chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn bacillus licheniformis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





BÁO CÁO
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase
từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Ngô Xuân Mạnh
Khoa Công nghệ thực phẩm
Trường ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Ngô Thị Mai
Lớp : CNSH - K51
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu
cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".
HÀ NỘI - 2010
ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các
thầy, cô giáo, các đơn vị tập thể, cá nhân trong và ngoài trường.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lòng kính trọng tới PGS.TS
Ngô Xuân Mạnh, người đã tận tình dìu dắt, dạy bảo em trong suốt quá trình thực hiện
đề tài và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi của
các thầy cô khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa công nghệ sinh học trong suốt quá trình tiến
hành đề tài.
Em xin gửi lởi cảm ơn chân thành đến các anh chị khoá trên cũng như toàn thể

bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập cũng như hoàn thành
khoá luận này.
Cuối cùng, con xin được cảm ơn bố mẹ và gia đình đã luôn quan tâm, lo lắng và
tạo điều kiện cho con trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp
này.
Mặc dù đã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của em không tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của thầy
cô để giúp em có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2010
Sinh viên
Ngô Thị Mai
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
Ngô Thị Mai i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xviii
DANH MỤC BẢNG xix
DANH MỤC HÌNH xx
Phần I MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 2
Phần II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Chitosan và chitosan oligosaccharide 3
Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin 3
Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của chitosan 3
Hình 2.3: Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (Tuk-Rai và
Jung, 2002) 4

2.1.2.1. Tính chất vật lí 4
Hình 2.4: chitosan 5
2.1.2.2. Tính chất hoá học của chitosan 5
2.2. Enzyme chitosanase 8
2.2.3.1. Khối lượng phân tử 9
Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 9
2.2.3.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9
Theo Fukamizo và Brezinski (1997) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được
từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là
một enzyme chuyển hoá 9
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào vị trí β-(1-4)-
glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công
vào liên kết này giữa hai phân tử D-Glucosamine và giữa D-Glucosamine với phần N-
ii
Acetyl-D-Glucosamine còn lại. Bảng 2.2 thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số
chitosanase 10
Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 10
Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 11
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn ưa nhiệt 11
2.3.1.1. Khái niệm 11
Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có nhân nguyên thuỷ 11
2.3.1.2. Hình thái và kích thước 11
Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính của
phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0.2-2µm, chiều dài cơ thể khoảng 2.0-8.0µm.
Hình thái vi khuẩn rất đa dạng : hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có
cuống… 12
2.3.1.3. Phân loại 12
Theo Vũ Thị Minh Đức (2001), có thể phân loại vi khuẩn theo hai tiêu chí sau: 12
-Dựa vào hình dạng tế bào vi khuẩn chia thành: 12
+Cầu khuẩn (coccus). Tế bào có hình tròn. Trong cầu khuẩn gồm có: Đơn cầu khuẩn,

Song cầu khuẩn, Liên cầu khuẩn, Tứ cầu khuẩn, Tụ cầu khuẩn 12
+Trực khuẩn (Bacillus): Tế bào có hình que, cũng có các dạng đơn, đôi, chuỗi 12
+Phẩy khuẩn (Vibrio): Tế bào có hình dấu phẩy 12
+Xoắn khuẩn (Spiilum): Tế bào từng xoắn lại 12
Ngoài ra còn gặp vi khuẩn hình sao, hình khối vuông, hình khối tam giác 12
-Dựa vào phản ứng với chất hoá học vi khuẩn được chia thành 2 loại: 12
+Vi khuẩn Gram (+) 12
+Vi khuẩn Gram (-) 12
Nhiệt độ phát triển là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng của vi sinh vật.
Người ta chia nhiệt độ phát triển của vi sinh vật theo các chỉ tiêu: Nhiệt độ tối đa (t0
max), nhiệt độ tối thiểu (t0 min), nhiệt độ tối thích (t0opt) 12
Dựa vào nhiệt độ phát triển, theo Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu (1978),
thì vi sinh vật được chia làm các nhóm sau: 12
iii
-Vi sinh vật ưa lạnh: Bao gồm các vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt độ lạnh từ 00-
200C 12
-Vi sinh vật ưa ấm: Bao gồm các vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ trung bình. Nhịêt độ
tối ưu cho chúng phát triển là 250-360C 12
-Vi sinh vật ưa nhiệt: Bao gồm các vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ tương đối cao,
thường từ 42-690C, một số vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt ở 800-1100C. 12
Tuy nhiên, sự phân chia các nhóm vi sinh vật trên cơ sở nhiệt độ phát triển của chúng
chỉ là tương đối. Một số vi sinh vật ưa ấm sau quá trình thích nghi có thể trở thành vi
sinh vật chịu nhiệt . 13
Cơ chế chịu nhiệt của vi sinh vật đến nay vẫn còn được các nhà khoa học trên thế giới
tiếp tục nghiên cứu. Đặc biệt ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, người ta
thấy rằng cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật là tập hợp của nhiều yếu tố liên quan đến cấu
trúc của màng tế bào, thành phần và cấu trúc protein, enzyme, tính di truyền của màng
tế bào vi sinh vật 13
Đa số các vi sinh vật chịu nhiệt có thành tế bào dày, có độ bền cơ học cao hơn các loại
vi sinh vật khác 13

Thành phần protein và lipid của màng tế bào cũng có vai trò quyết định đến tính chịu
nhiệt của vi sinh vật. Ribosom là nhà máy tổng hợp protein của tế bào, bản chất
protein của ribosom và khả năng chịu nhiệt của nó do các gen chịu nhiệt trong bộ gen
của vi sinh vật điều khiển. Nhiệt độ biến tính protein của ribosom càng cao thì khả
năng chịu nhiệt của vi sinh vật càng cao (Lê Gia Huy và cộng sự, 1997) 13
2.3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 13
Bao gồm màu sắc, hình dạng , kích thước khuẩn lạc. Nó đặc trưng cho từng nhóm vi
khuẩn 13
2.3.4.2. Nhuộm Gram 13
Dựa vào sự bắt màu của vi khuẩn đối với thuốc nhuộm mà chia thành 2 dạng : Gram
(-) và Gram (+) 13
2.3.4.3. Hình thái tế bào vi khuẩn 13
iv
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ta sẽ thấy được hình dạng tế bào vi khuẩn. Dựa
vào đó mà có thể phân vi khuẩn thành các dạng: Hình cầu, hình que, hình dấu phẩy,
hình xoắn… 13
2.3.4.4. Khả năng di động 13
Có loài vi khuẩn không di động, một số ít di động, một số khác lại di động rất mạnh.
Để nhận biết được khả năng này, ta quan sát tiêu bản sống của vi khuẩn dưới kính hiển
vi sẽ nhìn thấy một cách chính xác. Tuy nhiên, ta cũng có thể quan sát hình thái khuẩn
lạc để dự đoán được khả năng di động của vi khuẩn: Những khuẩn lạc có viền nhẵn là
những tế bào vi khuẩn không có tiên mao nên không có khả năng di động, những
khuẩn lạc có viền không nhẵn là tế bào vi khuẩn có tiên mao nên có khả năng di động
(Trần Thị Thanh, 1995) 14
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi
sinh vật 14
- Nguồn Cacbon: Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các
vi sinh vật dị dưỡng. Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và
rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Muốn thu được
enzyme cao thì phải có cơ chất để cảm ứng giúp vi sinh vật có thể sinh tổng hợp

enzyme để thuỷ phân nguồn cơ chất đó. nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứng
cho sinh tổng hợp chitosanase là chitosan, chitin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004) 14
- Nguồn Nitơ: Nguồn nitơ dễ hấp thụ với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Nguồn nitơ
thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone. Nguồn acid amin của các loại
vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau 14
- Nguồn khoáng: Sự có mặt của các nguyên tố đa lượng và vi lượng ảnh hưởng lớn
đến sự sinh tổng hợp enzyme. Phospho, lưu huỳnh rất cần cho vi sinh vật vì chúng
tham gia vào thành phần của những chất quan trọng như nucleotid, protein, enzyme,
vitamin… phospho còn tham gia vào nhiều phản ứng trao đổi chất của tế bào. Các
nguyên tố như sắt, kẽm, đồng, coban… tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng rất cần
thiết cho vi sinh vật để cấu tạo nên một loại enzyme (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự,
1998) 14
v
Nhiệt độ nuôi cấy là một yếu tố quan trọng trong quá trình lên men. Nó ảnh hưởng
trực tiếp lên quá trình sinh trưởng, phát triển và sản xuất sinh khối của vi sinh vật. Còn
pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Ngược lại,
trong quá trình nuôi cấy, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể làm thay đổi
pH môi trường, làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Chính vì vậy, việc
lựa chọn và duy trì giá trị này trong suốt quá trình nuôi cấy là rất quan trọng. Mỗi loại
vi sinh vật đều có một giá trị hoặc khoảng giá trị nhiệt độ, pH tối ưu cho sự sinh tổng
hợp enzyme (Lương Đức Phẩm, 2004) 15
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 15
Phần III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.l. Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu
18
3.2. Phương pháp nghiên cứu 18
3.2.7.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc 22
Cấy trang mẫu giống vi khuẩn đã được tuyển chọn lên đĩa thạch chứa môi trường cấy
truyền, sau đó nuôi trong tủ ấm 480C, sau 22h đem quan sát hình thái khuẩn lạc 22

3.2.7.2. Quan sát hình thái tế bào 22
Tiến hành nhuộm Gram, được thực hiện như sau: 22
- Phiến kính được rửa sạch và làm khô. Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính, dùng
que cấy lấy một lượng nhỏ vừa đủ tế bào vi sinh vật rồi dàn đều trong giọt nước 22
- Hong khô và cố định vết bôi 22
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian 1% hay tím kết tinh (1 – 2 phút), để nghiêng cho
thuốc nhuộm thừa cháy xuổng 22
- Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi (1 – 2 phút) 22
- Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol 22
- Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2 phút .22
- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu 22
Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G- bắt màu đỏ 22
vi
Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng
phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện
nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường,
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnh hưởng đến
hoạt động sống của vi khuẩn. Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng rẽ nhưng
chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốt nhất cho
vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sự tác động
tương tác lẫn nhau. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện của tổng hợp
các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn. Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào các tài liệu đã
công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan
cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôi cấy gồm ba yếu
tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môi trường trong khoảng
[7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C]. 23
Từ phương trình hồi qui có dạng: 23
Y =b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1X1 + b22X2X2 + b33X3X3 + b12X1X2 +
b13X1X3 + b23X2X3 23
Trong đó: X1 - biến số mã hoá của biến thực Z1-nhiệt độ nuôi cấy (T0C), khoảng khảo

sát [40-560C], mức tâm: 480C, bước nhảy: 40C 23
X2 - biến số mã hoá của biến thực Z2-pH môi trường nuôi cấy, khoảng khảo sát [7-9],
mức tâm: 8, bước nhảy: 1 23
X3 - biến số mã hoá của biến thực Z3-nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường
nuôi cấy (%), khoảng khảo sát [0.1-0.3%], mức tâm: 0.2%, bước nhảy: 0.1% 23
Y – hàm mục tiêu, là hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml) 23
b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phương trình hồi quy 23
Chúng tôi xây dựng được ma trận qui hoạch thực nghiệm được thể hiện trong Bảng3.
23
Bảng 3.1. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc
2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 24
Hoạt hóa mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis vào môi trường đã chuẩn bị theo
các công thức đã trình bày 24
vii
Nuôi cấy trong 24h, tốc độ lắc 200rpm 24
Mỗi công thức được lập lại 3 lần 24
- Ly tâm dịch nuôi cấy 6000rpm, ở 40C, thu dịch enzyme thô. Xác định hàm lượng
protein trong dung dịch enzyme theo phương pháp Bradford (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
24
3.2.11.1. Loại sinh khối của dịch nuôi cấy 25
Sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn kết thúc, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ
6000 rpm ở 40C. Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và thu
lại phần dịch trong 25
3.2.11.2. Cô đặc dung dịch enzyme thô 25
Dịch enzyme thô thu được sẽ được chia đều vào các bình thuỷ tinh rồi để đóng đá qua
đêm. Sau đó tiến hành cô đặc dịch enzyme bằng phương pháp sấy đông khô. Phương
pháp này không gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme do được thực hiện ở nhiệt độ rất
thấp (-500C) 25
3.2.11.3. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn cồn 25
Phần IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Bacillus
licheniformis 27
Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ
bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp
mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với
cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết
enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên
môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng 27
Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 27
Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống
vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác 28
viii
Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus
licheniformis 28
Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu 29
Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu 29
4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
30
Sau khi cấy trang mẫu giống Bacillus licheniformis và nuôi ở nhiệt độ 480C trong
24h, hình thái khuẩn lạc quan sát được như Hình 4.3, Hình 4.4 30
30
30
Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 30
Khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis đầu tiên có màu trắng sau
thấy có váng tím trên bề mặt, khuẩn lạc tròn, nhăn, thường mọc thành cụm 30
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học với độ phóng
đại 100 lần, hình thái tế bào quan sát được như Hình 4.5 31

31
Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 31
Bacillus licheniformis 31
Qua tiêu bản nhuộm Gram, ta thấy tế bào có hình que, bắt màu thuốc nhuộm safranin
(màu tím). Như vậy giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram (+). Và
là loại vi khuẩn có khả năng di động 31
4.3. Chọn lựa thời gian tiếp giống và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp
enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis 31
4.3.1. Thời gian tiếp giống 31
Việc xác đinh cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ cho ta biết sự biến đổi của số lượng tế
bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh (tính theo hàm log) được
thể hiện qua các pha, từ đó giúp chúng ta lựa chọn được đâu là thời điểm tiếp giống
thích hợp nhất 31
ix
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt
hoá, ở 480C, tốc độ lắc 200 rpm, cứ 2h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang
học (A620) trong 36h. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Đồ thị 4.2 31
Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian 32
32
Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời
gian 33
Qua Bảng 4.4 và Đồ thị 4.2 ta thấy trong khoảng thời gian từ 0-8h, chỉ số A620 tăng
rất chậm do đây là pha mở đầu trong chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật,
giai đoạn này chúng bắt đầu làm quen với môi trường dinh dưỡng. Ở pha mở đầu, vi
sinh vật đạt tốc độ sinh trưởng cực đại nhưng tế bào chưa phân chia nên số lượng tế
bào chưa tăng hoặc tăng không đáng kể. Từ 8-24h, chủng vi khuẩn Bacillus
licheniformis sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa và đạt cực đại ở 24h (A620 =
1.118), tế bào ở trạng thái động học và được coi là những tế bào tiêu chuẩn. Khoảng
thời gian này chính là pha log của vi sinh vật. Ở pha này, vi sinh vật sinh trưởng phát
triển nhanh nhất, hình thái và đăc điểm sinh lý của vi sinh vật thể hiện điển hình nhất.

Quá trình trao đổi chất mạnh nên sinh khối vi sinh vật và các sản phẩm trao đổi chất
đạt cao nhất ở pha này. Vì vậy trong sản xuất chúng ta nên chú ý đến pha này, tạo điều
kiện thuận lợi nhằm thu được lượng sản phẩm nhiều nhất. Từ 24-30h tốc độ phát triển
bắt đầu chậm lại và số lượng tế bào tương đối ổn định, đây được coi là pha ổn định của
vi sinh vật, vì ở pha này, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào
mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Nguyên nhân của pha ổn định là sự tích luỹ các
sản phẩm trao đổi chất có hại cho vi sinh vật và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Từ 30h
trở đi, số lượng tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis giảm. Đây là pha tử
vong của vi sinh vật. Nguyên nhân của pha này chưa thật rõ ràng nhưng có liên quan
đến điều kiện bất lợi của môi trường cũng như sự cạn kiệt về nguồn dinh dưỡng 33
Như vậy, chất lượng giống tốt nhất và thích hợp nhất cho việc tiếp giống vào môi
trường lên men là ở giai đoạn 8-24h (pha log) trên môi trường hoạt hoá hoặc nhân
giống 33
x
Điều kiện nuôi cấy là yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và
phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện
nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường,
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…. Các yếu tố này có tác động khác nhau đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme chitosanase. Qua tham khảo một số tài liệu và các thí nghiệm
khảo sát được, chúng tôi nhận thấy yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan là
những yếu tố có ảnh hưởng mạnh hơn cả đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase. Trong thực tế, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị
ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu
tố với nhau. Vì thế nếu chỉ dựa trên các nghiên cứu rời rạc để đưa ra điều kiện nuôi
cấy tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn thì kết quả sẽ
không đạt độ chính xác cao. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiêm nhằm
lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosan từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Chọn ba yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng sinh
hoạt tính chitosanase của vi khuẩn là nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào
môi trường. Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch trực giao bậc hai, cấu trúc có

tâm để đưa ra phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ định lượng giữa hoạt tính
enzyme chitosanase và ba yếu tố khảo sát. 33
Các thí nghiệm được tiến hành và kết quả được thể hiện như trong Bảng 4.4 34
Bảng 4.4. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc
2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 34
Bảng 4.5: Hệ số của phương trình hồi quy 35
*** mức ý nghĩa 0.001 35
Từ Bảng 4.5, chúng tôi thấy b2 = 0.1767 đạt giá trị lớn nhất nên pH (biến số X2) là
yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng sinh enzyme chitosanase của vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Tuy nhiên, nhiệt độ (biến số X2) cũng là yếu tố ảnh hưởng
không nhỏ đến khả năng sinh chitosanase (vì giá trị b1 = 0.0845 ). Nhưng khi xét đồng
thời cả hai yếu tố thì pH và nồng độ cơ chất chitosan (b23 = -0.1575) lại gây tác động
mạnh không kém yếu tố pH, nhiệt độ khi xét riêng rẽ. Trong Bảng 4.5 giá trị b3, b22,
b33, b12, b13, b23 mang dấu âm (-) có nghĩa là các yếu tố này thể hiện nghịch biến
xi
với giá trị của Y ( hoạt tính của enzyme chitosanase). Tức là nếu giá trị các biến X3,
X22, X33, X12, X13, X23 tăng thì hoạt tính của enzyme chitosanase giảm và ngược
lại. Giá trị b1, b2, b11 mang dấu dương (+) có nghĩa là nếu giá trị các biến X1, X2,
X11 tăng thì hoạt tính của enzyme chitosanase cũng tăng 35
Sau khi tính toán kiểm tra các hệ số của phương trình hồi qui và kiểm tra sự tương
thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm, chúng tôi thu được phương trình sau:
35
Y = 1.6940 + 0.0845X1 + 0.1767X2 – 0.0253X3 + 0.0280X1X1 - 0.1737X2X2 –
0.4232X3X3 – 0.0602X1X2 – 0.0948X1X3 - 0.1575X2X3 35
Từ kết quả thu được trên ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch
trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm). chúng tôi vẽ được ba đồ thị
sau: 36
36
Đồ Thị 4.3. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính enzyme,
U/ml) 36

Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến
đổi hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính
enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8. 36
37
Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %) và
Y (hoạt tính enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong
khoảng ( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme
chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là
0.2% 37
37
Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y (hoạt
tính enzyme, U/ml) 37
xii
Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong
khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase
đạt cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 38
Từ mặt phẳng trong Đồ thị 4.3, Đồ thị 4.4 và Đồ thị 4.5 và Bảng 4.4, chúng tôi kết
luận rằng khi xét đồng thời cả ba yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan thì giá
trị Y sẽ đạt cực đại khi X1 = 48, X2 = 8 và X3 = 0.2. Vậy điều kiện nuôi cấy tối ưu để
vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh tổng hợp được enzyme chitosanase có hoạt tính
cao tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy là
0.2% 38
4.4. Thu nhận enzyme chitosanase 38
Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ở điều kiện nuôi cấy tối ưu đã
chọn lựa được ở trên ( tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan = 0.2), dịch nuôi
cấy được ly tâm loại bỏ cặn và thu lại phần dịch trong chính là enzyme thô. Hoạt tính
chitosanase thu được trong lần nuôi cấy này là 1.780 U/ml 38
Dịch enzyme thô thu được sau quá trình nuôi cấy có nồng độ protein thấp, do vậy khi
thực hiện các bước tinh sạch tiếp theo như tủa phân đoạn bằng cồn hay muối sẽ khó

khăn do phải sử dụng lượng hoá chất lớn và dụng cụ với thể tích lớn…Do vậy việc cô
đặc dịch enzyme thô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bước tủa phân đoạn sau đó. Phương
pháp được sử dụng là sấy đông khô, phương pháp này khá hiệu quả do quá trình thực
hiện ở nhiệt độ thấp (-500C) nên giảm thiểu bất hoạt enzyme 38
Thể tích dịch thô ban đầu là 200ml sẽ được cô đặc còn 50ml (cô đặc 4 lần). Hoạt tính
của enzyme và nồng độ protein được xác định lại. Tuy nhiên, do bị cô đặc nên nồng độ
các chất sẽ tăng lên rất nhiều và kết quả tính được sẽ không phù hợp với các đường
chuẩn glucosamine và đường chuẩn protein đã có, do vậy để đảm bảo độ chính xác của
các giá trị đo chúng tôi quyết định pha loãng dịch cô đặc 4 lần, sau đó tiến hành theo
các phương pháp đã định. Kết quả cô đặc được thể hiện trong Bảng 4.6 38
Bảng 4.6 Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 39
Dịch enzyme 39
Hoạt tính(U/ml) 39
Nồng độ protein(mg/ml) 39
xiii
Hoạt tính riêng(U/mg) 39
Trước cô đặc 39
1.780 39
0.09 39
19.10 39
Sau khi cô đặc 39
6.83 39
0.34 39
20.04 39
Qua Bảng 4.5 ta thấy hoạt tính của enzyme sau khi cô đặc (6.83 U/ml) đã tăng 3.8 lần
so với trước khi cô đặc (1.78U/ml) và nồng độ protein sau khi cô đặc (0.34mg/ml) tăng
3.6 lần so với trước khi cô đặc (0.09mg/ml). Vì hoạt tính riêng trước cô đặc là
19.10U/mg, sau cô đặc là 20.04U/mg nên cô đặc bằng phương pháp sấy đông khô
không làm thay đổi hoạt tính enzyme chitosanase. Kết quả này cho ta thấy cô đặc bằng
phương pháp sấy đông khô là một phương pháp rất hiệu quả 39

Sau khi cô đặc, chúng tôi tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme của mẫu giống vi khuẩn
này. Việc xác định hoạt tính enzyme chitosanase và hàm lượng protein ở từng phân
đoạn nhằm tìm ra phân đoạn cho hoạt tính enzyme cao nhất. Đây là việc rất quan trọng
vì nó quyết định đến hiệu suất thu hồi và chất lượng enzyme. Do vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện tủa phân đoạn bằng hai phương pháp là tủa cồn và tủa bằng muối
amoni sunphate. Phương pháp thực hiện như đã trình bày trong phần phương pháp
nghiên cứu, lấy 50ml dịch enzyme đã cô đặc để tủa phân đoạn, kết tủa thu được đem
hoà tan trong 5ml đệm phosphate pH = 6 (với tủa phân đoạn bằng cồn) và hoà tan
trong 5ml đệm acetate pH =5.5(với tủa phân đoạn băng muối amoni sunphate) 39
Khảo sát hai phương pháp tủa phân đoạn bằng cồn và muối amoni sunphate, thấy rằng
cả hai phương pháp đều có khả năng phân tách protein thành các phân đoạn thể hiện
hoạt tính của chitosanase khác nhau 39
a, Tủa cồn 39
Kết quả xác định hoạt tính chitosanase, hoạt tính riêng của các phân xuất tủa cồn được
thể hiện trong Bảng 4.7 40
xiv
Bảng 4.7: Hoạt tính chitosanase, nồng độ protein và hoạt tính riêng của các phân
xuất tủa bằng cồn 40
Số liệu trong Bảng 4.7 cho ta thấy ở phương pháp tủa cồn, các phân xuất 0-30% và 30-
40% thì hoạt tính riêng của mẫu giống vi khuẩn này tăng dần khi tăng nồng độ cồn:
phân xuất 0-30%, hoạt tính riêng chỉ đạt 4.35U/ml và hiệu suất thu hồi là 31.57% mà
đến phân xuất 30-40%, hoạt tính riêng đạt 9.12U/ml và hiệu suất thu hồi là 30.82%.
Nhưng đến phân đoạn từ 60-70% trở đi thì hoạt tính riêng lại giảm dần, ở phân đoạn
50-60% hoạt tính riêng là 38.73U/ml và hiệu suất thu hồi đạt 67.29%, thì ở phân đoạn
60-70% hoạt tính riêng giảm còn 20.21U/ml và hiệu suất thu hồi cũng giảm còn
40.28%. Như vậy, phân đoạn thu enzyme có hoạt tính riêng cao nhất là phân đoạn 50-
60% ( 38.73 U/mg). Tuy nhiên ở phân đoạn 40-50% hoạt tính riêng cũng rất cao, đạt
33.06 U/ml nên chúng tôi chọn cả hai phân đoạn 40-50% và 50-60% là những phân
đoạn có hiệu suất thu hồi và tinh sạch enzyme cao để thu hồi chitosanase từ mẫu giống
vi khuẩn Bacillus licheniformis. 40

b, Tủa muối 41
Kết quả xác định hoạt tính chitosanase, hoạt tính riêng của các phân xuất tủa bằng
muối amoni sunphate được thể hiện trong Bảng 4.8 41
Bảng 4.8: Hoạt tính chitosanase và nồng độ protein của các phân xuất tủa bằng muối
amoni sunphate 41
Số liệu trong Bảng 4.8 cho thấy ở phương pháp tủa phân đoạn sử dụng muối amoni
sunphate thì hàm lượng protein và hoạt tính ở các phân xuất khác nhau là khác nhau.
Ta thấy hàm lương protein lớn nhất ở các phân xuất 0-30% (đạt 0.27mg/ml), 30-40%
(đạt 0.21mg/ml). Ở các phân xuất này khi kết tủa bằng muối thì ngoài protein của
enzyme chitosanase kết tủa thì còn một số enzyme tạp khác cũng kết tủa theo nên ta
thấy hàm lượng protein thường lớn hơn hàm lượng protein ở các phân xuất khác. Mặt
khác hoạt tính riêng của enzyme chitosanase ở các phân xuất khác nhau cũng khác
nhau, ở phân xuất 50-60% thì hoạt tính riêng cao nhất đạt 59.17U/ml, điều đó có nghĩa
là không phải phân xuất nào cũng thích hợp cho enzyme hoạt động. Ở phân đoạn 0-
30% hoạt tính riêng đạt 7.88U/ml và hiệu suất thu hồi chỉ đạt 31.57%, phân đoạn 30-
40% hoạt tính riêng vẫn còn rất thấp 13.87U/ml và hiệu suất thu hồi cũng thấp, đó là
xv
do ở các phân đoạn thấp thì lượng enzyme chitosanase kết tủa chưa nhiều nên hoạt
tính thường thấp. Nhưng ở các phân xuất cao như 70-80% hoạt tính riêng cũng thấp
đạt 30.01U/ml và hiệu suất thu hồi là 47.46%, vì ở phân xuất quá lớn thì có thể làm
biến tính protein do lượng muối đưa vào kết tủa enzyme thường lớn. Đồng thời ở các
phân xuất kết tủa trên thì lượng enzyme chitosanase đã kết tủa đi một phần nên ở các
phân xuất sau lượng enzyme chỉ còn lại ít dẫn đến hoạt tính thường thấp. Như vậy,
trong các phân đoạn thì phân đoạn có nồng độ muối 50-60% và 60-70% cho hoạt tính
riêng của chitosanase là cao nhất đạt 59.17U/ml và 55.90U/ml, hiệu suất thu hồi
enzyme cũng đạt cao nhất, ở 50-60% đạt 84.51% và 60-70% là 69.97%. Do vậy đối
với chủng giống vi khuẩn Bacillus licheniformis thì phân xuất thích hợp nhất để thu
enzyme chitosanase là 50-60% và 60-70%, ở phân xuất này thì muối amoni sunphate
không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme chitosanase 41
Dựa vào kết quả ở Bảng 4.7 và 4.8, chúng tôi thấy phương pháp tủa phân đoạn sử

dụng muối amoni sunphate cho thấy hiệu quả phân đoạn enzyme cao hơn. Đối với tủa
phân đoạn bằng cồn thì hoạt tính riêng đạt cao nhất ở phân đoạn 50-60% là 38.73U/ml
và hiệu suất thu hồi chỉ là 67.28%. Trong khi đó, Tủa bằng muối ở phân đoạn 50-60%
hoạt tính riêng đạt cao nhất là 59.17U/ml và hiệu suất thu hồi enzyme khá cao đạt tới
84.51%. Do vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp tủa muối để tách enzyme
chitosanase trong dịch enzyme thô, phân đoạn được lựa chọn là 50-70%. Kết quả được
trình bày trong Bảng 4.9 42
Bảng 4.9: Hoạt tính enzyme chitosanase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
tủa bằng muối amoni sunphate trên phân xuất 50- 70% 42
Như vậy, enzyme thu được trong phân đoạn 50-70% muối cho hoạt tính riêng (81.28)
cao hơn 4.5 lần so với hoạt tính riêng của enzyme trong dịch thô ban đầu (18.12U/ml).
Mức độ tinh sạch đạt 4.5 lần và hiệu suất thu hồi enzyme đạt 91.40% 42
Phần V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
xvi
4
4
5
5
xvii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên đầy đủ
COS Chitosan oligosaccharid
GlcN D-glucosamine
GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
DDA Mức độ deacetyl hóa
(degree of deacetylation)

EtOH Ethanol (cồn)
xviii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 9
Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 10
Bảng 3.1. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2,
ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 24
Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống vi
khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác 28
Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu 29
Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian 32
Bảng 4.4. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2,
ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) 34
Bảng 4.5: Hệ số của phương trình hồi quy 35
*** mức ý nghĩa 0.001 35
Bảng 4.6 Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 39
Bảng 4.7: Hoạt tính chitosanase, nồng độ protein và hoạt tính riêng của các phân xuất
tủa bằng cồn 40
Bảng 4.8: Hoạt tính chitosanase và nồng độ protein của các phân xuất tủa bằng muối
amoni sunphate 41
Bảng 4.9: Hoạt tính enzyme chitosanase từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis tủa
bằng muối amoni sunphate trên phân xuất 50- 70% 42
xix
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin 3
Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của chitosan 3
Hình 2.3: Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (Tuk-Rai và
Jung, 2002) 4
Hình 2.4: chitosan 5
Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 11

Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 27
Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus
licheniformis 28
Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu 29
Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis 30
Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 31
Bacillus licheniformis 31
Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian
33
Đồ Thị 4.3. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính enzyme,
U/ml) 36
Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến đổi
hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính
enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8. 36
Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %) và Y
(hoạt tính enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong khoảng
( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt
cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 37
37
xx
Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y (hoạt tính
enzyme, U/ml) 37
Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong
khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt
cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2% 38
4
5

Sơ đồ 4.1: Quy trình thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis 45
xxi
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Thực hiện đề tài này chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ hoạt tính của chủng vi
khuẩn Bacillus licheniformis và so sánh khả năng sinh enzyme chitosanase của vi
khuẩn này với một số giống vi khuẩn khác, như chủng DC1, 4DC và HC5. Tiếp theo
chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra và lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme chitosanase có hoạt tính cao. Sau đó chúng tôi tiếp tục thu nhận
enzyme chitosanase kỹ thuật bằng hai phương pháp: kết tủa phân đoạn bằng EtOH
(cồn) và tủa phân đoạn bằng (NH
4
)
2
SO
4
và đề xuất quy trình thu nhận enzyme
chitosanase kỹ thuật.
Để xác định sơ bộ khả năng sinh hoạt tính chitosanase của chủng vi khuẩn
Bacillus licheniformis chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chấm điểm và phương pháp
đục lỗ thạch. Chúng tôi sử dụng phương pháp acid dinitrosalicylic để xác định hoạt
tính enzyme chitosanase và phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein.
trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị ảnh
hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà nó còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu
tố với nhau. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiệm nhằm lựa chọn điều
kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis. Chúng tôi thiết kế thí nghiệm bằng cách lập ma trận qui hoạch thực
nghiệm, sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm và xử lí kết quả bằng
phần mềm NEMRODW.
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, đặc điểm hình thái khuẩn lạc và

hình thái tế bào của giống vi khuẩn này. Tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất
cho mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là 48
0
C, nồng độ cơ chất chitosan
0.2%, pH =8. Trong quá trình tiến hành thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật, chúng
tôi đã xác định được phân xuất tủa cồn là 40-60% và tủa amoni sunphate là 50-70% là
các phân xuất thích hợp để làm sạch enzyme chitosanase từ mẫu giống Bacillus
licheniformis. Tuy nhiên trong hai phương pháp đó thì phương pháp tủa phân đoạn
bằng muối amoni sunphate là phương pháp cho kết quả tốt nhất.
xxii
Phần I MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chitosan là polymer hữu cơ được thu nhận bằng cách deacetyl hoá chitin.
Chitin có trong động vật thuỷ sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ. Hàm lượng chitin
chiếm tỉ lệ khá cao, từ 14-35% so với khối lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan
và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như
trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ
phẩm, xử lý nước thải và bảo vệ môi trường…do đó việc nghiên cứu sản xuất chitin,
chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu.
Chitosan – oligosaccharide (COS) là sản phẩm thuỷ phân của chitosan. Chúng
là những chất có hoạt tính sinh học cao như chúng có tác dụng điều hoà huyết áp, làm
tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết uric, chống ung thư, trị được
bệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng của cây trồng.
COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước
mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm : COS giúp kích thích tiêu
hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư…COS có thể được sản xuất bằng
phương pháp hoá học ( thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid HCl đậm đặc ) hoặc bằng
phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicenlulase, cellulase để thuỷ
phân chitin, chitosan ). Tuy nhiên việc thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid đậm đặc có

nhiều nhược điểm như chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, hao
mòn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt tính không cao. Do đó, việc nghiên cứu sản
xuất COS bằng phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện
phản ứng nhẹ nhàng, ít gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có chất lượng tốt.
Enzyme chitosanase là một enzyme thuỷ phân liên kết nội phân tử cơ chất
chitosan. Enzyme chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra COS.
Enzyme chitosanase có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như vi
khuẩn, nấm, hay một số thực vật…nhưng enzyme chitosanase thu nhận từ chủng vi
khuẩn là có hoạt tính cao hơn cả. Các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp
1