tóm tắt luận án nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (lates calcarifer bloch, 1790) đối với vi khuẩn streptococcus iniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



TRẦN VĨ HÍCH



NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ
CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI
VI KHUẨN Streptococcus iniae



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Nha Trang - 2014

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha
Trang

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng


Phản biện 1: …………………………………….


Phản biện 2: …………………………………….


Phản biện 3: …………………………………….


Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án
cấp Trường họp tại Trường Đại học Nha Trang

vào hồi … giờ .…. ngày …… tháng …… năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia
Thư viện trường Đại học Nha Trang
2


MỞ ĐẦU
Cá chẽm là đối tượng có giá trị kinh tế cao đã được nuôi thương
phẩm khá lâu năm ở các nước châu Á và Úc. Trong suốt quá trình
nuôi, cá chịu tác động nhiều nhất bởi vi khuẩn S. iniae. Đã có nhiều
phương pháp phòng và trị bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm đã được
sử dụng như: dùng kháng sinh, probiotic hay các chất kích thích đáp
ứng miễn dịch không đặc hiệu. Tuy nhiên trong khi các chủng vi
khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng thì việc sử dụng prob
iotic hay
các chất kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu vẫn chưa đem
lại hiệu quả thực sự.
Vaccine được thừa nhận là giải pháp tốt nhất trong việc phòng
bệnh do S. iniae gây ra và hiện tại, một số vaccine phòng bệnh do S.
iniae gây ra đã có trên thị trường. Thế nhưng thời gian bảo hộ của
vaccine thay đổi tùy thuộc vào thành phần vaccine, phương thức dẫn
truyền vaccine…trong khi những tha
y đổi mạnh mẽ của vi khuẩn này
nhằm thích nghi với môi trường đòi hỏi các nghiên cứu nhằm tạo ra
các loại vaccine có hiệu lực cao vẫn phải được tiếp tục.
Hơn nữa, hiệu quả bảo vệ của vaccine cũng phụ thuộc vào khả
năng tiếp nhận vaccine của từng loài cá, tuổi cá… trong lúc có quá ít

thông tin về đáp ứng miễn dịch của cá chẽm chống lại bệnh do S. i
niae
gây ra và hầu như không có thông tin về sự phát sinh và phát triển của
hệ thống miễn dịch cá chẽm. Vì thế cần phải có nhiều nghiên cứu về
các vấn đề nêu trên làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng
bệnh sớm cho cá chẽm dựa trên các phương pháp miễn dịch.
Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch
của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn
Streptococcu
s iniae” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài:
1

Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng
bệnh sớm cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học
Các nội dung chính của đề tài:
1. Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập
từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa
2. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi
khuẩn S. iniae
3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae
4. Đánh giá
hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong
phòng bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm.
5. Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ
miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm (Lates calcarifer)
bao
gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung

ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp
ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào
và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu khi bị hoạt hóa
bởi kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae.
Ý nghĩa thực tiễn: C
ác kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở
khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp miễn dịch học
nhằm phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm nuôi tại Việt Nam
bao gồm việc sử dụng các chế phẩm kích ứng miễn dịch không đặc
hiệu (immunostimulants) và liệu pháp vaccine, góp phần phát triển
nghề nuôi cá chẽm tại Việt Nam theo hướng bền vững, an toàn, giảm
thiểu rủi r
o, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường do việc sử
dụng kháng sinh và hóa chất để phòng trị bệnh cho cá.
2

Tính mới của công trình: Đây là công bố đầu tiên về hệ miễn
dịch của cá chẽm và các đáp ứng miễn dịch của cá chẽm tại Việt Nam.
Đồng thời, đây cũng là công bố đầu tiên trên thế giới về sự phát triển
hoàn thiện của tuyến ức của cá chẽm (Lates calcarifer) được thực hiện
bằng phương pháp mô học.
Chương 1. TỔNG LUẬN
1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM S
INH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ
CHẼM
Luận án đã sơ lược đặc điểm sinh học của cá chẽm, tình hình nuôi,
sản lượng cá chẽm và một số bệnh thường gặp trong quá trình nuôi cá
chẽm dựa vào các công bố của Lục Minh Diệp (2010), Copland và
Grey (1987), Glenncross (2006), Kungvankij và cs (1984), Partridge
và Lymbery (2008), Patel và cs (2009), Schipp và cs (2007), Tucker

và cs (1990)…
1.2 BỆNH DO S. iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Bệnh do S. iniae gây ra ở các loài cá nuôi đang có chiều hướng gia
tăng và gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng t
hủy
sản thế giới. Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra ở cá nuôi tại
các quốc gia như: Nhật, Úc, Singapore, Mỹ, Israel, Bahrain, Ấn Độ đã
được tổng hợp từ các công bố của Berridge và Frelier (1998),
Bromage và Owens (2002), Colorni và cs (2002), Eldar và cs (1994),
Kaige và cs (1984), Kusuda và cs (1976), Minami và cs (1979),
Mukhi và cs (2001), Ohnishi và Jo (1981), Pier và Madin (1976),
Sugita (1996)…
Các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S. iniae,
dấu hiệu bệnh lý và phương pháp phòng trị bệnh do S. iniae gây ra đã
được tổng hợp từ các nghiên cứu của Bromage và Owens (2002),
Colorni và cs (2002), Crosbie và Nowak (2004), Eldar và Ghittino
3

(1999), Kusuda và cs (1976), Perera và cs (1994), Park và cs (2009),
Stoffregen và cs (1996)…
1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG
Hệ thống miễn dịch ở cá xương được tổng hợp theo đáp ứng
miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thích ứng dựa theo các công
bố của Blazer (1991), Greenlee và cs (1991), Hasegawa và cs (1998),
Evans và Jaso-Friedmann (1992), Evans và cs (2000), Magnadottir
(2006), Mulero và Meseguer (1998), Fischer và cs (2006)…Các cơ
quan lympho ở cá và sự phát sinh của cơ quan lympho cũng được tổng
hợp từ các nghiên cứu của Grace và Manning (1980), Botham và
Manning (1981), Herraez và Zapata (1986), Ellis (1988), Bowden và
cs (2005), Xie và cs (2006), Patel và cs (2009)…Các công bố đã cho

thấy rằng các nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ở cá
xương xảy ra ở
nhiều đối tượng nuôi và vẫn còn nhiều cơ chế đáp ứng vẫn chưa được
làm rõ. Tuy vậy, nhìn chung, hệ thống miễn dịch của cá xương khá
phát triển với sự hiện diện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với nhiều
chức năng tương tự như hệ miễn dịch động
vật có xương sống bậc
cao. Điều này cho phép cá đáp ứng tốt với việc sử dụng vaccine trong
phòng bệnh.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2008 đến tháng 8/2012 tại
phòng thí nghiệm Bệnh học, Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch
bệnh Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang và phòng thí nghiệm khoa
Sinh học Trường Đại học Bergen, Nauy.
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) kích cỡ dưới 155 gam
Vi khuẩn Streptococcus iniae
4

2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (hình 2.1)
2.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH CÁC NGHIÊN CỨU
2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân
lập từ cá chẽm
2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa
Vi khuẩn được phân lập từ não, thận và lách của cá chẽm nuôi tại
Khánh Hòa trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl và KF ở 28
o
C

trong 24h. Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo
hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey kết hợp so sánh trình tự 16S
rDNA với ngân hàng gene có sẵn trên NCBI.











FKC

2.4.1
.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập
Ba chủng vi khuẩn VN091211R, CR090722P và NH081107P
được lựa chọn để xác định độc lực. Thí nghiệm xác định liều gây chết
50% (LD50) của mỗi chủng vi khuẩn được tiến hành vớ
i 7 nghiệm
thức. Mỗi nghiệm t
hức bao gồm 20 cá chẽm. Trong đó tất cả cá chẽm
ở 6 nghiệm thức thí nghiệm được tiêm 0,2 mL dung dịch huyền phù
5

vào xoang bụng với mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù tăng dần từ
10
2

CFU/mL ở nghiệm thức 1 cho đến 10
7
CFU/mL ở nghiệm thức 6.
Ở nghiệm thức đối chứng, cá được tiêm 0,2 mL PSB vào xoang bụng.
Liều gây chết 50% được xác định dựa vào phân tích tỉ lệ cá chết tích
lũy ở các nghiệm thức trên phần mềm probit, SPSS.
2.4.1.3 Độ nhạy kháng sinh của các chủng S. iniae phân lập
Độ nhạy của các chủng vi khuẩn phân lập với các loại kháng sinh
được tiến hành theo phương pháp của Bauer (1966).
2.4.1.4 Phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn S. iniae vào cá chẽm
Ngâm
cá chẽm
(1,3 ± 0,2g) vào dung dịch nước biển chứa vi
khuẩn S. iniae VN091211R (10
7
CFU/mL) trong 1h. Sau đó nuôi cá
trong nước biển sạch. Tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên 3 cá thể vào các
thời điểm 6, 12, 24, 48 và 72h sau khi cho cá vào bể nuôi. Cố định các
mẫu gan, thận, lách, não, mắt và ruột cá trong dung dịch Buffered
Formalin 10% trong 24. Sử dụng kỹ thuật mô hóa miễn dịch để phát
hiện S. iniae trong các tổ chức mô học của cá thí nghiệm.
2.4.1
.5 Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng phân lập
Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân
lập được xác định bằng
khả năng ngưng kết của huyết thanh cá chẽm
(Plumb and Areechon 1990) sau khi được kích thích miễn dịch bằng
FKC của một chủng vi khuẩn S. iniae, với chính chủng vi khuẩn đó và
với các chủng S. iniae khác.
2.4.2 Đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae

2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với S.
iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng này
Thí nghiệm được tiến hành với 3
nghiệm thức (80 cá/nghiệm
thức). Ở nghiệm thức 1 và 2, cá được cho ăn thức ăn viên trong khi ở
nghiệm thức 3 cá được cho ăn thức ăn tương tự có bổ sung 5‰ β-
6

glucan liên tục trong 2 tuần. Sau 2 tuần nuôi, toàn bộ cá thí nghiệm ở
nghiệm thức 2 và 3 được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae bất
hoạt (10
8
CFU/mL) vào xoang bụng với lượng 0,3 mL/cá.
Các mẫu máu và tiền thận của ba nhóm cá thí nghiệm được thu
ngay trước khi tiêm vi khuẩn bất hoạt và mỗi 12h sau khi tiêm, liên
tục trong 96h. Chỉ số thực bào, hoạt tính thực bào của đại thực bào,
hoạt tính lysozyme và khả năng ức chế vi khuẩn của huyết thanh cá
chẽm được xác định theo phương pháp của các tác giả Crosbie và
Nowak (2004), Shugar (1952).
2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S.

iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC)
i Biến động hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cá chẽm sau khi
gây miễn dịch bằng FKC
Thí nghiệm nghiên cứu biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu
kháng S. iniae ở huyết thanh của cá chẽm được tiến hành với 2
nghiệm thức. Nghiệm thức 1 cá được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S.
iniae bất hoạt (10
8
CFU/mL) vào xoang bụng (0,3 mL/cá). Nghiệm

thức 2, mỗi cá được tiêm 0,3 mL PBS vào xoang bụng. Hàm lượng
kháng thể đặc hiệu kháng S. iniae trong máu cá thí nghiệm kiểm tra
bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp theo phương pháp của Crowther (1995).
ii Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae
Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae được xác
định bằng kỹ thuật SDS-PAGE (Laemli, 1970) và Western blot
(Shoemarker và các cộng sự, 2010).
iii Hiệu quả bảo vệ của FKC đối với bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm
Hiệu quả bảo vệ của F
KC đối với bệnh do S. iniae gây ra ở cá
chẽm được đánh giá thông qua tính an toàn đối với cá chẽm của hỗn
dịch vi khuẩn bất hoạt và hệ số bảo vệ tương đối (RPP).
7

Cá chẽm (135 - 155g) được chia thành 2 nhóm: nhóm 1, cá được
gây miễn dịch bằng cách tiêm FKC vào xoang bụng với liều lượng 0,3
mL/con và ở nhóm đối chứng, cá được tiêm PBS (0,3 mL/con). Cá
tiêm FKC và cá đối chứng được nuôi dưỡng riêng biệt trong 2 bể
composite dung tích 2 m
3
với cùng điều kiện bể nuôi (25 - 30‰, 28°C
 2°C) và chế độ chăm sóc như nhau. Sau 4 tuần tất cả cá thí nghiệm
được tiêm nhắc lại giống như lần tiêm đầu tiên.
Việc công cường độc để xác định hiệu quả bảo vệ của vi khuẩn
bất hoạt được tiến hành ở ngày thứ 60 sau khi gây miễn dịch cho cá.
Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm
30 cá chẽm v
à được lặp lại 2 lần.
Nghiệm thức 1: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10
7

CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đối chứng.
Nghiệm thức 2: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10
8

CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đối chứng.
Nghiệm thức 3: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10
7

CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch.
Nghiệm thức 4: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10
8

CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch.
Hiệu quả bảo vệ của FKC được đánh giá dựa trên hệ số bảo vệ
tương đối (RPP). Giá trị RPP được tính theo công thức:
Tỉ lệ chết tích lũy ở cá tiêm FKC
RPP = 1 - x 100 (%)
Tỉ lệ cá chết tích lũy ở cá tiêm nước muối sinh lý
2.4.5 Sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm
Cá chẽm mới nở được thu mẫu từ các bể ương nuôi cá bột theo
định kỳ 12h một lần cho đến khi cá đạt 40 ngày tuổi. Sử dụng phương
pháp mô học để quan sát sự hình thành và phát triển của tuyến ức
tương ứng với tuổi cá.
8

2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu thu thập từ các thí nghiệm được xử lý thống kê
dựa trên phần mềm SPSS 19.0 và microsoft excel 2003.
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM
3.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa
3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại
Khánh Hòa
Kết quả phân tích 104 đàn cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa đã khẳng

định sự có mặt của vi khuẩn S. iniae ở cá chẽm tại các vùng nuôi cá
trọng điểm của Khánh Hòa.
















9

Ngoài 2 đàn cá chẽm nuôi ở Cam Ranh, tỉ lệ cá chết hàng ngày
trong giai đoạn mắc nhiễm S. iniae biến động trong khoảng 0,1–0,3%
lượng cá nuôi (bảng 3.1). Biểu hiện bệnh lý của những cá chẽm nuôi

mắc nhiễm S. iniae thường gặp là hiện tượng xuất huyết dưới da ở
vùng miệng, nắp mang, hậu môn hoặc ở thân cá, mắt cá mờ đục hoặc
lồi ra bên ngoài (hình 3.1a, 3.1b). Một số cá mắc nhiễm S. iniae còn
biểu hiện dấu h
iệu sưng thận hoặc xuất huyết ở gan (hình 3.1c, 3.1d).












3.1.1
.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập
Các chủng vi khuẩn phân lập được đều là liên cầu khuẩn Gram
dương, dung huyết anpha hoặc beta, đường kính của khuẩn lạc, sau 24
- 48 giờ nuôi cấy trên môi trường BA, nhỏ hơn 1mm (hình 3.2).





10

Kết quả xác định các đặc điểm sinh hóa của những chủng vi

khuẩn này bằng API 20STREP cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn
phân lập được đều là S. iniae. Cả 8 chủng đều có độ tương đồng di
truyền 99-100% với trình tự của các chủng S. iniae đã được công bố
trên NCBI với độ dài của đoạn gen được so sánh từ 405 – 478 bp.
Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm nuôi tại
Khánh Hòa so với chủng chuẩn tham chiếu S. iniae ATCC 29178 (1: VN091211R; 2:
CR091016P; 3: NH081107P; 4: NH081011P; 5: VN091208R; 6: CR091122P; 7: NT090612C
và 8: CR090722P)



















12345678ATCC
Phân lập từ Cá chẽ
m

Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá chẽ
m
Cá heo
Nhuộm Gram +++++++++
Hình dạng tế bào Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci
Sinh Catalase
Sinh Oxidase
Voges Proskauer
Haemolysis (5% sheep RBC) α/βα/ββ β α/βα/ββ β β
Phát triển trên/trong môi trường
Brain Heart Infusion Agar +++++++++
Tryptic Soy Agar +++++++++
Tryptic Soy Broth +++++++++
Blood agar +++++++++
Phát triển ở
10oC
27oC +++++++++
35oC +++++++++

NaCl 6.5%
Hippurate (HIP)
Esculin (ESC) +++++++++
Pyrrolidonyl acrylamidase +++++++++
α-Galactosidase (α-GAL)
β-Glucuronidase (β-GUR)
β-Galactosidase (β-GAL)
Alkalin Phosphatase (PAL)
Leucine Aminopeptidase (LA
P
+++++++++
L-arginie (ADH) ++ +++
D-ribose (RIB) +++++++++
L-arabinose (ARA)
D-manitol (MAN)
+++++++++
D-sorbitol (SOR)
D-lactose (Tortoli et al., )

D-trehalose (Sarabhai et al.,) ++ ++
Inulin (Shapiro et al., )

D-raffinose (Ton-That et al.,)
Starch (2) (AMD)
++- - ++- - +
Glycogen (GLYG)
Đặc điểm
Các chủng phân lập tại Khánh Hòa so với chủng chuẩn ATCC 29178

3.1.2

Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh
Cá thí nghiệm bắt đầu chết từ 2-3 ngày sau khi tiêm S. iniae vào
11

xoang bụng. Số lượng cá chết tăng mạnh vào ngày thứ 5 sau đó giảm
dần, đến ngày thứ 10 thì dừng hẳn. Dấu hiệu bệnh lý của cá thí
nghiệm thể hiện tương tự như cá nhiễm S. iniae ở ngoài tự nhiên. Kết
quả phân lập vi khuẩn từ cá thí nghiệm đã thu được vi khuẩn S. iniae
thuần khiết ở não, gan và thận cá. Không có bất kì hiện tượng chết nào
xảy ra ở các nghiệm t
hức đối chứng (hình 3.3).

0
20
40
60
80
100
120
012345678910
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ lệ chết tích lũy (
%
đối chứng
2,52x10^2 CFU/mL
2,52x10^3 CFU/mL
2,52x10^4 CFU/mL
2,52x10^5 CFU/mL
2,52x10^6 CFU/mL
2,52x10^7 CFU/mL

b




0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1234567891011
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ lệ chết tích lũy (%
đối chứng
10^2 CFU/mL
10^3 CFU/mL
10^4 CFU/mL
10^5 CFU/mL
10^6 CFU/mL
10^7 CFU/mL
a
0
10
20

30
40
50
60
70
80
90
100
012345678910
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ lệ chết tích lũy (%
đối chứng
4,86x10^2 CFU/mL
4,86x10^3 CFU/mL
4,86x10^4 CFU/mL
4,86x10^5 CFU/mL
4,86x10^6 CFU/mL
4,86x10^7 CFU/mL
c





Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S. iniae vào xoang
bụng với các nồng độ khác nhau. (a: chủng VN091211R; b: chủng NH081107P và c: chủng
CR090722P)
Liều gây chết 50% (LD50) khi tiêm vi khuẩn VN091211R,
CR090722P và NH081107P vào xoang bụng của cá chẽm kích thước
16 ± 2 g

được xác định lần lượt là 10
4,8
, 10
5,8
và 10
5,6
CFU (hình 3.4).






0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
123456789
log10 của nồng độ VK VN091211R
Tỉ lệ chết tích lũy (%)
0
10
20

30
40
50
60
70
80
90
100
123456789
log10 của nồng độ VK NH081107P
Tỉ lệ chết tích lũy (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
12345678910
log10 của nồng độ VK CR090722P
T ỉ lệ chết tích lũ y (%)
Hình 3.
4 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S. iniae tiêm vào xoang bụng và tỉ lệ chết tích lũy
của các nhóm cá chẽm thí nghiệm
12

3.1.3 Xác định độ nhạy của S. iniae với các loại kháng sinh
Các chủng S. iniae ph
ân lập được nhạy cảm với norfloxacine,
ciproffloxacin, sulphamethoxazol/trimethoprim, ampicillin,
erythromycin, doxycycline và amoxicyclin. Tuy nhiên chúng cũng có
khả năng kháng lại oxytetracycline, gentamycin, cephalexin và
streptomycin (bảng 3.3).












3.1.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn S. iniae vào cá chẽm
Kết quả gây nhiễm vi khuẩn S. iniae cho cá chẽm bằng phương
pháp ngâm cho thấy mang cá là nơi xuất hiện vi khuẩn lần đầu tiên
(bả
ng 3.4).

13

Sau 6 giờ thí nghiệm, có thể phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn S.
iniae ở tơ sơ cấp (hình 3.5A). Trong trường hợp nhiễm nặng, vi khuẩn
S. iniae còn được phát hiện ở tơ mang thứ cấp và ở độ phóng đại lớn
có thể dễ dàng nhận thấy sự xâm nhập của vi khuẩn S. iniae vào xoang
tĩnh mạch (hình 3.5B).
12 giờ sau khi cảm nhiễm, vi khuẩn S. iniae đã xuất hiện ở thận và

lách với mật độ cao. Lúc đầu, vi khuẩn chỉ được phát hiện ở mô kẽ
quanh ống thận (hình 3.6A). Ở những mẫu thận nhiễm vi khuẩn S.
iniae với mật độ cao, vi khuẩn tấn công vào bên trong ống thận, phá
hủy mô tạo máu, gây hoại tử và để lại những thương tổn nặng nề cho
tổ chức thận (hình 3.6B). Sau khi gây nhiễm 24h, vi khuẩn đã hiện
diện ở gan,
não và mắt (hình 3.7).

F
E
D
B
C
A

14

Mặt khác, sự xuất hiện của vi khuẩn S. iniae ở các mô như ruột,
mắt, não và gan chỉ được phát hiện sau khi thận và lách bị nhiễm rất
nặng. Điều này cho thấy vi khuẩn S. iniae xâm nhập vào cơ thể cá
chẽm thông qua mang và gây cảm nhiễm hệ thống.
3.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn gây
bệnh đã phân lập
Huyết thanh t
hu được từ cá chẽm sau khi được gây miễn dịch bởi
FKC của vi khuẩn VN09
1211R và NT090612C có khả năng ngưng
kết với chính chủng vi khuẩn nguyên liệu cao hơn so với hai chủng
còn lại. Tuy nhiên, khả năng ngưng kết chéo của huyết thanh thu được
từ các cá chẽm được
gây miễn dịch bằng
FKC của vi khuẩn
VN091211R đối với các
vi khuẩn khác cao hơn
so với huyết thanh thu
từ cá chẽm được kích
thích bằng FKC của vi

khuẩn NT090612C
(hình 3.8). Điều đó cho thấy trong 4 chủng S. ini
ae đã chọn, việc sử
dụng vi khuẩn S. iniae VN091211R làm nguyên liệu để sản xuất
bacterin là lựa chọn tốt nhất.
3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI
KHUẨN S. iniae
3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi
khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này
3.2.1.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào
Việc tiêm F
KC làm sự gia tăng hoạt tính thực bào ở đại thực bào
15

của cá chẽm. Trong điều kiện bình thường, có khoảng 46,8% đại thực
bào tham gia thực bào và mỗi đại thực bào có khả năng bắt giữ
khoảng 2 tế bào nấm men. Sau khi tiêm FKC vào xoang bụng 12 giờ,
hoạt tính thực bào tăng lên 78,4% (hình 3.9), trong khi chỉ số thực bào
tăng lên khoảng gấp 1,5 lần (hình 3.11).









FKC
Việc bổ sung 5‰

β-glucan vào thức ăn
của cá chẽm có tác
dụng làm tăng hoạt tính
thực bào (P<0,001) ở
đại thực bào của cá

chẽm. Hoạt tính thực
bào ở đại thực bào cá
chẽm ăn thức ăn có bổ
sung 5‰ β-glucan đạt đến 79,6% trong khi ở cá đối chứng, chỉ số này
chỉ đạt 46,8%. Tuy vậy, β-glucan không làm gia tăng tác dụng kích
thích miễn dịch của vi khuẩn bất hoạt thông qua hoạt tính thực bào
của đại thực bào cá chẽm. Tác động của β-glucan lên chỉ số thực bào
không được ghi nhận tr
ong thí nghiệm này.
FKC
FKC
16

3.2.1.2 Nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm
36 giờ sau khi tiêm
vi khuẩn bất hoạt vào xoang bụng, nồng độ
lysozyme trong huyết thanh cá chẽm tăng cao hơn rõ rệt (P=0,02) và
tiếp tục tăng trong khoảng 96 giờ thí nghiệm. Ở thời điểm 96h sau khi
tiêm vi khuẩn bất hoạt, chỉ số lysozyme của huyết thanh cá đạt đến
khoảng 21 µg/mL.
FKC
Việc bổ sung β-
glucan vào t

hức ăn của
cá làm hàm lượng
lysozyme trong huyết
thanh cá thí nghiệm
cao
hơn so với cá đối chứng
(hình 3.12). β-glucan
cũng làm nâng cao tác dụng của FKC trong việc làm gia tăng nồng độ
lysozyme trong huyết thanh của cá thí nghiệm.
3.2.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm
12 giờ sau khi tiêm FKC, huyết thanh cá chẽm thí nghiệm có khả
năng ức chế thêm 26,8% vi khuẩn S. iniae so với cá đối chứng. Tỉ lệ
vi khuẩn bị ức chế bởi huyết thanh cá chẽm tăng dần theo thời gian
thí
nghiệm. Sau 96 giờ, tỉ lệ này đã đạt đến 61,7% (hình 3.13).
Tỉ lệ vi khuẩn bị ức
chế bởi huyết thanh cá
chẽm khi tiêm vi khuẩn
bất hoạt cao hơn rõ rệt
(P<0,05) nếu thức ăn
của chúng được bổ sung
β-glucan. 96 giờ sau khi
tiêm vi khuẩn bất hoạt,
17

tỉ lệ vi khuẩn bị ức chế bởi huyết thanh của cá được cho ăn thức ăn có
bổ sung β-glucan đạt đến 76,4% trong khi ở cá không cho ăn β-glucan
chỉ số này là 61,7%.
3.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S.
iniae bất hoạt bằng formalin (FKC)

3.2.2
.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong máu cá thí
nghiệm sau khi tiêm FKC
Sau khi tiêm FKC 7
ngày, 20% cá có kháng thể
kháng S. iniae ở hu
yết
thanh. Con số này tăng lên
70% vào ngày 14 và có xu
hướng giảm dần, đến ngày
28 sau khi tiêm, tỉ lệ cá
chẽm có kháng thể kháng S.
iniae ở huyết thanh chỉ còn 30% (hình 3.14). Tuy nhiên 7 ngày sau khi
tiêm nhắc lại, tất cả cá chẽm đều có kháng thể kháng S. iniae trong
huyết thanh và kháng thể này vẫn tiếp tục duy trì ở tất cả cá thí
nghiệm trong 3 tuần tiếp theo.
Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của cá chẽm đạt cực đại
vào khoảng ngày 14 sau khi gây miễn dịch và có
xu hướng giảm dần.
Sau khi được tiêm nhắc lại ở ngày thứ 28, hàm lượng kháng thể đặc
hiệu trong máu cá tăng vọt ở ngay trong tuần đầu tiên và đạt cực đại
trong máu cá vào ngày thứ 14 sau khi tiêm nhắc lại với hàm lượng
kháng thể cao hơn rõ rệt (P<0,001) so với hàm lượng kháng thể cực
đại trong đáp ứng miễn dịch sơ cấp (hình 3.15).
Dựa vào đường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ số mật độ
quang và độ
pha loãng của huyết thanh cá chẽm (hình 3.16) có thể
18

nhận thấy hàm lượng kháng thể cực đại hình thành trong đáp ứng

miễn dịch thứ phát cao gấp khoảng 8 lần so với hàm lượng kháng thể
cực đại hình thành trong đáp ứng miễn dịch sơ cấp.











3.2.2
.2 Đặc điểm protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae
Các chủng vi khuẩn phân lập tương đồng về thành phần protein
trong khoảng từ 20-31 kDa với một ít khác biệt về cường độ bắt màu

của các band (hình 3.17). Sự khác biệt này được thể hiện rõ hơn ở các
protein có khối lượng từ 35-55 kDa. Sử dụng huyết thanh của cá chẽm
đã tiêm FKC sản xuất từ vi khuẩn VN091211R trong phân tích
western blot đã xác định protein kháng nguyên chung của các chủng
phân lập có khối lượng xấp xỉ 22 và 35 kDa (hình 3.18).
Ở chủng vi khuẩn VN091211R và chủng ATCC 29178 phản ứng
miễn dịch còn thể hiện ở protein có khối lượng xấp xỉ 80 kDa trong
khi protein này không quan sát được ở cá
c chủng còn lại.

19












3.2.2
.3 Hiệu quả bảo vệ của tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) đối với
bệnh do Streptococcus iniae gây ra ở cá chẽm
i Tính vô khuẩn của chế phẩm thử nghiệm
Sau 48 giờ nuôi cấy, không phát hiện sự xuất hiện các khuẩn lạc
trên các môi trường nuôi cấy TSA. Kết quả này cho thấy, việc sử dụng
formalin với nồng độ 0,5% đảm bảo bất hoạt hóa hoàn toàn các tế bào
vi kh
uẩn S. iniae. Chế phẩm thử nghiệm này cũng không bị tạp nhiễm
bất kì vi khuẩn nào khác.
ii Tính an toàn của chế phẩm thử nghiệm đối với cá chẽm.
Việc tiêm FKC vào xoang bụng của cá chẽm thí nghiệm không
gây chết cá và không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cá thí nghiệm
đồng thời cũng không tạo những biến đổi bất thường hoặc sự hình
thành các khối u trên thành bụng hoặc phúc mạc. Vì vậy, có thể nhận
định rằng
chế phẩm thử nghiệm là an toàn đối với cá.

iii Hiệu quả bảo vệ của chế phẩm thử nghiệm đối với cá chẽm
20

Kết quả thí nghiệm cho thấy cá chết với dấu hiệu đặc trưng của
bệnh do S. iniae gây ra bắt đầu xuất hiện ở các bể nuôi cá đối chứng
vào thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm. Số lượng cá chết tăng vọt ở
các bể này tăng nhanh trong khoảng thời gian từ 48 – 72h sau khi tiêm
vi khuẩn, và đạt giá trị tỷ lệ
chết cộng dồn ở thời điểm
kết thúc thí nghiệm lần lượt
là 83,33%
và 60% tương
ứng với với mật độ vi khuẩn
công cường độc là 10
8

CFU/mL và 10
7
CFU/mL.
Trong khi đó ở các nhóm cá
được tiêm FKC con số này
lần lượt là 20% và 6,66%
(hình 3.19).
Hệ số bảo vệ tương đối ở các nhóm cá thí nghiệm tương ứng với
cường độ công cường độc là 89% (10
7
CFU/mL) và 76% (10
8

CFU/mL).

3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC
Kết quả kiểm tra tiêu bản mô của tất cả cá chẽm dưới 10 ngày
tuổi không cho thấy sự xuất hiện của tuyến ức. Mầm tuyến ức của cá
chẽm bắt đầu hình thành từ ngày thứ 10 sau khi nở. Lát cắt dọc theo
hướng lưng bụng cho thấy sự hiện diện của tuyến ức ở biểu mô vùng
hầu, sát với x
oang thính giác và gần với tiền thận của cá (Hình 3.20).
Ở cá từ 12 ngày tuổi trở đi, tuyến ức đã nhô ra khỏi lớp biểu mô
vùng hầu và có dạng hình khối dạng elip (hình 3.21a; 3.21b). Sự phân
vùng tuyến ức được quan sát ở ngày 14 với phần vỏ là nơi sự tập trung
dày đặc của các tế bào lympho bắt màu tím sậm của hematoxylin
21

trong khi ở phần tủy mật độ tế bào lympho giảm rõ rệt để lộ nhiều
khoảng không và tế bào biểu mô (hình 3.21c, 3.21d).

Từ ngày
thứ 18 trở đi, tuyến ức có xu hướng phát triển kéo dài ra
và đến ngày 30 sau khi nở, tuyến ức của cá chẽm có dạng đặc trưng
của loài (Hình 3.22).
22











KẾT L
UẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Trong thời gian từ 11/2008 – 12/2009, có 8 chủng vi khuẩn
Streptococcus iniae đã được phân lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh
Hòa. Các chủng vi khuẩn này đều có độc tính khá cao đối với cá

chẽm với liều gây chết 50% (LD
50
) biến thiên từ10
4,8
đến 10
5,8

CFU/cá. Trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm cá chẽm bằng
phương pháp ngâm, vi khuẩn S. iniae tiếp cận cơ thể cá từ mang, đi
vào xoang tĩnh mạch rồi theo máu đến thận, lách, sau đó theo máu
lan tỏa đến các cơ quan khác và gây nhiễm toàn thân. Thành phần
protein của 8 chủng S. iniae phân lập được tương đồng nhau nhưng ở
mỗi chủng vẫn có một số khác biệt, đặc biệt là ở các protein có khối
lượng tron
g khoảng 35 - 55 kDa.
2. Các thông số đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như chỉ số thực
bào, hoạt tính thực bào của đại thực bào, hoạt tính lysozyme và khả
năng ức chế vi khuẩn của huyết thanh cá chẽm tăng sau khi cá được
tiêm vi khuẩn S. iniae đã được bất hoạt hóa bằng formalin vào xoang
23