đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema spp ở một số tỉnh bắc trung bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT






NGUYỄN THỊ PHƯƠNG




ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN
TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP.
Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ






LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT






NGUYỄN THỊ PHƯƠNG


ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN
TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP.
Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ


Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN KẾ LONG

Hà Nội - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Kế Long,
nghiên cứu viên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã tận tình chỉ
bảo, hướng cho tôi những phương pháp luận hết sức căn bản nhưng vô cùng
giá trị để tôi có những định hướng cho luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn Giám đốc Quỹ phát triển khoa học và công
nghệ quốc gia đã tạo mọi điều kiện về công việc, thời gian để cho tôi được tập
trung vào khóa học và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn tới các anh, chị, em trong phòng Tuyến trùng học –
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình làm
luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
phòng Đào tạo và các thầy cô tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan
tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nguyên cứu.
Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến: bố, mẹ, anh và con
gái Hà Chi bé bỏng đã luôn ở bên động viên, khuyến khích để tôi hoàn
thành luận văn này./.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó!
Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2010
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Hoàng Thị Bích
*
, Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai
Linh, Phan Kế Long (2010)
,
“Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các
chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
Steinernema sp. TĐ3 phân lập từ Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Tạp chí Dược Học
(giấy nhận đăng).
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 . Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode -
EPN. 3
1.1.1 Sơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng. 3
1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema. 5
1.1.3. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 5
1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 6
1.2.1 Giống Xenorhabdus 6
1.2.2. Giống Photorhabdus 7
1.2.3. Sự đa dạng của giống Xenorhabdus và Photorhabdus. 7

1.3. Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh 9
1.3.1. Vai trò của tuyến trùng với vi khuẩn 9
1.3.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp nematode-bacterium 10
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước. 11
1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới. 11
1.4.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam 14
1.4.3. Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về
vi khuẩn. 17
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Vật liệu nghiên cứu. 19
2.1.1. Tuyến trùng 19
2.1.2. Ấu trùng Bướm sáp lớn 20
2.2. Hóa chất và thiết bị 20
2.2.1. Hóa chất 20
2.2.2. Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh 21
2.2.3. Trang thiết bị 22
2.3 Phương pháp nghiên cứu 22
2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 22
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS 23
2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cộng sinh 23
2.3.4. Phương pháp định loại VKCS dựa trên trình tự 16S rDNA 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30
3.1. Gây nhiễm ấu trùng BSL 30
3.2. Phân lập vi khuẩn cộng sinh 30
3.3. Quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh 32
3.4 . Đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng
Steinernema spp. từ các tỉnh Bắc Trung Bộ 34
3.4.1 Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA 34
3.4.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của 03 chủng VKCS 35

3.5. Phân tích sự đa dạng về di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với
giống Steinernema 44
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
4.1. Kết luận 48
4.2 Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC 59


Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella
BTB Bromothymol Blue
DMSO Dimethyl sulfoxide
EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid
EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic
nematode)
EtBr Ethidium bromide
h giờ
IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile)
NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with
bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride)
PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction)
TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA)
TTC Triphenyltetrazolium chloride
VKCS Vi khuẩn cộng sinh
VSV Vi sinh vật
VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 8
Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp. (IJs) 19
Hình 2.2. Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 20
Hình 3.1. Ảnh ấu trùng BSL chết do nhiễm tuyến trùng Steinernema spp. 30
Hình 3.2. Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 30TX1 31
Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 45XT 31
Hình 3.4. Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn TK10 32
Hình 3.5. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 30TX1 33
Hình 3.6. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 45XT 33
Hình 3.7. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn TK10 34
Hình 3.8: Sản phẩm PCR của gen 16S rDNA của các chủng VKCS. 35
Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide ở các loài trong giống Xenorhabdus
42
Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số ở các gốc là
giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu. 46
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng 8
Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 25
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 25
Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 27
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 28
Bảng 3.1: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn
30TX1 36
Bảng 3.2: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16sDNA của vi khuẩn TK10 . 37

Bảng 3.3: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn 45XT
với ngân hàng dữ liệu trình tự quốc tế ( Genbank) bằng chương trình BLAST
ta có kết quả thể hiện ở bảng sau: 38

Bảng 3.4. Kết quả thành phần nucleotide trình tự một phần gen 16S rDNA
các chủng vi khuẩn nghiên cứu 44
Bảng 3.5: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các trình tự nghiên cứu theo
mô hình Jukes-Cantor với phân phối đồng đều 44



Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


1
MỞ ĐẦU

Hiện nay, Các quốc gia đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm sinh
học thay thế cho các chất hóa học để phòng trừ sâu hại. Vi khuẩn cộng sinh
với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes –
EPN) có khả năng gây bệnh trên côn trùng là nhờ có sự cộng sinh chặt chẽ và
đặc hiệu với các vi khuẩn cộng sinh (Xenorhabdus ở Steinernema và
Photorhabdus ở Heterorhabditis). Sau khi thâm nhập vào vật chủ, các vi
khuẩn này sản sinh rất nhanh và tạo ra độc tố giết chết vật chủ, thêm vào đó
các vi khuẩn này cũng tiết ra một số chất chống lại các tác nhân cạnh tranh
khác trong môi trường như vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993).
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt chất sinh ra trong
quá trình trao đổi chất của các chủng/loài vi khuẩn này có khả năng kháng
sinh, kháng nấm, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư chính vì vậy
các chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus là nguồn hợp chất tự

nhiên quan trọng để nghiên cứu các loại thuốc mới cho con người (Chen
et al., 1994).
Do mỗi chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus tạo ra các
hoạt chất khác nhau chính vì vậy việc tìm ra các chủng/loài mới của loại vi
khuẩn này là rất cần thiết. Ở Việt Nam, cho đến nay đã phân lập được hơn 60
chủng EPN từ các vùng sinh thái khác nhau. Đây là cơ sở để chúng ta dự đoán
về sự đa dạng của VKCS với tuyến trùng. Mặc dù, đã có nhiều nghiên cứu về
tuyến trùng rất có giá trị và có ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái, đa
dạng loài nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về VKCS với tuyến trùng,
việc phân loại, định tên và tìm hiểu mối quan hệ giữa vi khuẩn với tuyến
trùng hiện là vấn đề rất cần được nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


2
Để khai thác nguồn tài nguyên vi khuẩn tiềm năng này, chúng ta cần phải
có các nghiên cứu đánh giá về chúng. Với mục đích tìm kiếm thêm các VKCS
với tuyến trùng góp phần làm phong phú và đa dạng hơn cơ sở dữ liệu vi khuẩn
của Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp.
ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ”
với mục tiêu cụ thể như sau:
1/ Phân lập VKCS với một số chủng tuyến trùng giống Steinernema thu được
ở các tỉnh Bắc Trung Bộ.
2/ Phân tích đa dạng di truyền của các chủng VKCS này trên cơ sở phân tích thông
tin di truyền trên đoạn gen 16S và nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của chúng.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2 . Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode
– EPN.
1.1.1 Sơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng.
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode -
EPN) giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc
họ Heterorhabditidae trong ngành giun tròn là những loài giun tròn có ích, ký
sinh ở những loài côn trùng có hại, làm suy yếu hoặc giết chết những côn
trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực vật.
Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúng
mang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990). Trong vòng đời phát
triển của EPN trải qua các giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm (IJ), con trưởng
thành đực và cái. Một chu kỳ xâm nhập vào côn trùng vật chủ và phát triển
của tuyến trùng EPN trong xác chết côn trùng vật chủ bắt đầu từ pha IJs (tồn
tại ở trong đất) đến pha ký sinh phát triển bên trong cơ thể côn trùng vật chủ
và sau khi kết thúc pha ký sinh chúng lại quay trở về pha IJs bên ngoài côn
trùng vật chủ. Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể côn
trùng qua các lỗ tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một số dạng
IJs được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côn trùng
tại nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập. Sau khi vào cơ
thể vật chủ IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu. Tại đây VKCS sẽ
được giải phóng ra khỏi cơ thể tuyến trùng qua miệng (Heterorhabditis spp.)
hoặc hậu môn (Steinernema spp.) để vào xoang máu của côn trùng. Nhờ môi
trường thích hợp là huyết tương vật chủ VKCS nhân nhanh số lượng và tạo ra
độc tố gây chết vật chủ trong vòng 24-48h. Màu sắc của côn trùng vật chủ cũng
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


4

là điểm đặc trưng khác biết giữa 2 giống tuyến trùng: đối với các loài
Heterorhabditis thì khi côn trùng vật chủ chết sẽ có màu đỏ gạch, da xác chết
khô và dai, còn đối với các loài Steinernema khi côn trùng chết sẽ có màu nâu,
xác chết côn trùng không có mùi thối (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Các tuyến
trùng sau đó sẽ trải qua các thế hệ khác nhau, và cuối cùng khi nguồn thức ăn
đã hết, thế hệ cuối cùng sẽ chui ra khỏi xác và phát tán ra môi trường bên
ngoài và trở thành IJs để tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với một côn trùng
vật chủ mới .

Hình 1.1. Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


5
1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema.
Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối
giữa đực và cái, trứng con cái được thụ tinh bởi tinh trùng của con đực. Ở giai
đoạn đầu, con cái đẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở thành ấu trùng thế
hệ 1. Các ấu trùng của thế hệ 1 không phát tán ra ngoài mà ở lại bên trong xác
chết cơ thể vật chủ để sử dụng dinh dưỡng bằng chính các mô của côn trùng
vật chủ và phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành thế hệ 2.
Trong trường hợp xác chết vật chủ vẫn còn nguồn thức ăn, thế hệ 2 tiếp tục
giao phối và tiếp tục phát triển qua thế hệ 3, thậm chí cả thế hệ 4 bên trong cơ
thể vật chủ. Cuối cùng khi nguồn dinh dưỡng đã hết, thế hệ cuối cùng trong xác
chết côn trùng dừng lại ở pha ấu trùng tuổi 2. Các ấu trùng này bắt đầu chui ra
khỏi xác chết côn trùng và phát tán ra môi trường bên ngoài và trở thành IJs
(tuổi 3) và từ đây chúng tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với côn trùng vật
chủ mới.

1.1.3. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis
Không giống với các loài Steineinema, ở các loài tuyến trùng
Heterorhabditis, IJs khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con
cái lưỡng tính (hermaphroditis). Con cái này có khả năng sản sinh ra tinh
trùng cùng với trứng và tự thụ tinh để sinh sản. Từ thế hệ 2 trở về sau, IJs mới
phát triển thành con trưởng thành phân tính đực cái và sinh sản bằng hình
thức giao phối. Giai đoạn đầu của con cái cả lưỡng tính và phân tính, chúng
đẻ trứng (oviparous) nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng
thai (oviviparous); lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ và sử dụng
cơ thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến con cái
thành bọc chứa ấu trùng tuổi 2. Khi phá vỡ thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài
trở thành ấu trùng xâm nhiễm (tuổi 3) nhưng chúng vẫn giữ lại cái vỏ cutin
của ấu trùng tuổi 2 (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


6
1.2. VKCS với tuyến trùng EPN
Mỗi ấu trùng xâm nhiễm của tuyến trùng EPN (infective juveniles –IJs)
mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh chuyên hóa. Đa số các
loài vi khuẩn này đều gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu. Các
nghiên cứu trong 20 năm qua cho thấy Xenorhabdus cộng sinh với
Steinernema, còn Photorhabdus cộng sinh với Heterorhabditis (Adam, 2006).
Dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ họ hàng và tiến hóa của nhiều đại
diện vi khuẩn. Rahn, (1937),
Thomas and Poinar (1979)
đã xây dựng hệ thống
phân loại vi khuẩn trong đó vị trí phân loại của các giống vi khuẩn trên được
sắp xếp như sau:
Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae ( Rahn,1937)
Giống:
Xenorhabdus
Giống: Photorhabdus

1.2.1 Giống Xenorhabdus
Các loài vi khuẩn thuộc giống Xenorhabdus không sinh bào tử, hình que
kích thước 0.3-2 x 2-10 µm, gram âm, kị khí không bắt buộc có cả kiểu hô
hấp và lên men. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 28
0
C; một số chủng
phát triển ở 40
0
C. Lên men đường glucose sinh acid (không sinh khí) và một
số đường khác ít lên men. Phản ứng catalase âm tính và không khử nitrate
thành nitrite. Sự chuyển pha xuất hiện ở các mức độ khác nhau trong môi
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


7
trường nuôi cấy (Boemare and Akhurst, 1988). Pha I sản sinh nguyên sinh
chất trong giai đoạn nuôi cấy (Boemare et al., 1983), di động bằng lông rung
và có thể tập trung lại trong môi trường thạch 0.6-1.2% (Givaudan et al.,
1995). Pha II không bắt màu (Akhurst, 1980), sản sinh kháng sinh (Akhurst,
1982), protein và một số đặc tính khác của pha. Một số chủng di động ở pha
II, nhưng thường pha I mới di động. Đa số các chủng có deoxyribonuclease
và protease dương tính.

1.2.2. Giống Photorhabdus
Các loài vi khuẩn giống Photorhabdus hình que, kích thước (0.5-2 x 1-
10 µm), Gram âm, không sinh bào tử và di động bằng lông rung. Kị khí
không bắt buộc, có cả hô hấp và lên men. Nhiệt độ tối ưu là 28
0
C; một số
chủng phát triển ở 37-38
0
C. Tất cả các chủng đều có phản ứng catalase dương
tính, nhưng không khử nitrate. Âm tính với nhiều đặc điểm của họ
Enterobacteriaceae. Thủy phân gelatin, hầu hết các chủng gây tan huyết cừu
và ngựa, một số sản sinh gây tan huyết hình khuyên trên môi trường máu cừu
ở 25
0
C. Lên men Glucose sinh axit, nhưng không sinh khí. Cũng lên men
đường Fructose, D-mannose, maltose, ribose, và N-acetylglucosamine sinh
axit. Lên men glycerol yếu.
1.2.3. Sự đa dạng của giống Xenorhabdus và Photorhabdus.
Xenorhabdus và Photorhabdus là 2 giống vi sinh vật sống cộng sinh
với 2 giống giun tròn ký sinh côn trùng lần lượt là: Steinernema và
Heterorhabditis (Forst et al., 1997). Đa số các loài thuộc 2 giống vi khuẩn này
gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu. Ngoài ra còn có các loài vi
khuẩn không phải cộng sinh như P. asymbiotica được xác định là gây bệnh
cho người (Farmer et al., 1989) và một nhóm khác chưa xác định đến loài gây
nhiễm bệnh cần liệu pháp điều trị kháng sinh (Peel et al., 1999).
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


8
Mỗi loài tuyến trùng thường chỉ cộng sinh với một loài vi khuẩn mặc

dù một loài vi khuẩn có thể cộng sinh với vài loài tuyến trùng. Hiện nay các
nhà khoa học đã phân lập và mô tả được 18 loài vi khuẩn Xenorhabdus và 7
loài Photorhabdus (Bảng 1.1).
Bảng 1.1: Tuyến trùng và VKCS tương ứng
TT

EPN VKCS Tài liệu tham khảo
1
Steinernema
abbasi
Flavimonas
oryzihabitans
Elawad et al., 1998
2 S. affine X. bovienii Akhurst & Boemare, 1990
3 S. apuliae X. kozodoii Tailliez et al., 2006
4 S. arenarium X. kozodoii Tailliez et al., 2006
5 S. bicornutum X. budapestensis Tailliez et al., 2006
6 S. carpocapsae X. nematophila Akhurst & Boemare, 1990
7 S. ceratophorum X. budapestensis Tailliez et al., 2006
8 S. cubanum X. poinarii Tailliez et al., 2006
9 S. diaprepesi X. doucetiae Fischer-Le Saux et al., 1998

10 S. feltiae X. bovienii Akhurst & Boemare, 1990
11 S. glaseri X. bovienii Akhurst & Boemare, 1990
12 S. hermaphroditum X. griffiniae Tailliez et al., 2006
13 S. intermedium X. bovienii Poinar, 1990
14 S. karii X. hominickii Tailliez et al., 2006
15 S. kraussei X. bovienii Akhurst & Boemare, 1990
16 S. kushidai X. japonica Nishimura et al., 1994
17 S. longicaudum X. ehlershii Tailliez et al., 2006

18 S. monticolum X. hominickii Fischer-Le Saux et al., 1998

19 S. puertiricense X. romanii Tailliez et al., 2006
20 S. rarum X. szentirmaii Tailliez et al., 2006
21 S. riobravis X. cabanillasii Tailliez et al., 2006
22 S. scapterisci X. innexi Fischer-Le Saux et al., 1998

23 S. scarabaei X. koppenhoeferi Tailliez et al., 2006
24 S. siamkayai X. stockiae Tailliez et al., 2006
25 S. thermophilum X. indica Somvanshi et al., 2006
26 S. weiseri X. bovienii Tailliez et al., 2006
27 Heterorhabditis
bacteriophora
Photorhabdus
luminescens
Poinar, 1990
28 H. megidis P. luminescens Poinar et al., 1987
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


9

Từ bảng 1.1 cho thấy X. bovienii có quan hệ cộng sinh với 4 loài
Steinernema, trong khi X. poinarii với 2 loài, còn 3 loài vi khuẩn Xenorhabdus
khác chỉ có quan hệ cộng sinh với duy nhất 1 loài Steinernema. Điều đó cho thấy
tính chuyên hóa của tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn nhưng cũng có tính đa dạng
khá cao.
1.3. Mối quan hệ giữa tuyến trùng và VKCS
1.3.1. Vai trò của tuyến trùng với vi khuẩn
Quan hệ cộng sinh là một mối quan hệ sinh thái cực kỳ phổ biến trong

các quần xã sinh vật trên đất liền, ao hồ và dưới đại dương. Nó đóng vai trò
quan trọng trong việc hợp thành các dạng sống chính trên Trái đất và tạo ra sự
đa dạng sinh học vô cùng phong phú này.
Tổ hợp tuyến trùng – VKCS tương tác với nhau, mỗi bên đều thực hiện
những nhiệm vụ, chức năng riêng để sinh tồn và phát triển nhưng lại giúp bên
kia để tồn tại, tổ hợp này không thể tách rời và tồn tại độc lập trong môi
trường tự nhiên được.
- Tuyến trùng làm vector vận chuyển VKCS:
Khi xâm nhập vào vật chủ côn trùng các IJs đóng vai trò như vector vận
chuyển VKCS vào bên trong vật chủ côn trùng, sau đó tuyến trùng di chuyển
thẳng vào xoang máu côn trùng và giải phóng VKCS.
- Tuyến trùng bảo vệ VKCS:
+ Bảo vệ VKCS ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ, bằng cách để
VKCS trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do VKCS không thể tự tồn tại ở
ngoài môi trường (đất, nước).
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


10

+ Bảo vệ VKCS ở trong cơ thể côn trùng: khi VKCS được giải phóng
từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu của côn trùng, thì theo phản ứng tự
nhiên, côn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) để hạn
chế hoặc loại bỏ VKCS, trong khi đó nhờ tuyến trùng cũng có khả năng tiết ra
một số chất làm trung hòa là làm mất tác dụng kháng thể của các chất này.
Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho VKCS phát triển bình thường trong cơ thể
côn trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
1.3.2. Vai trò của VKCS trong tổ hợp nematode-bacterium
- VKCS sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm:
Độc tố do VKCS tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm cho

xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng vật chủ chết một cách
nhanh chóng trong vòng 24 – 48h. Như vậy, thời gian chết côn trùng vật chủ
khác nhau tùy loại tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại
côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48h.
- VKCS cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng:
Khi mới bắt đầu xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng đã sử
dụng VKCS vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang
máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó, các IJs cũng nhanh
chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành. Từ thế hệ thứ hai tuyến
trùng chuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hóa
(Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
- VKCS hoạt hóa xác chết côn trùng:
Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra, các mô cơ thể côn trùng vật chủ
được hoạt hóa thành nguồn thức ăn thích hợp đối với tuyến trùng. Nhờ đó, từ
thế hệ 2 tuyến trùng sử dụng chính xác chết côn trùng đã được hoạt hóa như
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


11

nguồn thức ăn để tiếp tục phát triển, sinh sôi nảy nở các thế hệ tiếp theo.
Thông thường trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng có thể phát triển 2
đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng vật chủ làm nguồn thức ăn
cho chúng.
- VKCS ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng:
VKCS có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác
nhân sinh học khác như nấm hoặc vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác
chết côn trùng. Điều này có ý nghĩa là chúng có khả năng bảo vệ nguồn thức
ăn nguyên vẹn dành cho tuyến trùng cộng sinh với chúng.
Như vậy, có thể nói đây là một trong những mô hình cộng sinh hoàn

hảo giữa hai loài sinh vật trong tự nhiên. Mô hình cộng sinh này vừa chuyên
hóa cao đến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện và cộng
sinh của loài kia và ngược lại.
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước.
1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới.
Trên thế giới đã có rất nhiều các các công trình nghiên cứu về EPN,
VKCS và các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Jennifer và Harry (1988) đã
nghiên cứu mô tả những đặc điểm sinh học, sinh thái học chung của các loài
tuyến trùng thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis.
Boemare (1998) đã mô tả các đặc điểm hình thái, sinh học của 51 loài tuyến
trùng Steinernema và 18 loài tuyến trùng Heterorhabditis và đặc điểm sinh học,
hoạt tính của các VKCS với 2 chủng tuyến trùng nói trên.
Boemare et al. (1993) sử dụng phương pháp lai chéo DNA để nghiên
cứu mối quan hệ của các chủng Xenorhabdus đã phân lập từ những loài EPN
khác nhau (Steinernematidae và Heterorhabditidae) và từ nhiều vùng địa lý
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


12

khác nhau. Các loài Xenorhabdus được tập hợp vào các nhóm họ hàng DNA
như là X. nematophilus, X. bovienii, X. poinarii, và X. beddingii. Dữ liệu
DNA của loài X. luminescens khác biệt đáng kể so với tất cả các chủng
Xenorhabdus khác. Căn cứ vào những dữ liệu này cùng với những đặc điểm
về kiểu hình tác giả đã đổi tên giống của loài này sang một giống mới
Photorhabdus luminescens.
Bằng phương pháp PCR, Brunel et al. (1997) đã khuyếch đại gen 16S-
rDNA của 13 chủng vi khuẩn của Xenorhabdus cộng sinh với các chủng
tuyến trùng Steinernema và 14 chủng của Photorhabdus phân lập từ tuyến
trùng thuộc giống Heterorhabditis, các tuyến trùng này được thu tại các vùng

khác nhau và đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của 2 giống
Xenorhabdus và Photorhabdus.
Cũng trong năm 1997, Szállás et al. (1997) đã phân tích trình tự của
gen 16S rRNA của 40 chủng VKCS được phân lập từ Heterorhabditis spp. và
7 VKCS của Steinernema spp. được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau,
và trình tự của một vài chủng tham khảo trong họ Enterobacteriaceae. Kết quả
giải trình tự cho thấy chiều dài gen của chủng Xenorhabdus khoảng 1339
nucleotide, còn của các chủng vi khuẩn còn lại nằm trong khoảng 1428 đến
1452 nucleotide. Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy các loài thuộc chủng
Xenorhabdus, Photorhabdus và các vi khuẩn khác thuộc họ
Enterobacteriaceae phân ra thành 3 nhánh khác nhau, trong đó Photorhabdus
được phân chia thành 5 nhánh phụ.
Fischer et al. (1998) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 117 chủng
VKCS với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Xenorhabdus và
Photorhabdus bằng sự phân tích RFLP của sản phẩm PCR gen 16S-rDNA.
Tác giả đã xác định được 30 kiểu gen 16S riêng biệt và nhóm chúng vào các
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


13

giống Xenorhabdus và Photorhabdus. Cả 2 giống đều đa dạng về kiểu gen và
có liên quan tới sự phân bố của tuyến trùng vật chủ.
Fisscher et al. (1999) đã dựa trên những đặc tính về hình thái, sinh lý,
hóa sinh để sắp xếp một số chủng vi khuẩn Photorhabdus vào 3 nhóm: nhóm
I (nhiệt độ sinh trưởng tối đa từ 35-39C) gồm những VKCS với tuyến trùng
H. bacteriophora và H. indica. Nhóm II (nhiệt độ sinh trưởng tối đa 33-35
0
C)
gồm những chủng VKCS với H. megidis, H. zealandica. Nhóm III (nhiệt độ

sinh trưởng tối đa là những VKCS với tuyến trùng ký sinh ở người. Dựa trên
phân tích cây phát sinh chủng loại xây dựng từ trình tự gen 16S-rDNA các tác
giả đã đề xuất phân 3 loài mới: P. luminescens subsp. luminescens subsp.
nov., P. luminescens subsp. akhurstii subsp. nov., P. luminescens subsp.
laumondii subsp. nov., tách ra từ loài Photorhabdus luminescens, và 2 loài P.
temperata sp. nov., P. temperata subsp., temperata subsp. nov. tách ra từ loài
Photorhabdus temperata.
Babic et al.,(2000) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa VKCS với tuyến
trùng H. indica với vi khuẩn Ochrrobactrum spp. Các VKCS tự nhiên P.
luminescens subsp. akhurstii được phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây bệnh
côn trùng H. indica và 14 chủng vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng được thu từ
3 đảo khác nhau ở vùng Caribbean, được mô tả bằng những kiểm tra kiểu
hình thường phân tích trình tự và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn của
PCR gen 16S-rDNA. Các vi khuẩn phân lập được nhóm vào 3 kiểu genome,
mỗi nhóm tương ứng với một đảo. Các đặc điểm kiểu hình và phân tích 16S-
rDNA chỉ ra rằng VKCS Photorhabdus có quan hệ gần gũi với Ochrobactrum
anthropi.
Liu et al. (2001) đã so sánh trình tự của 2 chủng VKCS với tuyến trùng
H. marelatus và S. oregonense thu được từ bờ biển Bắc Mỹ. Trình tự 16S của
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


14

loài Xenorhabdus sp. cộng sinh với S. oregonense gần giống với loài X.
bovienii (cộng sinh với S. feltiae). Loài Photorhabdus sp. cộng sinh với H.
marelatus rất khác biệt với các loài Photorhabdus đã biết mặc dù nó có quan
hệ gần gũi với nhóm P. temperata.
Lakatos (2008) đã mô tả VKCS phân lập từ tuyến trùng ký sinh gây
bệnh côn trùng ở Hungari, một số loài vi khuẩn đã phân lập từ H. downesi

và H. megidis cho thấy rằng chỉ có sự giống nhau về trình tự gen 16S-
rDNA của tất cả các loài và phân loài Photorhabdus đã mô tả. Dựa trên
trình tự gen 16S-rDNA, mối quan hệ phát sinh chủng loại của những
chủng là không chắc chắn, vì giá trị bootstrap thấp. Tác giả đã sử dụng
các trình tự gen gysB cho phân tích cây phát sinh chủng loại, và đã chứng
minh vi khuẩn phân lập từ H. downesi là loài mới Photorhabdus
temperata subsp. cinerea subsp. nov.
1.4.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam
Cho đến nay ở Việt Nam đã phân lập được khoảng hơn 60 chủng từ các
vùng sinh thái khác nhau, một số loài đã được nghiên cứu về khả năng diệt
sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học. Từ năm 1999, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến
trùng. Cho tới nay, đã sản xuất được 7 chế phẩm sinh học tuyến trùng và kết
quả thử nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài
sâu hại khác nhau (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
Phan Kế Long. (2001) đã nghiên cứu và mô tả 2 loài tuyến trùng mới
thuộc giống Steinernema (Rhabditida): Steinernema loci sp. n. và S. thanhi sp.
n. được phân lập từ các mẫu đất bãi biển ở 2 tỉnh Thanh hóa và Hà Tĩnh. Sự
kết hợp các nghiên cứu về hình thái học và dữ liệu phân tích rDNA-RFLP cho
thấy sự khác biệt của 2 loài này với các loài Steinernema khác. Các đặc điểm
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


15

hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của Steinernema loci sp. n. gồm: chiều
dài cơ thể từ 896 - 1072 µm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 µm,
chiều dài đuôi từ 66 - 83 µm, 9 đường bên riêng biệt. Các đặc điểm hình thái
ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi sp. n. gồm: chiều dài cơ thể 720-
960 µm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 µm, chiều dài đuôi 52-72

µm, 9 đường bên. Phân tích RFLP cho thấy Steinernema thanhi sp. n. có thể
phân biệt từ loài S. arenarium bởi 9 enzym giới hạn, từ loài S. glaseri bởi 11
enzym, và 4 enzym từ loài S. loci sp. n.
Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng
trình tự ITS r-DNA, Phan et al. (2001) đã mô tả một loài tuyến trùng
Steinernema mới được thu thập tại tỉnh Thanh Hóa, S. sangi sp. n. Loài mới
này có một đặc điểm tương đồng với loài S. kraussei là ấu trùng cảm nhiễm
cùng có 8 đường bên, nhưng chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 vs. 951 µm),
khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết ngắn hơn (51 vs. 63 µm), chiều dài gai giao
cấu dài hơn (63 vs. 49 µm). Việc phân tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt
giữa 2 loài này bởi 9 enzym giới hạn.
Phan Kế Long và cộng sự. (2003) đã nghiên cứu sự phân bố của các
chủng tuyến trùng thu được. Xác xuất bắt gặp tuyến trùng trong các mẫu đất
thu được là không cao (44 mẫu có 1 chủng EPN trong tổng số 910 mẫu đất).
Trong đó giống Heterorhabditis bắt gặp ít hơn so với giống Steinernema (12
và 32 loài). Heterorhabditis indica là loài phổ biến nhất ở Việt Nam. Trong số
32 loài của Steinernema ở Việt Nam thì có 4 loài mới cho khoa học (S. tami,
S. sangi, S. thanhi và S. loci). Cũng trong năm 2003 Phan Kế Long và cộng
sự. đã dựa trên những đặc điểm sinh học và phân tích RFLP trên vùng trình tự
ITS để công bố loài mới Heterorhabditis baujardi sp. n. Loài mới này có
quan hệ gần gũi với H. indica phân bố rộng rãi ở các nước nhiệt đới.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên


16

Phan Kế Long (2004) đã sử dụng phương pháp Maximum parsimony
để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các kết quả nghiên cứu về hình
thái và giải mã vùng ITS-rDNA của 29 loài thuộc chủng Steinernema thu
được tại Việt Nam. Các loài này được chia thành 5 nhóm chính: nhóm

“intermedium-affine”, “carpocapsae-tami-scapterisci”, “feltiae-kraussei-
oregonensae”, “bicornutum-ceretophorum-riobrave” và nhóm “glaseri-
arenarium-longicaudum-karii” có quan hệ với hình thái của IJs.
Phan Kế Long. (2006) sử dụng các đặc điểm hình thái và trình tự ITS
của các loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema để mô tả 4 loài mới. Chiều
dài của ấu trùng cảm nhiễm của 4 loài mới (Steinernema cumgarense sp. n., S.
eapokense sp. n., S. backanense sp. n., S. sasonense sp. n.) có chiều dài IJs
600 µm. Ấu trùng cảm nhiễm có các đường bên với 4 gờ trung tâm và 2 gờ ở
mép, chúng không có các phần phụ giống sừng trên ở cuối đầu, những loài
này thuộc nhóm ‘carpocapsae-scaterisci-tami’. Chiều dài của ấu trùng cảm
nhiễm của loài S. cumgarense sp. n. giống S. eapokense sp. n. và S.
siamkayai, nhưng khác với các loài S. sasonense sp. n., S. carpocapsae, S.
scapterisci và S. tami. Những loài này có thể phân biệt với những loài gần gũi
S. eapokense bởi giá trị D% và phần hyaline của đuôi ấu trùng cảm nhiễm.
Các phân tích về cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự của gene ITS-
rDNA cho thấy các loài trên là loài mới.
Dự án: “
Genomic approaches to metabolite exploitation from Xenorhabdus /
Photorhabdus - GAME XP
” là dự án giữa Việt Nam, Thái Lan, CHLB Đức và
Anh do chương trình EC-FP7 tài trợ với mục đích nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên từ chất tiết của vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus cộng sinh với
tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis phục
vụ trong y dược. Ở Việt Nam, dự án tập trung phân lập, phân loại tuyến trùng
cùng với VKCS và tách chiết các hoạt chất sinh học. Phan Kế Long và cộng
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên