái cây probiotic …[12]
 Trong mỹ phẩm
Xu hướng probiotic đang ngày càng thịnh. Dòng thực phẩm probiotic sẽ
ngày càng phong phú. Trong các cuộc nghiên cứu gần đây, các nhà vi sinh vật
học của mỹ phẩm Biotherm còn phát hiện tinh chất PTP là một thành phần tự

nhiên có tác động mạnh lên tế bào da, chúng kích thích và điều chỉnh tế bào da
tương tự như các probiotic đã thực hiện trên tế bào ruột.[13]
 Trong nuôi trồng thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường.
Thay cho mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợi
trong ao nuôi
Một thành phần khác cũng được thấy trong chế phẩm probiotic đó là tập
hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như : amylase, protease, lipase , một
số vitamin thiết yếu hoặc acid amine và chất khoáng…nhằm kích thích hoạt
tính ban đầu của vi sinh vật trong chế phẩm và xúc tác cho sự hoạt động của
enzyme trong môi trường. Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học là giải
pháp ưu việt nhất để có được năng suất, chất lượng, sự bền vững của thủy sản
nuôi. [14]
 Trong bảo vệ môi trường
Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí như
H
2
S
,
SO
2
,NH
3…
) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh,
chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng. Đồng thời số
lượng ruồi, muỗi, ve,các loại côn trùng khác sẽ giảm số lượng đáng kể. [15]
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -11- GVHD: TS. Đặng Đức Long
1.7. Tình hình nghiên cứu các sản phẩm probiotic:
1.7.1. Những nghiên cứu ở nước ngoài

Trên thế giới đã có khá nhiều các nghiên cứu về việc sử dụng probiotic
trong nhiều lĩnh vực như nuôi trồng thủy sản, thực phẩm như:
- Maeda và Nagami (1989) đã trình bày phương pháp kiểm soát sinh học
trong nuôi thủy sản. Đến 1992 hai ông và Liao đã công bố về hiệu quả của
giống vi khuẩn tách từ bùn trong bể nuôi ấu trùng tôm sú P.monodon. [21]
- Griffith (1995) thông báo nhờ việc đưa probiotic vào nuôi tôm giống ở
Ecuador trong năm 1992 mà các trại nuôi tôm giống giảm được thời gian nghỉ
để làm vệ sinh ở các bể nuôi từ 7 ngày trong 1 tháng đến 21 ngày trong 1 năm,
sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm các chất diệt khuẩn đến 94%.[21]
- Ở châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi
tôm, đặc biệt ở Thái Lan. [21]
- Năm 2004, Kyung Young Yoon và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu để xác
định sự phù hợp của nước ép cà chua cho sản xuất đồ uống probiotic nước ép cà
chua bởi các vi khuẩn lacic. [22]
- Năm 2005, Kyung Young Yoon và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất nước
bắp cải probiotic từ 3 loại vi khuẩn lactic (L.plantarum, L.casei, L.delbruekii
D7) và kết luận cả 3 vi khuẩn này có khả năng phát triển tốt trong môi trường
lên men nước bắp cải mà không cần bổ sung thêm chất dinh dưỡng. [22]
- Năm 2006, NILAY DEMIR và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ
vi khuẩn L.plantarum đến đặc tính của nước cà rốt lên men. [22]
- Năm 2009, Lavinia BURULEANU cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh
hưởng của probiotic đến acid lactic của nước quả lên men. [22]
- Giáo sư Minoru Shirota đã nghiên cứu và phát triển chủng L.casei Shirota,
để từ đó ứng dụng đưa vào sản phẩm sữa chua uống lên men Yakult. [23]
- Năm 2010, Z.E.Mousavi cùng các đồng sự đã nghiên cứu lên men nước ép
lựu từ vi khuẩn L.plantarum, L.casei, L.acidophilus. Kết quả cho thấy các
chủng trên đều thich hợp sản xuất probiotic nước ép lựu.
Như vậy, chúng ta thấy việc sử dụng các chủng vi sinh vật probiotic trong
nhiều lĩnh vực đã và đang được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -12- GVHD: TS. Đặng Đức Long
1.7.2. Những nghiên cứu trong nước
Các sản phẩm probiotic đã bắt đầu được người tiêu dùng biết đến trong thời
gian gần đây, tuy nhiên các sản phẩm này còn rất mới mẻ và nhất là các sản
phẩm sử dụng trong thực phẩm còn chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu mới
được nghiên cứu trong chăn nuôi như:
Trần Quốc Việt của bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi – Viện chăn
nuôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung probiotic vào khẩu phần đến
khả năng tiêu hóa thức ăn, tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ
mắc bệnh tiêu chảy ở lợn con và lợn thịt. [24]
Viện công nghệ sinh học – Công nghệ dược phẩm của Đại Học Bách Khoa
Hà Nội đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng phối hợp prebiotic và
probiotic trong thực phẩm chức năng”.[24]
Hiện nay trên thị trường đã có nhiều sản phẩm probiotic do Việt Nam sản
xuất như: sữa chua bổ sung probiotic, men vi sinh, chế phẩm chăn nuôi bổ sung
probiotic…
1.8. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu
thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus
cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. [9]
Chủng
Lactobacillus
Chủng
Bifidobacterium
Các chủng vi
khuẩn lactic
khác
Các loài vi sinh
vật khác
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -13- GVHD: TS. Đặng Đức Long
L. acidophilus
L. amylovocus
L. casei
L. crispatus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracaseii
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
L. salivarius
B. adolescentis
B. alimalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. longum
Enterococcus
faecalis
Enterococcus
faecium
Lactococus
lactis
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococus
acidilactici

Sporolactobacill
us inulinus
Streptococus
thermophilus
Bacillus cereus
Escherichia coli
Propionibacteriu
m freudenreichii
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
boulardii
Bảng 1.1.Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người [9]

1.8.1.Chủng Bifidobacterium
Bifidobacterium có chủ yếu trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở
trẻ mới sinh được nuôi bẳng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn
định cho đến khi về già thì số lượng giảm đi.
Một số đặc tính chung của các loài thuộc Bifidobacterium:
- Gram (+), kỵ khí, không chuyển động, không sinh bào tử
- Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y.
- Sinh acid lacic, không tạo CO
2
trừ quá trình phân giải gluconate.
1.8.2. Các chủng vi khuẩn Lactic
 Đặc điểm chung
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -14- GVHD: TS. Đặng Đức Long
- Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, lien cầu và
dạng que, đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi.

- Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn lactic thuộc dạng yếu.
- Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Để sinh
trưởng bình thường, ngoài nguồn carbon, chúng còn cần nito dưới dạng các acid
amine, một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
 Vai trò của các chủng vi khuẩn lactic:
- Sinh ra các acid lactic, tạo ra nhiều chất chống vi khuẩn khác nhau như
acid hữu cơ, diacetyl, hydrogen peroxide và các bacteriocin nên ngăn cản được
sự hiện diện và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh.
- Phòng ngừa và ngăn chặn rối loạn tiêu hóa, giúp cân bằng hệ vi khuẩn
đường ruột, khôi phục lại cân bằng vi khuẩn tự nhiên trong cơ thể.
- Chuyển lactose thành acid lactic, hạn chế dị ứng do cơ thể không dung nạp
được lactose.
- Một số vi khuẩn lactic có khả năng bảo vệ chống sự phân hủy và đột biến
DNA in vitro và in vivo. [9]
1.9. Tổng quan về Lactobacillus plantarum
1.9.1. Đặc điểm chung của Lactobacillus plantarum
- Có cấu trúc hình que, bộ gen lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic.
- Là một loài vi khuẩn không gây bệnh, Gram
(+), không có khả năng di động, không sinh bào
tử, khuẩn lạc tròn và trơn, màu trắng sữa, thường
có trong nước bọt và đường tiêu hóa của người.
- Có hoạt tính probiotic, có khả năng sinh
acid lactic và thường được sử dụng trong quá
trình lên men thực phẩm
- L. plantarum là loài vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có nghĩa là nó có thể sinh
trưởng và phát triển trong cả điều kiện có oxi và trong điều kiện không có oxi.
- L.plantarum có thể sống trong điều kiện môi trường có nhiệt độ từ 30°C
đến 40°C và khoảng pH khá rộng từ 6,2 - 7. Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở
pH thấp của dạ dày và tá tràng ( pH khoảng 2-3), chống lại những tác động của
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

Hình 1.3. Vi khuẩn
Lactobacillus plantarum
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -15- GVHD: TS. Đặng Đức Long
các acid dịch mật trong ruột non khi ăn uống, và có thể lưu trú trong đường tiêu
hóa bằng cách gắn vào niêm mạc ruột và đại tràng. Vì vậy có thể sử dụng nó để
điều trị bệnh viêm ruột kết, đầy hơi, khó tiêu. [16]
- Tính chất đặc trưng duy nhất của L. plantarum là khả năng dị hóa arginine
và sinh ra NO. L. plantarum không có khả năng phân giải amino acid nào ngoại
trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và
đều sinh ra NO. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như
Candida abicans, E.coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh
trùng.
1.9.2.Vai trò của L.plantarum
- Bằng cách ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L.plantarum
làm giảm độc tố do E.coli tiết ra.
- Lactobacillus plantarum làm giảm đáng kể vi sinh vật kị khí Gram (-),
Enterobacteriaceae, Clostridia.
- Nghiên cứu gần đây cho thấy L.plantarum có khả năng phân hủy acid mật
làm giảm cholesterol.[16]
1.9.3. Các hoạt tính của Lactobacillus plantarum
 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum
- Từ xa xưa con người đã biết ứng dụng lên men lactic để muối chua rau, củ,
quả. Quá trình lên men lactic chủ yếu là nhờ sự hoạt động của vi khuẩn sinh
acid lactic. Người ta đã phân lập các sản phẩm như nem chua, xúc xích, rau, củ,
quả muối chua điển hình là dưa chuột muối chua sau đó nuôi trên môi trường là
chế phẩm MRS và đã cho kết quả có sự hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus
plantarum.
Đối với quá trình lên men chua thì các nguyên liệu tươi sống rất khó khử
trùng. Trong nghiên cứu này người ta đã chứng minh được rằng, chính vì có sự
cạnh tranh dinh dưỡng giữa vi khuẩn lactic với các hệ vi sinh vật tạp nhiễm. Do

đó Lactobacillus plantarum có khả năng tạo ra bacteriocin để ngăn chặn sự
cạnh tranh của các vi khuẩn tự nhiên. Bacteriocin do L.plantarum sản xuất có
khả năng ức chế sự sinh trưởng, sinh sản và quá trình trao đổi chất của các vi
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -16- GVHD: TS. Đặng Đức Long
khuẩn khác loài cũng như nấm men. Sử dụng bacteriocin kết hợp với điều khiển
các yếu tố khác trong lên men sẽ cho chất lượng lên men tốt hơn.Ngoài ra,
L.plantarum còn có khả năng sinh acid làm giảm pH môi trường để ức chế các
vi khuẩn khác. [17]
- Trong một nghiên cứu khác, người ta đã chứng minh được L.plantarum có
thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường dinh dưỡng MRS, đồng thời có
khả năng ức chế sự phát triển của hại khuẩn Samonella. Sau 2h thử nghiệm hoạt
tính này, người ta nhận thấy L.plantarum làm số lượng tế bào Samonella giảm
rất nhiều. [18]
- Ngoài ra, L.plantarum còn có khả năng diệt các vi khuẩn gây nhiễm trùng
ở đầu họng của bệnh nhân viêm phổi phải đặt ống nội khí quản. [19]
 Khả năng kháng dịch mật của L.plantarum
Nghiên cứu này được thực hiện tại trung tâm CRDC năm 2007. Trong
nghiên cứu này người ta sử dụng mật lợn thay thế cho dịch mật người. Khả
năng chống chịu muối mật của L.plantarum được đánh giá bằng cách bổ sung
các nồng độ khác nhau của mật vào môi trường chế phẩm MRS. L.plantarum
được nuôi ở 37
0
C trong 48h. Kiểm chứng với môi trường chế phẩm MRS không
chứa dịch mật. Vi khuẩn sống sót được theo dõi bằng cách đo OD ở bước sóng
600nm.
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ mật lợn từ 0,1% đến 1% thì
L.plantarum vẫn sinh trưởng và phát triển được nhưng ở nồng độ cao thì vi
khuẩn bị ức chế. [20]
 Khả năng chịu acid của L.plantarum

Khả năng chịu acid của L.plantarum được kiểm tra bằng cách ủ vi khuẩn
trong môi trường chế phẩm MRS ở các giá trị pH từ 2 đến 6, điều chỉnh pH
bằng HCl. Sau đó, nuôi vi khuẩn ở 37
0
C trong 48h. Lượng vi khuẩn sống sót
được đánh giá bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm kết hợp đếm
khuẩn lạc.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -17- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Kết quả cho thấy, L.plantarum có thể sống sót trong môi trường có pH từ
2-3 nhưng đạt lượng sinh khối lớn nhất ở môi trường có pH 6,5.
Như vậy, L.plantarum đã được chứng minh là hội tụ đầy đủ ba hoạt tính
quan trọng của một vi sinh vật được dùng làm probiotic đó là: khả năng kháng
khuẩn, khả năng kháng dịch mật và khả năng chịu acid. Do đó, có thể kết luận
L.plantarum có hoạt tính probiotic. [20]
1.9.4. Ứng dụng của L.plantarum
- Nó quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại
một cách hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào.
- L.plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong củ hành, tỏi,
lúa mì, trứng, lúa mạch đen và trong men bia. Do đó chúng giúp đỡ những vấn
đề về tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu…
- Ngoài ra, L. plantarum còn có khả năng giảm nhất định một số triệu chứng
phụ trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng sinh. [9]
- Gần đây L. plantarum đã được dùng để gắn kháng nguyên mảnh C của độc
tố uốn ván (đã làm mất độc tính) dùng làm vaccine chống uốn ván.
PHẦN 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Quy trình thực hiện đề tài
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

Hoạt hóa giống vi khuẩn bằng môi trường
MRS trên đĩa petri
Cấy chuyển vi khuẩn từ đĩa Petri sang môi
trường MRS lỏng
Nuôi cấy giống vào các môi trường thử
nghiệm rẻ tiền
So sánh kết quả thu được từ các môi trường để
tìm ra môi trường thích hợp thay thế cho MRS
Tối ưu hóa môi trường vừa tìm đươc bằng
phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Nuôi cấy giống trên môi trường tối ưu và so
sánh với môi trường MRS
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -18- GVHD: TS. Đặng Đức Long
2.2. Đối tượng nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Trong đề tài này em sử dụng chủng Lactobacillus plantarum được nuôi cấy
và bảo quản tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc khoa Hóa, trường
Đại học Bách khoa Đà Nẵng.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
2.2.2.1. Dụng cụ
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -19- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trong quá trình thí nghiệm thường dùng các dụng cụ như: cốc đong, ống
đong, micropipette, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy
trang, que cấy ria, đầu côn, effpendoft
2.2.2.2.Thiết bị
Một số thiết bị thường dùng như:
- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave - Tủ cấy vô trùng
- Tủ sấy - Tủ ấm
- Cân phân tích và cân kỹ thuật - Máy lắc nước

- Máy đo pH - Máy đo mật độ quang
- Lò vi sóng
Các thiết bị chính được trình bày ở phần phụ lục 1
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động
sống và hoạt tính của vi sinh vật. Vì vậy, để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu
cho sự sinh trưởng cũng như hoạt tính của vi sinh vật thì trong thành phần môi
trường cần có các nguyên tố như carbon, nito, hidro, oxy, các chất vô cơ như
canxi, phospho, lưu huỳnh, sắt và các nguyên tố vi lượng. [1]
- Môi trường nhân giống cấp 1: là môi trường MRS (do Deman và cộng sự
tìm ra năm 1960) dạng chế phẩm có thành phần như sau: [28]
Pepton từ Casein 10g/l Cao thịt bò 10g/l
Cao nấm men 5g/l Glucose 20g/l
Natri – acetate 5g/l Tween 80 1ml/l
Diamon citrate 2g/l MgSO
4
.7 H
2
O 0,2g/l
MgSO
4
0,2g/l Agar 2%
- Môi trường thử nghiệm dùng để nhân sinh khối: gồm 3 môi trường như
trong bảng 2.1 dưới đây
Bảng 2.1. Thành phần của 3 môi trường thử nghiệm [2]
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -20- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Do môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật có chứa hàm lượng
chất dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật sinh trưởng và phát
triển. Vì vậy để đảm bảo cho môi trường nuôi cấy chỉ chứa loài vi sinh vật

mong muốn thì sau khi chuẩn bị môi trường cần phải thanh trùng và làm nguội
trước khi cấy giống.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp hoạt hóa Lactobacillus plantarum
2.3.1.1. Hoạt hóa vi khuẩn L.plantarum
Do giống vi khuẩn được pha trộn với glycerol và bảo quản lạnh đông, vì vậy
có hoạt tính rất yếu. Vì thế để đạt được hoạt tính tốt vốn có của giống thì cần
phải tiến hành hoạt hóa giống theo các bước sau đây:
+ Pha loãng giống về nồng độ 10
-7
bằng nước muối sinh lý vô trùng hoặc
nước cất vô trùng.
+ Hút 100µl giống pha loãng nhỏ vào đĩa petri đã chứa môi trường MRS vô
trùng (thành phần được nêu ở mục 2.2.3).
+ Dùng que cấy trang để cấy trải đều giống lên đĩa
+ Sau đó nuôi ở 30
0
C trong 48 giờ, quan sát hình thái và đánh giá xem giống
gốc có thuần khiết không. [2]
2.3.1.2. Cấy chuyển giống vi khuẩn từ đĩa petri sang môi trường lỏng trong
bình tam giác
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
Môi trường 1:(1000ml) Môi trường 2:(1000ml) Môi trường 3:(1000ml)
Cải xanh 100g/l Cà chua 100g/l Cà chua 10%
Đường kính 20g/l Đường kính 20g/l Nước dừa 10%
K
2
HPO
4
1g/l K

2
HPO
4
1g/l Cao nấm men 10g/l
MgSO
4
0,5g/l MgSO
4
0,5g/l
Cao nấm men 5g/l
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -21- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Để đồng nhất lượng giống khi cấy vào các môi trường thì giống được nuôi
trên đĩa petri không phù hợp. Do đó, phải tiến hành cấy chuyển vi khuẩn từ đĩa
petri sang dạng lỏng trong bình tam giác. [2]
Dùng que cấy lấy khoảng hai khuẩn lạc to, rõ nhất ở đĩa petri vừa hoạt hóa
rồi khuấy vào bình tam giác chứa 100ml môi trường MRS vô trùng. Sau đó
nuôi cấy ở 30
0
C trong 48h.
2.3.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
2.3.2.1.Phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng vi
sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân
chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Trong phương pháp này cần
thực hiện pha loãng thập phân sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích
hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn
để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Các thao tác được thực hiện trong điều
kiện vô trùng. [3]
2.3.2.2. Phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật Lambert-Beer, độ

lớn của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích, các chất khác
nhau sẽ hấp thụ tốt ở các bước sóng khác nhau.
Để có kết quả chính xác, cần phải chuẩn bị mẫu trắng cho từng mẫu. Mẫu
trắng có thành phần môi trường giống với mẫu thật, nhưng không cấy giống vi
khuẩn. Mỗi mẫu phải tiến hành đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình. [4]
2.3.2.3.Phương pháp chọn lọc môi trường thích hợp nhất trong 3 môi trường
thử nghiệm
Cho đến nay, môi trường MRS vẫn được xem là môi trường chuẩn để nuôi
cấy vi khuẩn lactic, trong đó có Lactobacillus. Tuy nhiên, do chứa các thành
phần đắt tiền nên hiện nay giá thành của chế phẩm MRS vẫn rất cao. Vì thế
mục tiêu của đề tài là tìm ra môi trường có thể thay thế MRS để nuôi cấy
Lactobacillus.
Để tìm ra môi trường thay thế, cần trải qua các bước sau:
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -22- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Bước 1: Cấy đồng nhất một lượng giống vào các môi trường thử nghiệm
Để đánh giá chính xác hiệu quả tạo sinh khối L.plantarum của các môi
trường thì nhất thiết phải cấy cùng một lượng giống vào các môi trường và sau
đó nuôi cùng một điều kiện. Hay nói cách khác, giữa các môi trường thử
nghiệm thì các yếu tố về giống và điều kiện nuôi cấy đều giống nhau, chỉ khác
về thành phần môi trường. Các thí nghiệm này được bố trí song song.
Phương pháp tiến hành:
- Chuẩn bị 3 bình tam giác chứa 3 môi trường thử nghiệm như đã nói ở mục
2.2.3 với thể tích mỗi môi trường là 100ml, điều chỉnh pH của cả 3 môi trường
về 6,5.
- Thanh trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực cao Autoclave
- Chuẩn bị giống Lactobacillus plantarum ở dạng lỏng trong bình tam giác
- Dùng micropipet với đầu côn vô trùng hút 1ml (tỷ lệ giống là 1%) giống
phân phối vào mỗi bình tam giác.
- Sau khi cấy giống, đem các bình tam giác đi nuôi cấy lắc ở 30

0
C,
200vòng/phút
Bước 2: Xác định mật độ tế bào trong từng môi trường
- Để xác định mật độ tế bào trong các môi trường, sử dụng phương pháp đo
mật độ quang. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật
Lambert-Beer, các môi trường nghiên cứu có nồng độ sinh khối vi khuẩn khác
nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau ở cùng bước sóng 600nm.
Dựa vào kết quả OD thu nhận được ở các thời điểm khác nhau của cùng một
loài vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có thể xây dựng được đường cong
sinh trưởng. Từ đó biết được mức độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
trong các môi trường thử nghiệm, đồng thời có thể khảo sát sự ảnh hưởng của
yếu tố thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của L.plantarum
Bước 3: Xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi
trường
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -23- GVHD: TS. Đặng Đức Long
- Để xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi
trường, tiến hành lấy mẫu và đo OD tại các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau,
các mốc thời gian cách nhau 12 tiếng đồng hồ.
Bước 4: So sánh kết quả và chọn ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường
trên
- Sau khi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong
3 môi trường thử nghiệm, so sánh mức độ sinh trưởng của nó trong từng môi
trường để tìm ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường thử nghiệm.
2.3.3. Phương pháp tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Sau khi chọn ra môi trường dinh dưỡng tốt nhất trong 3 môi trường thử
nghiệm, tiến hành tối ưu hóa môi trường bằng phương pháp “Quy hoạch thực
nghiệm” và tìm điều kiện tối ưu bằng cách sử dụng phần mềm Excel Solve.Với
mục đích là thu sinh khối vi khuẩn L.plantarum, do đó hàm mục tiêu là sinh

khối vi khuẩn, các biến là các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành sinh khối vi
khuẩn.
Muốn tối ưu hóa môi trường bằng quy hoạch thực nghiệm thì phải tiến hành
từ quy hoạch trực giao cấp 1. Nếu phương trình hồi quy tương thích với thực
nghiệm thì dừng lại, còn không thì phải làm tiếp các cấp quy hoạch tiếp
theo[5]
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -24- GVHD: TS. Đặng Đức Long
PHẦN 3:
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Với mục đích của đề tài là tìm ra môi trường tối ưu nuôi cấy vi khuẩn
L.plantarum để thay thế môi trường MRS và quy trình thực hiện đã nêu ở phần
2, kết quả thu được như sau:
3.1.Kết quả hoạt hóa chủng L.plantarum
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum được bảo quản ở phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học thuộc trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng bằng phương
pháp lạnh đông ở -20
0
C. Sau quá trình hoạt hóa trên môi trường MRS trên đĩa
petri ở 30
0
C, thời gian nuôi cấy là 48h. Kết quả hoạt hóa được trình bày ở hình
3.1
Hình 3.1. Kết quả hoạt hóa L.plantarum từ effpendoft sang
môi trường dinh dưỡng MRS với độ pha loãng 10
-7
Kết quả quan sát ban đầu cho thấy chủng khảo sát vẫn giữ được một số đặc tính
cơ bản của chủng L.plantarum như:
- Về màu sắc: khuẩn lạc màu trắng sữa
- Về đặc tính mép khuẩn lạc: trơn nhẵn, bờ tròn đều, không có răng cưa

- Về đặc tính bề mặt: bề mặt lồi, trơn nhẵn, không nhăn
- Không sinh bào tử.
3.2. Quan sát hình thái vi khuẩn L.plantarum dưới kính hiển vi
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -25- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Làm tiêu bản để quan sát L.plantarum, vi khuẩn được nhuộm màu với xanh
metylen.
Dưới kính hiển vi, có thể quan sát được hình thái vi khuẩn L.plantarum có
dạng hình que, không di động.
3.3.Kết quả cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường lỏng
Nhận xét: Do L.plantarum là loài vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có thể sống trong
điều kiện có hoặc không có oxi. Nên trong quá trình nuôi cấy lắc vừa được cung
cấp oxi và tác động lắc của thiết bị, vi khuẩn phân bố đều trong môi trường. Sau
48h nuôi cấy lắc, giống được bảo quản ở tủ lạnh 4
0
C lúc này vừa thiếu oxi vừa
không có lực lắc nên sinh khối vi khuẩn lắng xuống đáy bình.
3.4. Kết quả khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus
plantarum trên các môi trường thử nghiệm
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn L.plantarum quan sát dưới kính hiển vi
Hình 3.3. Cấy chuyển L.plantarum từ môi trường MRS trên
đĩa thạch sang môi trường MRS lỏng