Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum để xử lý lớp nhớt hạt cà phê

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -1- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
MỞ ĐẦU
Cà phê mới được biết đến khoảng hơn 300 năm nay, muộn hơn rất nhiều so
với nhiều cây lương thực, thực phẩm quan trọng khác. Tuy nhiên, ngày nay cây cà
phê đã trở thành một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, là một mặt hàng
xuất khẩu quan trọng của nhiều quốc gia trên thế giới. Ở một số nước, cà phê là
một loại thức uống không thể thiếu. Cà phê còn là nguyên liệu để sản xuất một số
mặt hàng thực phẩm như sữa, bánh, kẹo sự có mặt của cà phê sẽ làm tăng thêm
hương vị và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm.
Sở dĩ cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8 – 3%
caffeine, một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăng
cường khả năng làm việc, khả năng tư duy và qua đó thúc đẩy hoạt động của hệ
tuần hoàn, tăng cường phản ứng của cơ bắp,… Ngoài ra, trong hạt cà phê còn chứa
nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người như đường saccharose,
đường khử, các protein hòa tan,… đặc biệt là các vitamin B1, B2, B6, B12 và PP
có hàm lượng khá cao, đó là những chất cần thiết cho nhu cầu sinh lý của cơ thể
chúng ta. Do đó cà phê giúp nâng cao sinh lực, chống mệt mỏi, giúp con người làm
việc sáng suốt và thoải mái hơn.
Trong những năm gần đây diện tích đất trồng và sản lượng cà phê nước ta tăng
mạnh, ngành chế biến và xuất khẩu cà phê nước ta đang dần hoàn thiện hơn. Tuy
nhiên chất lượng cà phê nước ta còn thấp do phương pháp chế biến còn hạn chế và
còn phải nhập khẩu các dạng chế phẩm enzyme thương mại đắt tiền trong sản xuất
cà phê theo phương pháp ướt. Vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng hệ
enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum để xử lý lớp
nhớt hạt cà phê”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện qui trình
sản xuất cà phê theo phương pháp ướt, góp phần tăng chất lượng sản phẩm cà phê.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -2- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tìm hiểu về cà phê

Cà phê là tên một chi thực vật thuộc họ thiên thảo bao gồm khoảng 500 chi
khác nhau với trên 6000 loài cây nhiệt đới. Cây cà phê thân nhỏ, cao 6 – 10 m, thân
cành hình trụ hoặc hình vuông, phân nhánh nhiều. Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc
hình trứng, dài 10 – 15 cm, rộng 5 – 6 cm, đầu nhọn, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt
dưới rất nhạt, gân nổi rõ, mép uốn lượn; cuống lá dài 0,7 -1 cm; lá kèm có gốc rộng,
đầu nhọn. Cụm hoa gồm 8 – 15 hoa ở nách lá; hoa trắng, rất thơm, đài cụt, tràng
hình ống ngắn, 5 cánh hoa đều; nhị 5 dính ở họng tràng, xen kẽ với cánh hoa, bầu 2
ô, mỗi ô chứa một noãn. Quả hình hạch xoan hơi dẹt, lúc chưa chín có màu xanh
lục, khi chín chuyển sang màu đỏ, chứa 2 hạt. Mùa cà phê nở hoa và kết trái vào
khoảng từ tháng 11 đến tháng 4. [1]
1.1.1. Thành phần hóa học và cấu tạo của hạt cà phê
1.1.1.1 Thành phần hóa học và cấu tạo của hạt cà phê
Chất lượng hạt cà phê là yếu tố quan trọng trong tiêu chuẩn xuất khẩu cà phê.
Các biện pháp canh tác, thu hoạch và chế biến đóng vai trò quan trọng trong
việc tạo ra cà phê nhân sống đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Hạt cà phê xanh giàu glucid
và lipid, glucid chiếm hơn 50%, phần lớn là các polysaccharide. Lipid (10-15%),
protein (10-15%) và acid hữu cơ, đặc biệt là các acid cafeylquinic hay acid
chlorogenic. Hàm lượng caffeine thay đổi, từ 0,5 đến 1,8%, một phần của caffeine
thường kết hợp với acid chlorogenic. Cà phê rang lên có những chất thơm, gọi
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.1. Cây cà phê
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -3- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
chung là cafeol (acid cafeic, oleic, linoleic, palmitic), khoảng 0,05%, nhưng đồng
thời lại tạo ra một yếu tố phức hợp độc là cafeotoxin (0,07%). Thành phần hóa học
trong hạt cà phê có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình đánh giá chất lượng.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của hạt cà phê
Thành phần
Hàm lượng
g/100 g mg/100 g

Nước 8 – 12
Chất dầu 4 – 18
Đạm 1,8 – 2,5
Proteine 9 – 16
Caffeine 1 (Arabica), 2 (Robusta)
Chlorogenic acid 2
Trigonelline 1
Tannin 2
Caffetanic acid 8 – 9
Caffeic acid 1
Pentosane 5
Tinh bột 5 – 23
Saccharose 5 – 10
Cellulose 10 – 20
Hemicelllulose 20
Lignine 4
Calcium 85 – 100
Phosphur 130 – 165
Sắt 3 – 10
Sodium 4
Manganese 1 – 45
(Nguồn: Lê Quang Hưng, 1999)
Caffeine là một alkaloid chứa đạm, công thức là C
8
H
10
O
2
N
4

.H
2
O, được Runge
và Robiquet tìm ra năm 1820. Caffeine kết tinh với một phân tử nước nhưng trở
nên khan khi nung nóng đến nhiệt độ 80-100
o
C. Caffeine khan chứa 28,8% N.
Caffeine khan ở dạng tinh thể trắng hình kim, tan trong nước và chloroform.
Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) là purine chính trong hạt cà phê. Ngoài ra còn có
theobromine(3,7-dimethylxanthine) và rất ít theophylline(1,3-dimethylxanthine).
[4],[7]
Cấu tạo: hạt cà phê bao gồm có vỏ quả, lớp thịt quả, vỏ thóc, vỏ lụa và nhân.
Cấu tạo của hạt cà phê trình bày trong hình 1.2.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -4- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Hình 1.2. Cấu tạo hạt cà phê
1.1.1.2 Lớp nhầy (nhớt)
Bề dày của lớp nhầy trong trái cà phê khoảng 1,5 mm nhưng thay đổi tùy theo
giống cà phê. Lớp nhầy không hòa tan trong nước, không có cấu trúc tế bào
rõ rệt nhưng ở thể keo vô định hình, nó kết dính rất chặt vào hạt cà phê. Lớp nhầy
cà phê chứa khoảng 85% nước liên kết lỏng và 15% chất rắn ở dạng không hòa tan.
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của lớp nhầy cà phê
Thành phần Tỷ lệ (%)
Nước 84,2
Protein 8,9
Đường 4,1
Pectic acid 0,9
Tro 0,7
Tổng số 98,8

(Nguồn: Phạm Trí Thông, 1999)
Ngoài ra, còn có một số các enzyme được tạo ra trong lớp nhầy và trong lớp
thịt bao quanh lớp nhầy như protopectinase, pectinase, pectinesterase và
pectase. Các enzyme này bẻ gãy các phân tử lớn bằng cách cắt đứt các liên kết
polymer, dần dần tạo thành các chuỗi ngắn hơn cho tới khi còn các acid đơn phân tử
và các ester.[4],[7]
Khi trái cà phê được tiến hành xát vỏ, vô số các vi sinh vật như nấm men, nấm
mốc, vi khuẩn,… trong môi trường chung quanh khối hạt đã tìm thấy ở đây một
môi trường vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của chúng. Trong quá trình phát
triển, chúng tự sản xuất ra các enzyme và tác động lên lớp nhầy của khối cà phê xát
vỏ. Chính lớp nhầy này sẽ gây ảnh hưởng tới chất lượng cà phê khi chế biến, nếu
không loại bỏ lớp nhầy thì quá trình chế biến hạt cà phê sẽ lâu hơn dẫn đến chất
lượng hạt cũng giảm theo.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -5- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
1.1.2. Các phương pháp chế biến cà phê
Hình 1.3: Qui trình của cà phê từ khi nở hoa cho đến thành phẩm cuối cùng
Phẩm chất và hương vị cà phê phụ thuộc vào một số yếu tố chính sau đây:
Giống, khí hậu, độ phì nhiêu của đất và chế độ bón phân, độ chín khi thu hái, kỹ
thuật chế biến và chế độ bảo quản. Trong kỹ thuật chế biến cà phê nhân, có 2
phương pháp chính:
+ Phương pháp chế biến khô
+ Phương pháp chế biến ướt
Ngoài ra, còn có phương pháp trung gian là nửa khô nửa ướt. Cà phê đem xát
tươi còn lẫn cả vỏ quả đem phơi không qua công đoạn lên men và ngâm rửa.
Khi thu hoạch người ta chỉ hái những quả chín, không hái quả xanh và quả còn
non. Cà phê hái ngày nào nên được chế biến ngay trong ngày hôm đó, số lượng còn
lại không nên ủ thành đống lâu quá 24 giờ. Để có cà phê nhân phục vụ cho xuất
khẩu, tỷ lệ quả chín khi thu hái phải đạt trên 95%. Cà phê là một sản phẩm dùng để

chế ra loại nước uống cao cấp. Để cấu tạo thành nhân của cà phê, theo những kết
quả phân tích người ta thấy có tới 670 hợp chất hữu cơ hợp thành trong đó có nhiều
chất tạo nên hương thơm của cà phê. Do vậy, các khâu thu hái, chế biến, phơi sấy,
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -6- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
bảo quản cà phê có một vị trí hết sức quan trọng. Các công đoạn trong thu hoạch,
chế biến, phơi sấy và bảo quản có mối liên hệ với nhau. [4],[7]
1.1.2.1. Phương pháp chế biến khô
Đây là phương pháp chế biến lâu đời và đơn giản hơn so với phương pháp chế
biến ướt, thường được áp dụng trong chế biến cà phê Robusta. Trước tiên, người ta
phơi hay sấy nhằm làm giảm độ ẩm của trái cà phê tươi, trong khoảng 1-3 tuần lễ
đến khi độ ẩm của trái cà phê đạt 11% thì ngừng. Phương pháp phơi nắng cà phê
làm tốn nhiều công sức do phải thường xuyên cào đảo khi phơi, phải che phủ cho
cà phê vào ban đêm và khi trời mưa. Trong những điều kiện thời tiết thuận lợi, công
việc phơi nắng cho cà phê hoàn tất sau 10-14 ngày. Việc phơi cà phê trên các sân
phơi bằng đất sẽ làm cho thành phẩm cà phê về sau khi uống sẽ có mùi của đất.
Ngoài ra, do sự không đồng đều về độ ẩm của khối hạt khi phơi nắng nên sẽ tạo
điều kiện cho việc bị nhiễm các vi sinh vật, kết quả là làm giảm mùi vị của cà phê
khi uống. Sau khi hoàn tất công đoạn phơi/sấy (vỏ cà phê hột có màu nâu đậm và
giòn), cà phê hột được thu gom lại và chuyển sang giai đoạn bóc vỏ để thu được cà
phê nhân và đem đi bảo quản. [18]
1.1.2.2. Phương pháp chế biến ướt
Phương pháp chế biến ướt tốn kém và phức tạp hơn so với phương pháp chế
biến khô. Tuy nhiên, phương pháp này sản xuất ra cà phê nhân sạch và phẩm chất
tốt hơn. Phương pháp này tiêu thụ một lượng nước đáng kể, và được ứng dụng rộng
rãi nhiều nơi trong sản xuất Arabica, đặc biệt ở Kenya và Colombia. Phương pháp
chế biến ướt nhằm biến đổi trái cà phê tươi ban đầu thành dạng cà phê thóc, bao
gồm các công đoạn sau: [14],[15],[16],[18]
+ Thu nhận và phân loại

+ Xát vỏ
+ Tách lớp nhầy (lên men)
+ Rửa và phân loại theo tỷ trọng dòng nước
+ Phơi/sấy
+ Tách vỏ trấu, phân loại
 Thu nhận và phân loại
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -7- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
- Cà phê sau khi thu hái về được phân loại trước khi vào máy xát tươi để loại
bỏ các tạp chất như đất, đá sắt, cành lá…đồng thời phân loại riêng các quả cà phê
không đạt yêu cầu như: quả xanh, khô, lép, sâu bệnh.
- Phân loại bằng cơ giới trên các bàn rung, các trụ quay,… không hiệu quả
bằng phân loại theo tỷ trọng bằng bể xiphong vì làm theo cách này không những
phân loại được cà phê mà còn rửa sạch quả cà phê trước khi qua máy xát. Cà phê
thu hái về đổ vào bể xiphong dưới tác dụng của tỷ trọng thì trái nào nặng sẽ chìm
xuống dưới, trái nào chín khô nhẹ hơn và cành lá sẽ nổi lên trên.
- Bể được bơm nước tới 4/5 và được cấp nước liên tục theo ống đứng và ống
ngang phía trên chảy ra ngoài, kéo theo các quả cà phê theo nguyên lý bình
xiphong. Nước dư thừa chảy qua 1 miệng xả đặt gần thành bể, kéo theo các tạp chất
nhẹ như rác, cành, lá, quả lép, sâu bệnh,… Các tạp chất nặng như gạch, đất, đá, cát,
sạn,… lắng xuống đáy bể và được xả ra ngoài sau mỗi lần ngừng.
 Xát vỏ tươi:
Mục đích: loại bỏ lớp vỏ thịt bên ngoài. Quá trình này phải tiến hành ngay sau
khi thu hoạch 24 giờ.
Quá trình xát vỏ được thực hiện trên máy xát đĩa như hình 1.5. Hạt cà phê sau
khi ra khỏi máy xát tuy đã tróc hết lớp vỏ thịt
nhưng vẫn còn lớp nhớt bao quanh lớp vỏ
trấu. Lớp nhớt này dù phơi khô nhưng sau này
vẫn hút ẩm rất nhanh, gây khó khăn cho việc

SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.4. Phân loại cà phê trong bể xiphong
Hình 1.5. Máy xát vỏ cà phê
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -8- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
phơi sấy nên cần phải loại bỏ ngay lớp nhớt này sau khi xát tươi (giai đoạn tiếp theo
đi lên men làm sạch lớp nhớt).
 Tách lớp nhầy
Các phương pháp loại lớp nhầy (nhớt):
- Phương pháp sinh học: sử dụng các enzyme: pectinase, protopectinase,
cellulose….
- Phương pháp lên men: sử dụng các vi sinh vật có khả năng phân hủy lớp
nhớt.
- Phương pháp hóa học: sử dụng NaOH, Na
2
CO
3
,vôi
- Phương pháp dùng nước ấm
- Phương pháp cơ giới: sử dụng máy trà xát tươi.
Ở đây chúng ta sử dụng phương pháp lên men:
+ Cà phê (thóc) sau khi qua máy xát tươi được dẫn đến bể ngâm bằng xi
măng, thể tích bể 1÷10m
3
, thành bể cao 1÷1,5m. Hiện nay có 2 phương pháp lên
men: lên men khô và lên men ướt.
• Lên men khô: nước được tháo hết khỏi bể chứa, cà phê được giữ ở đó
cho tới khi lớp nhầy hoàn toàn tan ra và cũng được xả ra ngoài liên tục. Để tránh
cho lớp hạt bên trên khỏi bị khô, người ta dùng lá chuối, bao bị ướt…phủ lên trên.
• Lên men ướt: quá trình tiến hành trong khối nước và dịch lên men chỉ

được xả ra 1 lần khi hoàn tất quá trình lên men.
Mục đích của quá trình lên men là làm sạch hết lớp chất nhầy có trên vỏ cà
phê. Việc ủ cà phê được thực hiện trong bể xi măng hay trong các thùng nhựa…đổ
hạt cà phê vừa bóc vỏ vào bể, chế phẩm vi sinh (các vi sinh vật) và 1 lượng nước
nhất định, dàn đều rồi dung bao tải phủ lên trên. Thời gian lên men kéo dài từ
12÷24 giờ tùy theo thời tiết, nếu nhiệt độ môi trường cao thì thời gian lên men sẽ
nhanh hơn. Sau 5÷6 giờ lên men tiến hành đảo trộn để cung cấp đủ oxi cho khối ủ
và nhiệt độ đều khắp khối ủ.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.6. Lên men cà phê trong các bể xi măng
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -9- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Sau khi lên men ta kiểm tra thấy các hạt xát vào nhau không còn trơn mà có
cảm giác nhám, thì quá trình lên men đã đạt, có thể rửa lại khối hạt và đưa đi phơi
sấy.
 Rửa:
- Mục đích: loại bỏ lớp chất nhờn đã lên men, tạp chất…. Quá trình rửa có ảnh
hưởng rất quan trọng đến phẩm chất cà phê nhân vì nó tẩy sạch những chất gây ảnh
hưởng đến màu sắc hạt và mùi vị hạt lúc rang.
- Cách tiến hành: cà phê được rửa trong bể ngâm ủ, khuấy trộn, thay nước liên
tục cho đến khi nước hoàn toàn trong vắt.
 Phơi sấy:
Cà phê thóc sau khi rửa và để ráo nước, còn chứa 50÷60% nước. Để giảm độ
ẩm xuống còn 12%, ta tiến hành phơi sấy.
 Tách vỏ trấu và phân loại:
Sau khi phơi, sấy khô ta bóc lớp vỏ trấu của hạt cà phê trên máy chà vỏ, sau
đó đem phân loại các hạt theo kích thước và màu sắc rồi đem chế biến hoặc bán trên
thị trường.[14],[15],[16],[18]
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT

Hình 1.7 Quá trình rửa cà phê sau khi lên men
Hình 1.8. Quá trình phân loại hạt cà phê: theo cơ học (a), theo màu sắc (b)
a b
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -10- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
1.2. Chế phẩm vi sinh sử dụng trong quá trình lên men cà phê theo phương
pháp ướt
1.2.1. Tìm hiểu về pectin, cellulose, enzyme pectinase, cellulase và acid lactic
1.2.1.1. Pectinase
- Định nghĩa: Pectin là một phân tử tương tự như tinh bột, khác ở chỗ đơn vị
tuần hoàn của pectin là acid galacturonic thay vì glucose ở tinh bột. Pectin là hợp
chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua
các liên kết -1,4-glucoside.
Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành tế
bào cũng như các tế bào lại với nhau. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối
lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da. Pectin không hòa tan trong rượu và các
dung môi hữu cơ khác. Pectin tan trong nước, NH
3
, dung dịch kiềm, Na
2
CO
3
và
trong glycerin nóng.
- Phân loại
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng:
+ Pectin hòa tan: là ester methylic của acid polygalacturonic.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của
phân tử pectin

Hình 1.9. Cấu trúc thành tế bào thực vật
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -11- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
+ Pectinic acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hóa bằng methanol.
+ Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước. Trong thành
phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca
2+
, Mg
2+
, các
gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid
thì giải phóng pectin hòa tan. [4],[7]
1.2.1.2. Cellulose
Mỗi năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ
quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60
tỷ tấn được tạo thành ở trong các đại dương. Trong số này có đến 30% là màng tế
bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong
bông và 40÷50% trong gỗ. Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ
và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ,…) gồm cellulose, hemicellulose và lignin.
- Định nghĩa: Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối với
nhau qua liên kết -D-1,4-glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen
người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những
bó nhỏ gọi là các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những
phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình).
- Cấu trúc
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau bằng lực hút Vanderwall và
liên kết hydro. Chúng tạo nên sợi sơ cấp, sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi
sợi.

SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :

10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -12- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Hình 1.4. Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật
- Tính chất
Cellulose có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 2.500.000 Da. Cellulose
thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường. Cellulose là một trong những hợp chất tự
nhiên khá bền vững. Nó không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp
thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao.
Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40÷50
o
C nhờ các
enzyme thủy phân cellulose được gọi chung là cellulase.
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong
điều kiện hiếu khí lẫn yếm khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy
cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, sự phân giải cellulose
trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và thường không triệt để. Trong tế bào
thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20÷40% trọng lượng
khô) là một loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose,
mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl. Do bản chất không kết
tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ
với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến
sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi
bông) cellulose tồn tại ở trạng thái một polymer gần tinh khiết.
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất
này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên
liệu, thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy, bột giấy,…
- Vai trò
Cellulose là nguồn hữu cơ nhiều nhất trong thực phẩm, chất đốt và hóa chất.
Cellulose tồn tại một lượng rất lớn trong thực vật, không đều ở các cơ quan
khác nhau, ít nhất ở lá và nhiều nhất là ở thân cây.

Sự hiện diện của cellulose đóng vai trò là một vật liệu phổ biến của vách tế
bào thực vật được phát hiện lần đầu tiên bởi Anselm Payen vào năm 1838. Nó tồn
tại ở hầu hết những hình thức nguyên trong sợi cotton và trong tổ hợp với những vật
liệu khác, như lignin và hemicellulose, trong gỗ, lá và thân … Mặc dù, nhìn chung
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -13- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
được xem như vật liệu thực vật nhưng cellulose cũng được sản xuất bởi một số vi
khuẩn.
Cellulose là nền tảng bộ xương của thành tế bào thực vật. Ngoài ra người ta
còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (cellulose ở vi sinh vật
thuộc loại vô định hình, việc phân hủy thường dễ thực hiện). Cellulose không
có trong tế bào động vật. [4],[7]
1.2.1.3. Pectinase
- Định nghĩa
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự
phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này
có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt
là khả năng làm trong nước quả.
- Ứng dụng
Pectinase được tạo ra trong suốt quá trình chín tự nhiên của một số quả (cùng
với cellulase), chúng giúp làm mềm thành tế bào của quả.
- Phân loại và cơ chế tác dụng của các loại enzyme pectinase
Các pectinase được chia thành hai nhóm chủ yếu:
+ Pectimetylylesteraza (Pectinhydrolaza): xúc tác sự thủy phân liên kết este
trong phân tử pectin hoặc axit pectinic khi toàn bộ nhóm metoxyl bị tách ra khỏi cơ
chất thì sản phẩm là methanol và các axit polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra
ở liên kết este liền kề với nhóm cacboxyl tự do.
+ Polygalacturonaza (Polygalacturonic - glucanohydrolaza): xúc tác sự thủy

phân liên kết 1-4 glucozit trong phân tử pectin. Có nhiều polygalacturonaza có tính
đặc hiệu rất khác nhau:
· Polymetylgacturonaza: tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các axit
polygalacturinic, chia thành hai nhóm nhỏ:
* Endoglucozidaza – polymetylgalacturonaza I: xúc tác sự thủy phân liên kết
glucozit nội mạch của các phân tử polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao.
* Exoglucozidaza – polymetylgalacturonaza III: xúc tác sự thủy phân các liên
kết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc axit polygalacturonic ra khỏi phân tử
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -14- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
pectin, bắt đầu từ đầu không khử. Enzyme này có ái lực với gốc axit galacturonic đã
bị metoxyl hóa.
Polygalacturaza: tác dụng chủ yếu lên axit pectic và axit pectinic và cũng được
chia thành hai nhóm nhỏ
* Endoglucozidaza – polygalacturonaza II: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit ở giữa mạch các phân tử axit pectic hoặc axit pectinic.
* Exoglucozidaza – polygalacturonaza IV: xúc tác sự thủy phân các liên kết
glucozit ở đầu mạch của phân tử axit pectic hoặc axit pectinic.
Ngoài các enzyme kể trên, tham gia vào sự phân giải các hợp chất pectin còn
có enzyme protopectinaza xúc tác sự phân giải protopectin không tan thành pectin
hòa tan và enzyme transeliminaza xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin bằng các
con đường thủy phân tạo thành galacturonic mạch ngắn hơn với liên kết kép ở
nguyên tử cacbon số 4 và số 5.
- Các vi sinh vật tổng hợp pectinase
+ Nấm mốc:
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger,
Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi
Fusarium moniliforme
Penicillium glaucum, Penicillium ehrlichii, Penicillium chrysogenum,

Penicillium expanam, Penicillium cilrrimim,…
+ Nấm men: Saccharomyces fragilis
+ Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes,…
Ngoài ra, pectinase cũng được tiết ra bởi một số mầm bệnh cây trồng như:
Nấm Monilinia fructigena, vi khuẩn gây thối rữa Enwinia carotovora. [5],[6]
1.2.1.4. Cellulase
- Định nghĩa: Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C
1
đến
cellulase Cx và glucosidase. Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuối
cùng tạo ra sản phẩm đường glucose.
- Tính chất
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -15- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng
40÷60
o
C, pH nằm trong khoảng 4÷7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm
phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg ức chế hoàn toàn cellulase, trong
khi các ion như Mn
2+
, Ag
+
, Cu
2+
và Zn
2+
chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm

cellulase bị mất hoàn toàn sau 10÷15 phút ở 80
o
C.
- Ứng dụng
Hiện nay, cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công
nghiệp và được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Các ứng dụng quan
trọng nhất có thể kể đến là:
Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để sản xuất glucose,
mật đường từ nguyên liệu chứa nhiều cellulose như rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa,…
Trong công nghiệp sản xuất ethanol từ các phế liệu có chứa cellulose.
Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ: việc bổ sung cellulase vào thức ăn sẽ tăng
cường sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn ở các loài này.
Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật: cellulase phá vỡ thành tế
bào thực vật giúp cho việc trích ly được dễ dàng.
- Phân loại và cơ chế tác dụng của các loại enzyme cellulase
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulose xảy ra theo ba
giai đoạn chủ yếu sau:
C
1
C
x
β - Glucozidase
Cellulose Cellulose Cellobiose Glucose
+ Giai đoạn thứ nhất: dưới tác dụng của tác nhân C
1
cellulose nguyên thể
chuyển thành cellulose hòa tan. Người ta cho rằng tác nhân C
1
gây ra sự biến đổi
cellulose trong giai đoạn này không phải là enzyme mà là bao gồm một số tác nhân

nào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển.
+ Giai đoạn thứ hai: cellulose (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị thủy phân dưới
tác dụng xúc tác của hệ enzyme thủy phân C
x
tạo thành đường cellobiose. Enzyme
C
x
còn được gọi là enzyme β – 1,4 – glucanase. Chữ x có nghĩa cho ta biết đây là
loại enzyme có nhiều thành phần khác nhau. Người ta thường chia thành hai loại:
Exo – β – 1,4 – glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị
glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -16- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Endo – β – 1,4 – glucanase: phân cắt liên kết β – 1,4 – glucozit ở bất kì vị trí
nào bên trong chuỗi cellulose.
+ Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của enzyme cellobiose (β -
Glucozidase), đường cellobiose bị thủy phân thành glucose.
- Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase
Hệ vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú,
thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất cellulase
hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được sử
dụng.
+ Nấm sợi: Chủ yếu là nấm mốc và nấm quả thể, đa số có khả năng sinh tổng
hợp các loại enzyme ngoại bào (được nấm tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy).
Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus
Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum,
Trichoderma reesei
Penicillium spp

Altenaria tenuis
Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani,…
+ Xạ khuẩn
Actinomyces spp,…
Chiếm ưu thế là loài xạ khuẩn chịu nhiệt Thermonospora cruvata được
phân lập từ phân rác ủ.
+ Vi khuẩn
Hệ vi sinh vật trong dạ dày của động vật ăn cỏ, ví dụ: Cillobacterium
cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum,…
Celluvibrio gilvus
Acetobacter xylinum,…
Trong đó, Trichoderma reesei được biết đến như một vi sinh vật sản
xuất cellulase rất tốt. Một số chủng đột biến của Trichoderma reesei có thể sản xuất
160÷250 UI/g cellulase. [5],[6]
1.2.1.5. Acid lactic
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -17- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
- Giới thiệu về acid lactic: Acid lactic là một hợp chất hữu cơ thu được bằng
phương pháp lên men do tác nhân lên men chủ yếu là vi sinh vật.
Công thức phân tử: C
3
H
6
O
3
Công thức tổng quát: CH
3
-CHOH-CH(COOH)
Acid lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxyethanol cacbonxylic hay acid 2 -

hydroxypropanoic. Trong cấu tạo của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng
có hai đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic. Hai đồng phân quang
học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác khả năng làm quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một sang trái và một sang phải. Do đó tính chất sinh học của
chúng hoàn toàn khác nhau.
Tính chất:
DL - acid lactic là dịch lỏng, dạng tinh thể, tan trong nước, trong cồn, không
tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 16,8ºC, nhiệt độ sôi 122ºC.
Acid lactic có khối lượng phân tử là 98,9, là chất hữu cơ không màu, mùi
nhẹ. Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao là chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị
trường ở nhiều dạng khác nhau về chất lượng và phụ thuộc vào độ tinh sạch có
nhiều tiêu chuẩn khác nhau: Acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid
lactic plastic,
Ở dạng đồng phân D-acid lactic và L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóng
chảy và nhiệt độ sôi là 28ºC và 103ºC.
- Ứng dụng của acid lactic: Ngày nay acid lactic được sử dụng khá phổ biến
trong nhiều lĩnh vực như trong thực phẩm, y học, nông nghiệp… Như: sản xuất các
sản phẩm sữa chua và các sản phẩm rau quả muối chua, các sản phẩm men tiêu
hóa… Lượng acid lactic do các vi khuẩn tổng hợp có thể giúp các phản ướng thủy
phân lớp nhớt của hạt cà phê diễn ra nhanh hơn đồng thời cải thiện hương vị cho hạt
cà phê. [8]
1.2.2. Hiện trạng sử dụng các chế phẩm vi sinh trong quá trình lên men cà phê
theo phương pháp ướt ở nước ta
Trong những năm gần đây việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong quá trình
lên men cà phê theo phương pháp ướt ở nước ta ngày càng phổ biến hơn và phát
triển mạnh trong những năm tới. Do nó được đánh giá là có nhiều ưu điểm và cho ra
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -18- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
các sản phẩm cà phê có chất lượng và hương vị tốt hơn. Một số chế phẩm vi sinh đã

được nghiên cứu và sản xuất:
- Chế phẩm biocoffee-1 từ chủng nấm mốc Aspergillus niger chứa hoạt tính
enzyme pectinase và cellulase cao với thành phần môi trường tối ưu là 9% cà rốt,
15% vỏ trấu và những thành phần khác là 75% cám và 1% NH
4
(SO
4
)
2
và các yếu tố
khác như sau: điều kiện nhiệt độ khoảng 27-30
o
C (nhiệt độ phòng), độ ẩm từ 56-
64%W và thời gian từ 40-44 giờ. Quá trình nhân lên của chế phẩm, hai loại bột mì
và bột sắn nhận thấy là tốt nhất và tỉ lệ tốt nhất là bột mì: bột sắn = 2:1, với độ ẩm
56% và thời gian 30 giờ. Điều kiện tối ưu cho quá trình dung chế phẩm để lên men
cà phê là cà phê nên ngâm nước 1 giờ và để ráo, thời gian lên men 16 giờ và tỉ lệ
chế phẩm: Trọng lượng cà phê sử dụng là 16/1000. [7]
- Chế phẩm sinh học (chủ yếu là enzyme pectinase và enzyme cellulase), từ
chủng nấm mốc Aspergillus niger và Trichoderma reesei có hoạt tính phân giải
mạnh trên đối tượng cà phê nhân, tác động chủ yếu vào hai thành phần chính là
pectin và cellulose. Với các điều kiện tối ưu như sau:
+ Tỉ lệ cơ chất tối ưu cho chế phẩm là 2 phần bột mì và 1 phần bột sắn.
+ Thời gian nuôi các vi sinh vật tối ưu cho sinh tổng hợp pectinase và cellulase
là 30 giờ
+ Chế phẩm có hiệu quả tốt trong lên men ba loại cà phê phổ biến ở Việt Nam
(cà phê Bi, Sẻ và Mokka). Cà phê sau lên men có độ hòa tan và khối lượng chất tan
thu được tăng rõ rệt so với cà phê không được lên men.
+ Ngâm hạt cà phê trước khi lên men trong 1 giờ là thời gian ngâm thích hợp
giúp thu được nhiều chất hòa tan nhất.

+ Thời gian lên men hạt cà phê tối ưu là 16 giờ.
+ Tỉ lệ chế phẩm sử dụng là 0,16% thì hiệu suất trích ly của hạt sau lên men
đạt tối đa, lượng chất hòa tan thu được cao nhất.
+ pH khối hạt khi lên men giảm dần theo thời gian và cũng giảm theo sự gia
tăng của hàm lượng chế phẩm.
+ Trọng lượng khối ủ giảm dần theo sự gia tăng của hàm lượng chế phẩm.
Theo thời gian lên men thì trọng lượng khối ủ giảm dần, về sau lại tăng nhẹ.
+ Nhiệt độ khối ủ đạt cao nhất sau khi lên men 8 giờ.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -19- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
1.3. Chế phẩm vi sinh Bacillus subtilis và Lactobacillus plantarum trong sản
xuất cà phê lên men theo phương pháp ướt
1.3.1. Giới thiệu về chế phẩm
Chế phẩm được sản xuất nhờ phối hợp 4 chủng vi sinh vật:
- Hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Mục trắng
- Hai chủng vi khuẩn Bacillus subticlic và Lactobacillus plantarum
Trong đó có 3 chủng vi sinh vật: Aspergillus niger, Ph. chrysosporium và
Bacillus subticlic có khả năng phân hủy lớp nhớt bên ngoài hạt cà phê nhờ chúng có
hệ enzyme pectinase và hệ enzyme cellulose. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có
khả năng lên men lactic giúp tăng hương vị cà phê sau lên men.
Cà phê nhân sau khi thu hái về và bóc vỏ tiến hành đem xử lý bằng chế phẩm,
khối hạt cà phê được cho vào bể xi măng, bổ sung chế phẩm vào trộn đều rồi tiến
hành lên men trong khoảng thời gian 12 giờ đến 20 giờ. Trong quá trình lên men
tiến hành đảo trộn, sau đó đem đi rửa và xem hiệu quả xử lý rồi tiến hành chế biến
công đoạn tiếp theo.
1.3.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis
1.3.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được Cohn phát hiện năm 1872. (Ban đầu Bacillus subtilis tên
Vibrio (1835), sau đó đã được đổi tên Bacillus subtilis vào năm 1872), nó phân bố

phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ
khô, dễ tìm thấy trong đất, cỏ khô và trong các chất hữu cơ bị thối rữa, Bacillus
subtilis hiện diện nhiều ở mang, da và ống tiêu hoá của tôm. Chúng cũng hiện diện
tự nhiên trong môi trường nước ngọt và nước mặn.
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng
mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch. Nhiệt độ
thích hợp cho B. subtilis sinh trưởng là 30-50
o
C, thường nuôi cấy ở 37
o
C.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6-0,9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng
không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -20- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B. subtilis trong 200-300 năm. Vi
khuẩn B. subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng
được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi
khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm
tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màu
nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.
Theo sự phân loại khoa học Bacillus subtilis thuộc Giới (Kingdom): Bacteria,
Ngành (Division): Firmicutes, Lớp (Class): Bacilli, Bộ (Ordo): Bacillales, Họ
(Familia): Bacillaceae Chi (Genus): Bacillus. Bacillus subtilis (B. subtilis) là một
trong những vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu.
Các loài:
Bacillus anthracis Bacillus megaterium
Bacillus natto Bacillus subtilis
Bacillus sphaericus Bacillus thuringiensis

Bacillus cereus Bacillus coagulans
Bacillus globigii Bacillus licheniformis
B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, là
sinh vật có nhân điển hình có thể kết thành chuỗi dài ngắn khác nhau và tế bào có
thể đứng riêng rẽ, tế bào có kích thước 3-5x0,6-0,9 μm, sinh bào tử, bào tử chịu
nhiệt khá cao. Ở điều kiện 100
0
C, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính
ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ
(Kerovuo et al., 2000).
Bacillus là vi khuẩn gam dương tính và catalase dương tính, sử dụng khí oxy
làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính hiển
vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que
này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì
người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng
bất định và đang phát triển lan rộng
Chủng này có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào:
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase và dextranase, protease kiềm
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -21- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
có giá trị cao, đặc biệt có khả năng sinh tổng hợp roboflavin (tiền vitamin B2). Vì
vậy B.subtillis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp. [5],[9],[10].
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của Bacillus subtilis
- Nhiệt độ: Hoạt động của vi khuẩn tối ưu nhất xảy ra tại nhiệt độ 37-40
0
C, tại
vùng nhiệt độ này lượng amylase sản sinh ra là lớn nhất. Ở nhiệt độ 40
0
C-50

0
C và
nhiệt độ 30
0
C-40
0
C lượng amylase giảm dần nhưng khi nhiệt độ lớn hơn 60
0
C thì
lượng enzyme tạo ra giảm đáng kể.
- pH: Ở pH axit yếu thì lượng amylase tạo thành cao hơn so với pH axit hay pH
kiềm. pH tối ưu để đạt lượng enzyme amylase là khoảng pH = 5,5-6,5, tốt nhất là tại
pH = 6,5.
1.3.2.3. Môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường chứa các chất như là nguồn cacbon,
nitơ, muối vô cơ và chất dinh dưỡng hữu cơ. Các nguồn carbon bao gồm
carbohydride như glucose, tinh bột hay maltose và acid hữu cơ như axit axetic, mỡ,
rượu…Tuy nhiên trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase thì
đường glucose có thể kìm hãm khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Nguồn nitơ là các muối amoni vô cơ như: amoni clorua, sulfat amoni hoặc
nitrat amoni, hay nguồn nitơ là các hợp chất hữu cơ như: bánh đậu tương, bột đậu
tương, casein sữa, pepton, các chiết xuất từ thịt và các acid amin.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.12: Hình dạng mặt cắt ngang
tế bào của Bacillus subtilis
Hình 1.11: Khuẩn lạc của vi khuẩn
Bacillus subtilis
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -22- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng cũng có ảnh hưởng dến quá trình

sinh trưởng của vi sinh vật.Trong môi trường nuôi cấy có đủ các yếu tố dinh dưỡng
cần thiết cho sự phát triển và tích lũy enzyme của vi sinh vật.
Điều kiện nuôi cấy được tiến hành đối với vi khuẩn ở nhiệt độ từ 25-45°C, tốt
hơn giữa 30-40°C, trong điều kiện hiếu khí bằng cách lắc, khuấy. Độ pH trung bình
tốt nhất của môi trường phụ thuộc vào chủng vi sinh vật được nuôi cấy.[5],[9],[10]
1.3.3. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
1.3.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum
Từ lâu acid lactic (CH
3
CHOHCOH) đã được con người sử dụng để bảo quản
và chế biến thực phẩm. Acid này lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men
chua bởi nhà hoá học Thụy Điển Carl Scheele năm 1780 và được gọi là “acid sữa”.
Năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa
bò là kết quả của một nhóm VSV đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Joseph
Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic
(hiện nay gọi là Streptococcus lactic). Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác
nhau đã được phân lập và nghiên cứu trong đó phải kể đến vi khuẩn Lactobacillus
plantarum.
Theo phân loại khoa học thì vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc:
Ngành : Firmicutes
Nhóm : Trực khuẩn
Bộ : Lactobacillales
Họ : Lactobacillaceae
Chi : Lactobacillus
Loài : L.plantarum
Hầu hết các chủng vi khuẩn lactic thường ít gặp trong đất và trong nước ,
chúng thường phát triển trên những môi trường có chứa nhiều hợp chất hữu cơ phức
tạp như trong sữa và các sản phẩm từ sữa, rau quả muối chua, trên bề mặt thực vật
và xác thực vật đang bị phân giải, trên bề mặt các loại rau quả, trái cây,trong ruột và
các niêm dịch ở người và động vật…[5],[8],[9].

Lactobacillus plantarum là một vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, không có
khả năng di động, khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -23- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô


A B
Hình 1.13. Hình ảnh Lactobacillus plantarum khi quan sát dưới kính hiển vi(A),
khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường thạch(B)
1.3.3.2. Đặc tính sinh học và ứng dụng
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có phản ứng catalase âm tính, có khả
năng đồng hoá cacbonhydrat arabinnose, xenlobiose, fructose, glucose, lactose,
maltose, manitol, melezitose, saccarose, nhưng không sử dụng sorbitol. Chúng hô
hấp tùy tiện, nhiệt độ phát triển được giới hạn trong khoảng từ 15ºC ÷ 40ºC vì là
loài ưa ấm nên nhiệt độ thích hợp để Lactobacillus plantarum phát triển là ở nền
nhiệt độ ấm (30ºC ÷ 35ºC) và pH thích hợp là từ 5,5 ÷ 6,6.
Tính chất đặc trưng của các vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus
Plantarum nói riêng là có khả năng sinh acid lactic nên được sử dụng rất nhiều
trong công nghiệp đặc biệt là trong lên men sản xuất các sản phẩm từ sữa như: sữa
chua, phomat, kefia, yaourt…, hay dùng trong muối chua rau quả vốn đã là một sản
phẩm truyền thống lâu đời.
Một đặc tính quan trọng nữa của Lactobacillus plantarum đó là chúng có khả
năng sinh bacterioxin, một loại loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác
do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại
bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan
để làm suy yếu thành tế bào.
Ngoài ra Lactobacillus plantarum còn được tìm thấy trong đường ruột con
người và hoạt động như một probiotic vi khuẩn có tác dụng tốt đối với hệ tiêu hóa.
[5],[8],[9].

1.3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus
plantarum
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -24- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Để vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể sinh trưởng và phát triến tốt thì
môi trường nuôi cấy chủng cần phải được quan tâm đến các yếu tố sau:
• Nguồn dinh dưỡng cacbon: Lactobacillus plantarum sử dụng nguồn
năng lượng chính từ các nguồn đường mono- và disaccharide như glucose, lactose,
saccarose, maltose và các acid hữu cơ như acid citric, malic, pyruvic, fumaric,…làm
nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc. Khi không có mặt nguồn cơ chất như trên, vi
khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acid
glutamic, arginin, tirozin,…) và giải phóng CO
2
. Chúng không sử dụng được nguồn
cacbon là polysaccharide.
• Nguồn dinh dưỡng nitơ: phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng
hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát
triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ hữu cơ mà vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao
nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm men
là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất.
Còn đối với nitơ vô cơ thì nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật
chính là muối amon. Đôi khi có lòai không sử dụng được muối này thì nguyên nhân
không phải do bản chất của NH
4
+
mà do sau khi đồng hóa gốc amon , môi trường sẽ
tích lũy các gốc anion vô cơ như SO
4

2-
, HPO
4
2-
, làm giảm pH của môi trường. Đối
với vi khuẩn lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì quá trình sinh trưởng
của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giá trị pH.
• Nguồn vitamin: vi khuẩn lactic nói chung và với Lactobacillus
plantarum nói riêng rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng. Tuy nhiên, đa số
các loài vi khuẩn lactic lại không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ
sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như
nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… Người ta cũng xác
định được rằng: yêu cầu về vitamin riêng biệt của vi khuẩn lactic có thể thay đổi khi
trong môi trường có các acid amin hay acid béo khác nhau. Bazơ purin (adenine,
guanine) cũng làm ảnh hưởng tới nhu cầu của vi khuẩn về acid n-aminobenzoic,
nhu cầu về acid folic giảm nhiều nếu như môi trường có chứa tất cả các acid amin
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -25- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
đã biết, timine hoặc bazơ purin được tổng hợp nhờ vi khuẩn trong sự tham gia của
acid folic.
• Các chất vô cơ: để phát triển và phục vụ các hoạt động sống của vi
khuẩn lactic, cũng cần có các hợp chất vô cơ như: Cu, Fe, Na, P, I
2
, Mn,… đặc biệt
là Mn có tác dụng chống tế bào tự phân. Vi khuẩn làm giảm độ acid có trong môi
trường cần có phức hợp các chất khoáng. Khi vi khuẩn đã kém hoạt lực có thể cho
chúng hoạt hóa ở môi trường đã được bổ sung những ion K
+
, Mg

2+
hoặc Mn
2+
.
• Nguồn Oxy: vi khuẩn lactic không có hệ enzyme cytochrom tham gia
vào hô hấp, nhưng chúng lại thực hiện được hô hấp nhờ hoạt tính của một số hợp
chất có mặt của hệ flavoproteit. Lactobacillus plantarum thường sinh trưởng tốt
trong điều kiện kị khí.
• Nhiệt độ: vi khuẩn Lactobacillus plantarum là loài ưa ấm nên thích
hợp phát triển trên nền nhiệt 30ºC, từ 45ºC trở đi vi khuẩn Lactobacillus plantarum
ngừng hoạt động.
• pH môi trường: các chủng vi khuẩn lactic chịu được pH thấp khác
nhau, pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum phát triển giới hạn trong khoảng
5,5 ± 6,6. [5],[8],[9].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu và dụng cụ, máy móc
2.1.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
được phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ĐH Bách Khoa Đà
Nẵng cung cấp.
Cà phê tươi sau khi thu hái được sử dụng để nghiên cứu, các loại cà phê này
được trồng ở tỉnh Đắk Lắk.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm
2.1.2.1 Thiết bị
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT