nghiên cứu định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
LÊ DUY CƯỜNG
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN
TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG
Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số : 60.72.04
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THỊ CHI MAI
HÀ NỘI - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
LÊ DUY CƯỜNG
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN
TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
SIÊU HIỆU NĂNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Chi Mai –
Trưởng khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh Viện Nhi Trung Ương, phó trưởng
khoa Kỹ Thuật Y Học- Trường Đại Học Y Hà Nội, người đã cho em nền tảng
kiến thức trên con đường nghiên cứu khoa học và tận tình hướng dẫn em hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị ở Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại Học Y Hà Nội đã đã dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình

học tập tại bộ môn.
Em xin chân thành cảm ơn đến các anh chị trong khoa xét nghiệm Hóa
Sinh – Bệnh Viện Nhi Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ em, và tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp em thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, ủng hộ và giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, con xin gửi lòng biết ơn biết ơn bố mẹ, anh chị, mọi người
thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để
con vượt qua khó khăn trong học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp bác sỹ
nội trú Trường Đại học Y Hà Nội.
Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2013
Bác sỹ nội trú
Lê Duy Cường
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các
số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2013
Học viên
Lê Duy Cường
MỤC LỤC
1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO-
2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16
1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN
TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17
1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18
1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI
DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19
1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN
KHÁC 21

XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22
2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.1. HÓA CHẤ 31
ỨU : 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
ỂU 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
G TẠODẪNXUẤT 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
THE CÔG THỨC: 41
LOD = X + 2SD 41
2.2. 41
42
THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42
TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42
I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42
10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42
MỨ 80-10%. 42
[ 42
25 42
] 42
2. 24 42

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà

hóa phân tích)
AQC 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl carbamate
ASTM American Society for Testing of Materials (Hiệp hội phép thử Mỹ)
DAD Diod array detector (Detector mảng diod)
CV coefficient of variation ( hệ số biến thiên)
ECF Ethyl chloroformate
FID Flame ionization detection (Phương pháp ion hóa hình ngọn lửa)
FMOC-Cl 9-fluorenylmethyl-chloroformate
GABA Gama amino butyric acid
GC Gas chromatography (sắc ký khí)
IPAD Integrated Pulsed Amperometric Detection (Phương pháp phát
hiện xung dòng điện tích hợp)
ISO International Standard Organization (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)
LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)
MPA 3-mercaptopropionic acid
QC Quality control (Kiểm tra chất lượng)
RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh
SD standard deviation (độ lệch chuẩn)
SSA 5-sulfosalicylic acid
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
UPLC Ultra high performance chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng)
UV Ultraviolet (Vùng tử ngoại)
Vis Visible (Vùng khả kiến)
DANH MỤC VIẾT TẮT CỦA CÁC ACID AMIN
1-Methylhistidine
(1MH)
Cystathionine (Cyst) Norvaline (Nva)
3-Methylhistidine (3MH)
Cystine (Cys)

Derivation peak (Deri)
Ornithine (Orn)
α-Aminoadipic acid (AADA)
Ethanolamine (EA) Phenylalanine (Phe)
Alanine (Ala)
γ-Amino-N-butyric acid
(GABA)
Phosphoserine (PSer)
allo-Isoleucine (aIle)
Glutamic acid (Glu) Phosphoethanolamine
(PEA)
α-Amino-N-butyric acid
(AABA)
Glutamine (Gln) Proline (Pro)
Ammonia (NH
3
) Glycine (Gly) Sarcosine (Sar)
Anserine (Ans)
Histidine (His) Serine (Ser)
Arginine (Arg)
Homocystine (HCys) Taurine (Tau)
Asparagine (Asn)
Hydroxylysine 1 (Hyl1) Threonine (Thr)
Aspartic Acid (Asp)
Hydroxylysine 2 (Hyl2) Tryptophan (Trp)
β-Alanine (B-Ala)
Hydroxyproline (HyPro) Tyrosine (Tyr)
β-Aminoisobutyric acid
(BAIB)
Isoleucine (Ile) Urea

Carnosine (Carn)
Leucine (Leu) Valine (Val)
Citrulline (Cit)
Lysine (Lys)
Creatinine Methionine (Met)
DANH MỤC CÁC BẢNG
1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO-
2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16
1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO-
2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16
1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN
TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17
1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN
TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17
1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18
1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18
1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI
DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19
1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI
DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19
1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN
KHÁC 21
1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN
KHÁC 21
XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22
XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22
2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.1. HÓA CHẤ 31
2.1.1.1. HÓA CHẤ 31

ỨU : 33
ỨU : 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
ỂU 33
ỂU 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
G TẠODẪNXUẤT 36
G TẠODẪNXUẤT 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
THE CÔG THỨC: 41
THE CÔG THỨC: 41
LOD = X + 2SD 41
LOD = X + 2SD 41
2.2. 41
2.2. 41
42
42

THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42
THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42
TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42
TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42
I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42
I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42
10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42
10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42
MỨ 80-10%. 42
MỨ 80-10%. 42
[ 42
[ 42
25 42
25 42
] 42
] 42
2. 24 42
2. 24 42
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống UPLC Error: Reference source not found
Hình 1.2: Thuốc thử Marfrey Error: Reference source not found
Hình 1.3: Hệ thống IPAD Error: Reference source not found
Hình 2.1: Phản ứng tạo dẫn xuất Error: Reference source not found
Hình 3.1. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 380 C Error: Reference source not
found
Hình 3.2. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 400 C Error: Reference source not
found
Hình 3.3. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 41.20 C,. Error: Reference source
not found
Hình 3.4. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 420 C: Error: Reference source

not found
Hình 3.5. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 430 C Error: Reference source not
found
Hình 3.6. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 480 C: Error: Reference source
not found
Hình 3.7. Sự cải thiện hiệu năng phân tách khi thay đổi thành phần pha di
động A-B Error: Reference source not found
Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm với dung dịch B tự pha. .Error: Reference
source not found
Hình 3.9: Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân MSUD (1) 59
Hình 3.10: Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân MSUD (2) Error:
Reference source not found
Hình 3.11. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân citrullinemia (1)
Error: Reference source not found
Hình 3.12. Kết quả phân tích mẫu nước tiểu của bệnh nhân citrullinemia(1)
Error: Reference source not found
Hình 3.13. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân citrullinemia (2)
Error: Reference source not found
Hình 3.14. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân viêm gan virus cấp
Error: Reference source not found
Hình 3.15. Kết quả phân tích acid amin máu của bệnh nhân suy gan cấp
và bán cấp Error: Reference source not found
Hình 3.16. Kết quả phân tích acid amin máu của bệnh nhân viêm gan
chưa rõ nguyên nhân Error: Reference source not found
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu là một công cụ
quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh
(RLCHBS). Đây cũng là một công cụ quan trọng để theo dõi tình trạng dinh
dưỡng ở bệnh nhân được nuôi dưỡng bằng đường tĩnh mạch. Sử dụng phân

tích acid amin tự do trong chương trình sàng lọc sơ sinh đã cho phép chẩn
đoán nhanh một số RLCHBS như bệnh phenylceton niệu, MSUD (maple
syrup urine disease), một số rối loạn trong chu trình urê, bệnh homocystine
niệu…Đây là những bệnh mà liệu pháp điều trị đòi hỏi phải có chế độ theo
dõi đặc biệt đối với nồng độ acid amin tự do trong máu nhằm kiểm soát ở
mức tốt nhất quá trình rối loạn chuyển hóa. Chế độ ăn hạn chế protein là bắt
buộc đối với các bệnh nhân mắc RLCHBS này, tuy nhiên điều này sẽ dẫn đến
thiếu hụt các acid amin thiết yếu gây ảnh hưởng đến quá trình phát triển của
trẻ. Do đó, việc theo dõi cẩn thận và duy trì nồng độ acid amin trong máu ở
mức tối ưu ở những bệnh nhân này sẽ mang lại những lợi ích lâu dài trong
điều trị.
Bên cạnh ứng dụng trong đánh giá tình trạng dinh dưỡng ở bệnh nhân
mắc RLCHBS, định lượng acid amin tự do trong các dịch sinh vật khác còn
được áp dụng trong một số nghiên cứu như: tình trạng suy tế bào gan, bệnh lý
ung thư, chuyển hóa cơ, rối loạn dẫn truyền thần kinh, bệnh tim mạch, kháng
insulin, nghiên cứu sinh lý, dược lý, nuôi cấy tế bào, và phân tích giá trị dinh
dưỡng ở thực phẩm.
Theo các báo cáo từ khoa Nội tiết và chuyển hóa - bệnh viện Nhi Trung
Ương trong vài năm gần đây, số trẻ mắc các bệnh RLCHBS với tỷ lệ 1/5000 trẻ
sinh ra, trong đó tỷ lệ tử vong lên đến 48%. Đồng thời, việc xét nghiệm chẩn
đoán rất khó khăn, các mẫu bệnh phẩm định lượng acid amin tự do phải gửi ra
nước ngoài dẫn đến kết quả xét nghiệm rất chậm. Ở Việt Nam, có nhiều bệnh
2
nhân mắc RLCHBS nhưng không được chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến
những di chứng nặng nề.
Trên thế giới, định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu đã được tiến
hành từ những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ XX. Phương pháp phổ biến
nhất được sử dụng là sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột bằng ninhydrin.
Đây là phương pháp có ưu điểm rẻ tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên, sắc ký trao
đổi ion có nhược điểm là thời gian phân tích dài (120 phút/mẫu , hiệu năng

thấp và đòi hỏi về bảo trì phức tạp nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp
với các phòng xét nghiệm.
Trong những năm gần đây, một phương pháp mới đã được ứng dụng để
thay thế cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(UPLC). So với sắc ký trao đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt trội ở
hiệu năng và rút ngắn được thời gian phân tích. Khoa Hóa sinh bệnh viện Nhi
Trung Ương đã được trang bị hệ thống UPLC nhằm phân tích acid amin tự do
trong các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, sàng lọc, theo dõi điều trị
một số RLCHBS. Để có thể áp dụng thiết bị UPLC vào phân tích acid amin tự
do, cần phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào sử dụng. Do đó chúng
tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng acid amin tự do trong máu và
nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng” với hai mục tiêu:
1. Đánh giá quy trình định lượng acid amin tự do trong máu và nước
tiểu bằng phương pháp UPLC.
2. Ứng dụng kỹ thuật phân tích acid amin tự do trong máu và nước tiểu
bằng UPLC ở một số bệnh nhi nghi ngờ rối loạn chuyển hóa.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Các phương pháp sắc ký
1.1.1. Lịch sử phương pháp sắc ký
Cùng với quang phổ, sắc ký từ lâu đã trở thành một trong hai công cụ quan
trọng và không thể thiếu được của hóa phân tích. Có thể nói, nhờ những tính
năng ưu việt của mình, sắc ký đã trở thành nền tảng quan trọng trong các ứng
dụng để phân tích, tách chiết các hợp chất cần nghiên cứu. Trong các phương
pháp tách hiện nay, sắc ký là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi
một hỗn hợp phức tạp về thành phần và hàm lượng. Phát minh ra sắc ký có thể
xem là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa học ở thế kỷ XX.
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsve đã phát minh ra kỹ thuật sắc
ký vào năm

19 khi ông đang nghiên cứu về chlorophy . Chữ sắc trong sắc ký có
nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu
của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục
được dựng dự các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc
Năm 195,
Archer John Porter Mart và Richard Laurence Millington Syng
được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố.
Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt
thế kỉ
. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có
thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký
khác nhau. Đồng thời, kỹ thuật thực hiện sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho
phép phân tích các phân tử tương tự nha
4
1.1.2. Nguyên ý về sắc ý
Sắc ký là một quá trình phân tách các chất dựa trên sự di chuyển với
tốc độ khác nhau của các chất dưới tác động hóa lý của hai pha: tĩnh, động
+ Pha tĩnh còn gọi là pha cố định, là phần chất liệu, dung dịch được giữ
cố định trong quá trình sắc ký. Pha tĩnh có tác dụng giữ các chất lại
+ Pha động là phần khí ( sắc ký khí ), dung dịch ( sắc ký lỏng ) chảy
qua pha tĩnh. Pha di động có tác dụng kéo các chất đi
Hai pha này luôn tiếp xúc với nhau nhưng không trộn lẫn vào nhau. Chất càng
có ái lực mạnh với pha tĩnh thì di chuyển càng chậm và ngược lại.
1.1.3. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký
Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho peak trên sắc ký đồ.
Nếu gọi tR là thời gian lưu giữ của một chất, thì t’R = tR – t0
Trong đó: t’R là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)
t0 là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

Cùng trong một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định và các chất khác nhau thì có thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào
bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng
định tính các chất.
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu
có thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được
sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k’ khác nhau, hệ số
chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký
5
Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy α luôn lớn
hơn 1, càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thường phân tích
trong điều kiện trong khoảng 1,5 đến 2.
S ố đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết,
ở mỗi tầng sự phân bố các chất tan vào hai pha đạt một trạng thái cân bằng
mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý
thuyết được định nghĩa như là một khu vực của hệ thống phân tách mà trong
đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan
trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:
Trong đó: W : Là chiều rộng peak ở đáy peak
W1/2 : Là chiều rộng peak đo ở nửa chiều cao peak
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất
định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với
mỗi chất phân tích.
Độ phân giải (R

S
)
6
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất khác nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho . Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính
theo 1 trong 3 công thức sau:
Rs càng lớn hai chất càng có khả năng tách khỏi nhau. Rs =1 là hai đỉnh
vẫn xen phủ nhau 4%. Rs=1.5 là hai đỉnh vẫn xen phủ nhau khoảng 0.3%
1. . . Ứng dụng của sắc ký
−
Định tính: Xác định chất hay thành phần hỗn hợp chất phân tích nào
đó. Việc xác định định tính các thành phần trong hỗn hợp có thể tiến hành
bằng hai cách:
1.
Sử dụng mẫu chuẩn: đó là dung dịch của những chất ở dạng tinh khiết giả
thiết có trong hỗn hợp cần xét nghiệm
2.
Tiến hành sắc ký mẫu tinh khiết và mẫu thử với cùng loại sắc ký, cùng điều
kiệ
−
Bán định lượn : thường dùng trong sắc ý giấy xác định lượng acid amin
trong dịch chiết nào đ
−
Định lượng với độ chính xác cao: Thường dùng sắc ký lỏng hay sắc ký
khí trên cột vì có khả năng phân tách các chất rất cao và có sự ổn định về mặt
7
kỹ thuật. Trên cơ sở sắc ký đồ của mẫu thử có thể tính được một cách chính
xác hàm ư ng chất nghiên cứu trong mẫu thử
−
Xác định độ tinh khiết của sản phẩm: Thường dùng sắc ký lỏng hay sắc

ký khí trên cột. Thông thường mỗi một chất có đặc tính lý hóa phân tử mà
được đẩy ra khỏi cột sắc ký với một đỉnh duy nhất ở một thời điểm nhất định
trên sắc ký đồ. Khi một sản phẩm nào đó xuất hiện hai đỉnh trên sắc ký đồ thì
chắc chắn sản phẩm đó chứa hai chất khác nhau và ngược lại
−
Xác định trọng lượng phân tử protein ngay cả khi protein chưa được tinh
sạch: Trong trường hợp này thường áp dụng sắc ký lọc gel, các chất được y
ra khỏi cột sắc ký phụ thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của
chúng. Trên cơ sở sắc ký của các chất có trọng lượng phn tử chuẩn trong ùng
điều kiện sẽ tính toán được trọng lượng của chất cần xác định
−
Tinh chế một chất: Nhờ khả năng phân tách rất ưu việt mà sắc ký trở
thành một công cụ vô cùng hữu hiệu trong quá trình tinh chế một chất từ các
nguồn khác nha
1.1. Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC
Thuật ngữ “siêu hiệu năng” được dịch từ cụm từ viết liền
Ultraperformanc ® được đăng ý bảo hộ độc quyền bởi tập đoàn Waters của
Hoa Kỳ. Hệ thống UPLC ứng dụng trong phân tích acid amin có đặc điểm:
sử dụng áp suất cao chạy trên các cột phân tích có kích thước tiểu phần 17
m , đường kính cột 2,1m , chiều dài cột 150mm. Hệ thống cho phép nhận
dạng và định lượng 42 loại acid amin phổ biến và các hợp chất có liên quan
một với tốc độ 32 phút/ mu . Thời gian phân tích được rút ngắn trongk hi độ
8
nhạy, độ đặc hiệu và hiệu năng phân tách được cải thiện là ưu điểm của hệ
thống UPL
UPLC là công nghệ cải tiến từ HPLC, với nguyên tắc cơ bản của sắc ký
phân bố pha đảo (pha tĩnh ít phân cực và pha di động phải phân cực). Trong
HPLC, để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký, người ta sử dụng chất nhồi cột
với kích thước rất nhỏ, thường dưới 10µm với đường kính các xoang xốp bên
trong các hạt từ 80-120Å cho phân tích các phân các phân tử nhỏ và 300Å

dùng cho phân tích các đại phân tử. Do kích thước các hạt rất nhỏ, để dung
môi có thể chảy qua với tốc độ dòng tối ưu (khoảng 1mL/phút với cột có
đường kính trong 4.6mm được nhồi pha tĩnh có kích thước 3.7 µm), người ta
phải dựng bơm nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng dung
môi qua cột. Vì thế phương pháp HPLC còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp.
HPLC là kỹ thuật vốn được sử dụng rộng rãi ở các phòng xét nghiệm
trên toàn thế giới trong vòng 30 năm qua, yếu tố đóng vai trị trong sự phát
triển của kỹ thuật chính là sự cải tiến của vật liệu nhồi cột. Nguyên lý đứng
sau của sự cải tiến này chính là phương trình Van Deemter – mô tả mối liên
quan giữa tốc độ tuyến tính và chiều cao đĩa lý thuyết.
hương trình Van Deemter: H = A +B/u+ C
trong đó
+ : là chiều cao đĩa lý thuyết, thể hiện khả năng phân tách của cột sắc k . H
càng thấp thì hiệu năng phân tách càng cao, do số đĩa lý thuyết N tăng lên
+ u: là tốc độ pha độn
9
+ A: mô tả ảnh hưởng của khuếch tán xoy . A chính là chiều cao riêng phần
thể hiện chất lượng nhồi cột gây ảnh hưởng đến tốc độ chuyển dịch khác
nhau của các phần tử trong cột nhồ
A = 2λdp với λ là thông số phụ thuộc vào kích thước hạt và mức độ đồng
nhất khi nạp cột, dp là đường kính của hạt chất hấp th
+ B/u: mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc của các phân tử chất tan theo
dòng chảy của pha di động
B= 2γDm trong đó γ là hệ số phụ thuộc vào khoảng cách giữa
các hạt, Dm là hệ số khuếch tán trong pha động, Dm nhỏ thì tốc độ pha động
sẽ lớn.
+ C: mô tả sự ảnh hưởng của sự chuyển khối. C chính là chiều cao riêng
phần biểu diễn sự hấp thụ và giải hấp thụ của cấu tử trên pha tĩnh và sự phân
tán của cấu tử trong hai pha
Theo phương trình Van Deemter, sự giảm trong kích thước của tiểu

phần sẽ làm tăng hiệu năng phân tách, mặt khác, hiệu năng này sẽ giảm nếu
tăng tốc độ pha động hoặc tăng tốc độ tuyến tính. Với các tiểu phần có kích
thước nhỏ hơn 2.5 µm, không chỉ có ý nghĩa làm tăng hiệu suất mà hiệu suất
còn không bị giảm khi tăng tốc độ pha động (giúp giảm thời gian chạy sắc ký
bằng cách tăng áp suất của bơm) hoặc khi tăng tốc độ tuyến tính . Bằng việc
sử dụng các tiểu phần có kích thước nhỏ hơn, tốc độ và số đỉnh sắc ký trên
một đơn vị thời gian (độ phân giải) được mở rộng tới những giới hạn mới–
được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC. Trong HPLC, áp suất của bơm
tối đa là 400 bars, nhưng trong UPLC thì hệ thống bơm có thể đạt đến áp
suất 1000 bars hoặc cao hơn. Điều này cho phép sử dụng các tiểu phần có
kích thước bé hơn ( < 2µm) và tạo ra tốc độ pha di động lên đến 5mL/ phút.
Sử dụng tiểu phần có kích thước nhỏ hơn cho phép
10
◊ Đạt được độ phân giải tốt hơn hiệu quả phân tách
◊
Rút ngắn thời gian chạy sắc k
◊
Tăng độ nhạy do đỉnh sắc ký đồ nhọn hơn và cao hơ n
Công nghệ này đã tận dụng đầy đủ những nguyên lý sắc ký để chạy cột
phân tách được nhồi bằng các loại tiểu phần có kích thước bé hơn và hoặc
có tốc độ pha di động nhanh hơn để làm tăng tốc độ, tăng độ phân giải và
độ nhạy
1.1. Hệ thống UPL
Hệ thống bao gồm
1) Hệ thống bơm cao áp và quản lý dung mô
- Bộ quản lý dung môi bốn dòng dung mô
- Bộ quản lý mẫu với Flow Through Needl
- Bộ ổn nhiệt cho cột với bộ tiền làm nóng linh hoạ
- Khay chứa dung mô
- Bộ kít hoạt động cho m

11
- Các sensors phát hiện rò r
2) Detector
3) Phần mềm điều khiển, máy tính, máy i
4) Bộ phụ kiện cho chuẩn bị mẫ
Hình 1.1: ơ đồ hệ thống UPL
1.2. Các phương pháp phân tích acid ami
1.2.1. Lịch sử phân tích acid amin
Phân tích acid amin có vai trò quan trọng trong nghiên cứu cấu tạo của
protein nhờ xác định được thành phần và trình tự acid amin, xác định giá trị
12
dinh dưỡng của thực phẩm. Phân tích acid amin tự do trong dịch sinh học
giúp phát hiện sự thay đổi bất thường trong các bệnh ý, đặc biệt là bệnh lý
chuyển hóa. Nhìn lại lịch sử nghiên cứu phân tích acid amin, những thử
nghiệm sớm nhất về thủy phân protein được tiến hành vào năm 1820 bởi
Braconnot. Ông đã tiến hành thủy phân ge in, lông cừu, xơ cơ bằng S
4
đặc.
Rất nhiều loại hóa chất xúc tác quá trình thủy phân được thử nghiệm suốt hơn
100 năm sau đó và HCl 6M được sử dụng rộng rãi nhất. Năm 1972,Moore và
Stain được trao giải Nobel vì thành tựu phát triển thiết bị tự động dùng cho
phân tách acid amin bằng nhựa trao đổi ion và định lượng chúng bằng cách sử
dụng phương pháp dẫn xuất với ninhydrin.
Sau này, các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC được
ứng dụng cho phân tích acid amin. Một vài phương pháp sử dụng dẫn xuất
hậu cột trong đó acid amin được tách bằng cột trao đổi ion, sau đó được
dẫn xuất bằng ninhydrin, chất phát quang hoặc o-phthalaldehyde. Một
phương pháp khác được sử dụng đó là dẫn xuất acid amin trước khi phân
tách bằng cột HPLC pha đảo.
Độ nhạy của phân tích acid amin nằm ở mức fmol với các phương pháp

sử dụng bộ phát hiện tín hiệu huỳnh quang, và ở mức pmol với detector tử
ngoại (UV- ultraviolet).
1.2.2. Các mẫu bệnh phẩm dùng cho phân tích
Khi tiến hành sàng lọc thường quy cho các rối loạn acid amin, tốt nhất
là nên tiến hành cả trên mẫu máu và nước tiểu. Sự giảm nhẹ của các loại acid
amin chỉ có thể phát hiện được trong máu. Ngược lại, sự lắng đọng của các acid
amin với ngưỡng lọc rất thấp của thận cũng như các khiếm khuyết vận chuyển ở
thận sẽ để lại bằng chứng trong nước tiểu. Ý nghĩa trong chẩn đoán của định
lượng acid amin niệu và máu khác xa nhau: Ví dụ, tăng cystein, arginine, lysine
và ornithin trong nước tiểu là tiêu chuẩn chẩn đoán cho bệnh cystein niệu. Mặt
13
khác, sự tăng này nếu xảy ra trong máu lại liên quan tới ba hội chứng chuyển
hóa trong đó có sự tăng arginine, lysine hoặc ornithin tương ứng.
Dịch não tủy hiếm khi được sử dụng để chẩn đoán các khiếm khuyết
trong chuyển hóa các chất dẫn truyền thần kinh, mà được dựng nhằm cung
cấp thêm thông tin, xác định chẩn đoán và đánh giá mức liên quan của não.
Dịch kính có giá trị trong khám nghiệm tử thi của các RLCH khi không thể
lấy được nước tiểu và các thay đổi của máu sau khi bệnh nhân tử vong.
Nồng độ acid amin trong dịch kính là xấp xỉ tương đương với nồng độ của
chúng trong máu ngoại trừ glutamic, glycine, prolie chỉ bẳng 1/10 so với
trong huyết tương
Dịch ối cũng có giá trị giới hạn trong chẩn đoán trước sinh đối với các
bệnh acid amin. Không giống như các rối loạn acid hữu cơ, ở hầu hết các rối loạn
acid amin bẩm sinh, các chất chuyển hóa trung gian không tích tụ trước khi sinh,
mà phải sau khi sinh mới bắt đầu xuất hiện. Những kiểu thay đổi acid amin bất
thường trong nước ối chỉ có thể phát hiện được ở hai rối loạn chu trình urê: đó là
sự thiếu hụt enzyme argininosuccinate lyase bệnh argininosuccinic acid máu) và
argininosuccinate synthetase (bệnh citrulline máu.
1.2.3. Tình trạng lâm sàng và tiền sử bệnh
Thông tin lâm sàng một phần quan trọng trong chẩn đoán tại khoa

xét nghiệm đối với các rối loạn acid amin di truyền. Xét nghiệm hỉa sinh
máu như khí máu, pH, điện giải, khoảng trống anion, glucose và NH
3
máu
có vai trò cung cấp các định hướng cho các loại RLCH. Tiền sử gia đình về
bệnh chuyển hóa hoặc tiền sử sàng lọc dương tính ở trẻ sơ sinh là rất có ý
nghĩa đối với các bệnh RLCH.
Nồng độ acid amin trong dịch cơ thể chịu ảnh hưởng bởi hàng loạt yếu
tố như tuổi, thay đổi sinh lý, tình trạng dinh dưỡng, ốm đau bệnh tật, thuốc
điều trị và độc tố. Các loại thuốc cũng có thể gây nên trở ngại trong phân tích