Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số CHủNG VI KHUẩN Xanthomonas oryzae GÂY BệNH BạC Lá LúA ở MIềN BắC VIệT NAM doc

kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số CHủNG VI KHUẩN
Xanthomonas

oryzae
GÂY BệNH BạC Lá LúA ở MIềN BắC VIệT NAM
Genetic pathogenicity of the strain of
Xanthomonas
oryzae
caused bacterial leaf blight in northern Vietnam

Nguyễn Văn Viết
Đặng Thị Phương Lan
Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam

Abstract
Bacterial leaf blight cause by Xanthomonas oryzae is a destructive disease of rice in Vietnam.
Breeding for resistance to disease has become one of the important issue. Therefore, research on
strains of Xanthomonas oryzae is required to generate information on the pathogen.
Seventy infected leaf samples were collected from different rice varieties grown in different
ecological region of Northern Vietnam. 60 isolate of Xanthomonas oryzae were isolate by isolation
and PCR method, there are 13 different strains groups of Xanthomonas oryzae were identified. Groups
of strain 2 and 3 were recorded with highest frequency of occurrence (14,89%).
Key words: Genetic pathogenicity, bacterial leaf blight, rice.

I. Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas
oryzae pv oryzae gây ra là bệnh nhiệt đới điển
hình của các vùng trồng lúa. Bạc lá lúa trở thành
đối tượng gây hại nghiêm trọng đối với cây lúa,
đặc biệt là trong vụ mùa ở miền Bắc Việt Nam.

Mặc dù số lượng các giống lúa thuần, lúa lai gieo
cấy trong sản xuất khá lớn nhưng tỷ lệ các giống
có khả năng kháng bệnh rất thấp. Với xu thế ngày
càng mở rộng các giống có thời gian sinh trưởng
ngắn và các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc
không có khả năng kháng bệnh, khả năng phát
sinh các dịch bệnh nặng rất dễ xảy ra. Nghiên
cứu chọn tạo giống lúa vừa đáp ứng được các yêu
cầu về thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao,
chất lượng tốt và có khả năng kháng bệnh trở
thành nhu cầu bức xúc.
Để chọn giống kháng bệnh bạc lá cần, xác
định các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá và các
gen kháng bệnh. Cho đến nay trên thế giới đã
phát hiện được nhiều gen kháng bệnh bạc lá khác
nhau. ở mỗi vùng, thậm chí trong cùng một vết
bệnh cùng tồn tại một số chủng gây bệnh. ở Việt
Nam, thường xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn gây
bệnh bạc lá có độc tính cao và có sự đa dạng về
chủng rất lớn. Sau đây là kết quả nghiên cứu xác
định nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở
miền Bắc Việt Nam.
II. Vật liệu
và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Mẫu bệnh bạc lá được
thu thập trên các giống lúa ở các vùng sinh thái
khác nhau.
Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh:
Phân lập vi khuẩn gây bệnh trên môi trường
Wakimoto. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn các

khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên,
kích thước 1 – 2 mm, màu vàng chanh, là đặc
trưng khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonnas
oryzae để cấy truyền. Bảo quản Isolate đã phân
lập trên môi trường Skim milk.
Phương pháp xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ
thuật PCR: tiến hành chiết xuất AND của vi khuẩn.
Nhân gen PCR bằng mồi đặc hiệu để nhận biết
đoạn trình tự 16S – 13S rDNA có mặt đặc thù trong
DNA vi khuẩn bạc lá với trình tự mồi đặc hiệu.
XOR-F:5’- CATGACGTCATCGTCCTGT-3’
XOR-R2:5’-CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3’

STT
Tên m
Trật tự mồi
1 XPC15 5’GACGGATCA3’
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
2 XPC9 5’CTCACCGTCC3’
3 OPAF-3 5’GAAGGAGGCA3’
4 OPC8 5’TGGACCGGTG3’
5 OPC10 5’TGTCTGGGTG3’
6 PAG01 5’CTACGCCTTC3’
7 OPB01 5’GTTTCGCTCC3’
8 OPB02 5’TGATCCCTGG3’
9 OPB10 5’CTGTGGGAC3’
10 OPB14 5’TCCGCTCTGG3’
11 OPB18 5’CCACCGCAGT3’

Điện di sản phẩm trên gel agarose 2% ở 65V,

150mA trong vòng 20 phút; Nhuộm bản gel bằng
Ethilium bromide rồi chụp ảnh để xác định các
Isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae.
Xác định nhóm chủng tương đồng của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae nhờ kỹ thuật PCR
(RAPD): sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để nhân các
đoạn AND ngẫu nhiên trong bộ gennom vi khuẩn
Xanthomonas oryzae
Sau khi có kết quả điện di tiến hành xử lý số
liệu bằng phần mềm NTSY spc2.0
III. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên
môi trường và xác địnhvi khuẩn gây bệnh
bằng kỹ thuật PCR
Kết quả bảng 1 cho thấy, 70 mẫu bệnh bạc lá
đã được thu thập trên nhiều giống lúa khác nhau
từ nhiều địa phương khác nhau ở 3 vùng sinh thái
chính của miền Bắc Việt Nam là miền núi phía
Bắc, Đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ.
Kết quả phân lập trên môi trường và căn cứ và
hình thái khuẩn lạc cho thấy có 65 mẫu bệnh khi
phân lập đã xác định có vi khuẩn Xanthomonas
oryzae là nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa. Có 5
mẫu khi phân lập không thấy sự hiện diện của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae.
Bằng kỹ thuật PCR đã xác định được 60 mẫu
có vi khuẩn tương đồng với bộ genom của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae. 60 mẫu xác định có
Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR hoàn

toàn trùng lặp với kết quả phân lập trên môi
trường nhân tạo.
Bảng 1. Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập trên môi trường và
xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR
TT Mã số
Vùng
sinh thái

Địa điểm thu thập
Tên giống thu
thập
Kết quả
phân lập
trên môi
trường
Kết quả xác
định bằng
PCR
1 H16 Mi
ền núi
phía Bắc

Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Nếp + +
2 H17 Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Khang dân + +
3 H18 Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Khang dân + +
4 H25 Hập Hải, Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + +
5 H26 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Bắc thơm 7 + +
6 H32 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Thục hưng + +
7 H33 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + +
8 H37 TT. Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + +

9 H27 TT. Lâm Thao, Phú Thọ Khang dân + +
10 H29 Việt Trì, Phú Thọ Bắc thơm 7 + -
11 H34 Việt Trì, Phú Thọ Khang dân + +
12 H31 Việt Trì, Phú Thọ Q5 + +
13 H28 Mê Linh, Vĩnh Phúc Bắc thơm 7 + +
14 H30 Yên Lập, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Bắc thơm 7 + +
15 H35
Nghĩa Hưng, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc
Q5 + +
16 H36 Vĩnh Yên, Vĩnh Phúc Q5 + +
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
TT Mã số
Vùng
sinh thái

Địa điểm thu thập
Tên giống thu
thập
Kết quả
phân lập
trên môi
trường
Kết quả xác
định bằng
PCR
17 H1 Đồng
bằng
sông
Hồng
Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + +

18 H2 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + +
19 H10 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + -
20 H11 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + +
21 H6 Xuân Nộn, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + +
22 H7 Xuân Canh, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + +
23 H9 Đông Anh, Hà Nội Khang dân + -
24 H8 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Bắc thơm 7 + +
25 H4 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Khang dân + -
26 H5 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Bắc thơm 7 + +
27 H3 Trung Rã, Sóc Sơn, Hà Nội Khang dân + +
28 H19 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng Nếp + +
29 H20 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng HT1 - +
30 H23 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng Bắc thơm 7 + +
31 H24 Kiến Thụy, Hải Phòng Bắc thơm 7 + +
32 H21 Đông Tiến, Quỳnh Phụ, Thái Bình Q5 + +
33 H22 Đông Tiến, Quỳnh Phụ, Thái Bình Nếp 87 + +
34 H38 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Q5 + +
35 H44 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Q5 + -
36 H45 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Nếp 87 + +
37 H46 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + +
38 H50 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Hương cốm + +
39 H53 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + +
40 H54 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Nếp + +
41 H59 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + +
42 H61 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình NR11 + +
43 H48 Hồng Lĩnh, Hưng Hà, Thái Bình Q5 + +
44 H60 Vũ Hội, Vũ Thư ,Thái Bình Tạp giao + +
45 H49 Hồng Lĩnh, Hưng Hà, Thái Bình Bắc thơm 7 + +
46 H39
Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định

Tạp giao + +
47 H47
Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định
Tám thơm + +
48 H51
Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định
Nếp 87 + +
49 H40 Liêm Hải, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + +
50 H43 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Bắc thơm 7 + +
51 H52 Cổ Lễ, Trực Ninh, Nam Định Tám + +
52 H55 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + +
53 H62 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Nếp 87 + +
54 H63 Nam Xá, Trực Ninh, Nam Định Nhị ưu 838 + +
55 H41 Nam Xá, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + -
56 H64 Việt Hùng, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + +
57 H56 Cầu Thọ, Bình Lục, Nam Định C71 + +
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
TT Mã số
Vùng
sinh thái

Địa điểm thu thập
Tên giống thu
thập
Kết quả
phân lập
trên môi
trường
Kết quả xác
định bằng

PCR
58 H57 Mĩ Thuận, Bình Lục, Nam Định CR203 + +
59 H58 Mĩ Thuận, Bình Lục, Nam Định Nếp + +
60 H12 An Bình, Nam Sách, Hải Dương Q5 + +
61 H13 An Bình, Nam Sách, Hải Dương N46 + +
62 H14 Quốc Tuấn, Nam Sách, Hải Dương Q5 + +
63 H15 Cộng Hòa, Chí Linh, Hải Dương Bắc thơm 7 + +
64 H42 TT. Nhương Bằng, Hưng Yên Nếp + +
65 H65 Bắc
Trung Bộ

Quảng Sương, Thanh hóa Việt lai20 + +
66 H67 Quảng Sương, Thanh Hóa HT1 - -
67 H68 Đại Khối, Đông Sơn, Thanh Hóa HT1 - -
68 H69 Đại Khối, Đông Sơn, Thanh Hóa Khang dân - -
69 H70 Thành phố Thanh Hóa TH3-3 - -
Ghi chú: + Phân lập thành công, kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
- Phân lập không thành công, kiểm tra PCR không phải là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa


Ghi chú: Những giếng có vệt sáng là AND được nhân lên của vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv oryzae
Hình 1: Hình ảnh chạy điện di phát hiện vi khuẩn gây bệnh bạc lá
3.2. Xác định các nhóm chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa
Để xác định các nhóm chủng, đã chọn 47
isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae có độc tính
cao trong số 60 isolate đã được xác định là
Xanthomonas oryzae. Qua phân tích bằng 10
đoạn mồi khác nhau để nhân các đoạn AND

trong bộ genom của vi khuẩn Xanthomonas
oryzae cho thấy có 4 mồi cho các băng đa hình là
XPC15, PAG01, XPC9 và OPEF3. Các mồi còn
lại hoặc là không nhân lên được đoạn AND nào
hoặc là chỉ có 1 đoạn, không có ý nghĩa trong
việc xác định đa hình AND. Những mồi đa hình
được ghi lại số băng, trong đó có vệt băng là 1 và
không có vệt băng là 0. Mồi XPC9 va XPC15
nhân được 3 đoạn AND trong bộ genom vi
khuẩn; mồi OPAF3 nhân được 4 đoạn, còn mồi
PAG1 nhân được 5 đoạn. Sử dụng phần mềm
NTSYS 2.0 đã cho cây phân loại của 47 isolate.
Từ cây phân loại 1 và 2 và ở mức tương đồng 0,7
47 isolate vi khuẩn được chia thành 13 nhóm đại
diện cho 13 nhóm chủng trong 47 isolate phân
tích (Hình 1 và 2).
Số liệu phân tích trên bảng 2 cho thấy trong số
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
13 nhóm chủng, nhóm 2 và 3 phổ biến nhất (mỗi
nhóm chiếm 14,89%); Nhóm chủng 1, 4, 5. 7,8,9
chiếm tỷ lệ trung bình (từ 6,38 – 8,51%); Nhóm
chủng 10, 11, 12 và 13 chiếm tỷ lệ ít nhất (2,12 –
4,25%).
Sự phân bố của các nhóm chủng ở các địa
phương khá đa dạng, thường đan xen. Một chủng
phân bố ở nhiều địa phương, một địa phương có
sự hiện diện của nhiều nhóm chủng. Do đặc điểm
này cần bố trí cơ cấu giống lúa đa dạng với đặc
điểm di truyền, đa dạng về tính kháng để hạn chế
tác hại của bệnh.

Bảng 2. Các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae và sự phân bố
của chúng ở các địa phương
Nhóm
chủng

Các isolate Tỷ lệ (%) Địa điểm phân bố
1 H1, H19, H39, H49 8,51 Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định,
Thái Bình
2 H12, H32, H34, H21, H26, H40, H59 14,89 Hải Dương, Phú Thọ, Thái Bình, Nam
Định
3 H2, H3, H5, H42, H52, H61, H65 14,89 Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Thái B
ình,
Thanh Hóa
4 H27, H63, H64 6,38 Phú Thọ, Nam Định
5 H22, H41, H55 6,38 Thái Bình, Nam Định
6 H7, H8, H18, H47, H53 10,63 Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Thái
Bình
7 H14, H23, H38, H50 8,51 Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình
8 H16, H36, H60 6,38 Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Thái Bình
9 H24, H28, H54 6,38 Hải Phòng, Vĩnh Phúc, Thái Bình
10 H17, H35 4,25 Quảng Ninh, Vĩnh Phúc
11 H25 2,12 Phú Thọ
12 H11, H13, H15, H30 8,51 Hà Nội, Hải Dương, Vĩnh Phúc
13 H31 2,12 Nam Định
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
Coefficient

0.5
0.6
0.7

0.8
1.0


1

19

12
32

34

21

26

2

3

5

27

22

7

8

18

14

23

38

16

36

24

28

17

35

25


11
13
15

30

31


Hình 1. Cây phân loại 30 isolate vi khuẩn bạc lá

Coefficient

0.52

0.62

0.72

0.83

0.93



39

49

40

59

42

52

61

65

63

64

41

55

47

53

350

60

54



Hình 2. Cây phân loại 17 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá

kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008

Hình 3. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XOP15




Hình 4. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi APG01




Hình 5. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XPC9
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008
IV. Kết luận
- Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc
trên môi trường nhân tạo và phân tích bằng ký
thuật PCR đã xác định được 60 isolate vi khuẩn
Xanthomonas oryzae trong số 69 mẫu bệnh bạc
lá lúa thu thập từ một số vùng trồng lúa.
- Phân tích 47 isolate vi khuẩn
Xanthomonas oryzae thu thập từ địa phương ở
miền Bắc Việt nam đã xác định được 13 nhóm
chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh
bạc lá lúa. Trong số 13 nhóm, nhóm 2 và 3 phổ
biến nhất (mỗi nhóm chiếm 14,89%).
- Các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá
phân bố đan xen, 1 nhóm chủng có thể xuất
hiện ở nhiều địa phương, 1 địa phương có thể
có nhiều nhóm chủng. Để hạn chế tác hại của
bệnh cần đa dạng nguồn gen lúa và bố trí đa
dạng các giống kháng trong một vùng.

Tài LIệU THAM KHảO
1. Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thuỷ. Khả
năng gây nhiễm của các chủng bệnh bạc lá lúa
miềm Bắc Việt Nam. Hội thảo Quốc gia bệnh
cây và sinh học phân tử. ĐH Nông nghiệp 1,
23-25/10/2003. NXB NN, 2003. 78-86.
2. Nguyễn Văn Viết và CTV. Một số kết
quả nghiên cứu thành phần nhóm nòi sinh lý vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền
Bắc hiện nay và xác định nguồn gen kháng
bệnh giai đoạn 199-2001. Kỷ yếu hội thảo
Quốc gia về khoa học công nghệ bảo vệ thực
vật. NXB NN, 2002.104-110.