nghiên cứu phát hiện đột biến gen atp7b gây bệnh wilson

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
VŨ VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2008 - 2012
Người hướng dẫn:
TS. TRẦN VÂN KHÁNH
Hà Nội - 2012
1
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận
được sự giúp đỡ vô cùng tận tình của các thầy, các cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu
sắc tới TS. Trần Vân Khánh – Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa Kỹ
thuật Y học – Trường Đại học Y Hà Nội, người cô đã hết lòng dạy bảo, tận
tình hướng dẫn em những bước đầu tiên trên con đường học tập và nghiên
cứu khoa học.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Tạ Thành Văn, PGS.
TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy người cô đã giúp đỡ, động viên em
trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thực
hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại Học
Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em
thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn Ths. Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiên
cứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thành
khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.

Cuối cùng, con thực sự biết ơn bố mẹ, mọi người thân yêu trong gia đình
đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăn
trong học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại
học Y Hà Nội.
Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2012
Vũ Văn Thành
2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A: Adenine T: Thymine
G: Guanine C: Cytosine
NCBI: National Center for Biotechnology Information
Ala: alanine (A) Gly: glycine (G) Pro: proline (P)
Arg: arginine (R ) His: Histidine (H) Ser: serine (S)
Asn: asparagine (N) Ile: isoleucine (I) Stop: mã kết thúc
Asp:acid aspartic (D) Leu: leucine (L) Thr: threonine (T)
Cys: cysteine (C) Lys: lysine (K) Trp: tryptophan (W)
Gln: glutamine (Q) Met: methionine (M) Tyr: tyrorine (Y)
Glu: acid glutamic (E) Phe: phenylalanine (F) Val: valine (V)
Bn : Bệnh nhân
Bp : Basepair Kb: Kilobase
ATP7B : ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide
3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng (Cu), bệnh được mô tả
đầu tiên bởi Kinnier Wilson vào năm 1912, là một bệnh lý liên quan đến tổn
thương gen. Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể ( NST) thường,
trong đó, đồng tích tụ ở một số cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan và não
gây nhiều biến chứng phức tạp. Ước tính trên thế giới, tần suất mắc bệnh là
1/30.000 và 1/100.000 người [9].
Bệnh Wilson do thiếu hụt enzyme typ P- ATPase được mã hóa bởi gen

ATP7B. Gen ATP7B nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 13 (13q14.3) gồm 21
exon, với chiều dài khoảng 80 kb và mã hóa cho chuỗi protein gồm 1465 axit
amin. Enzym P-type ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế bào.
Sự thiếu hụt hoặc giảm chức năng protein của ATP7B dẫn đến giảm sự bài tiết
Cu từ gan vào mật, khiến cho Cu tích lũy trong gan và tạo thành chất độc cho
gan. Khi lượng đồng trong gan tăng quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuần
hoàn tới các cơ quan đích như : não, mắt, thận gây ra các tổn thương cho cơ
quan đích.
Chẩn đoán bệnh có thể dựa trên các triệu chứng lâm sàng như dấu hiệu về
gan, não và vòng Kayser-Fleischer. Ngoài ra, có thể sử dụng các xét nghiệm
như đo nồng độ đồng trong nước tiểu 24h, hàm lượng ceruloplasmin huyết
thanh, nồng độ Cu trong gan tăng) [35, 12]. Tuy vậy, nếu chỉ dựa các xét
nghiệm hóa sinh thì rất khó để chẩn đoán chính xác cũng như khó có thể phân
biệt giữa người bình thường và người mang gen. Vì vậy, phân tích DNA là
một bước cần thiết để xác định người mắc bệnh [35].
Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được tìm thấy trên bệnh nhân
mắc bệnh Wilson [44]. Tuy nhiên, mỗi quốc gia cũng như mỗi chủng tộc
người khác nhau có các loại đột biến khác nhau . Đột biến p.His1069Glu là
đột biến thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng chiếm khoảng 37%
4
đến 63% tổng số đột biến. Trong khi đó, ở các bệnh nhân người Trung Quốc
đột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9]
Từ những ý nghĩa trên đề tài : “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen
ATP7B gây bệnh Wilson” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson.
5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh Wilson trên thế giới

Vào năm 1883, một nhà thần kinh học người Đức Dr. Carl Westphal có
một báo cáo và đặt tên bệnh này là "pseudosclerosis".Nhà thần kinh học
người Anh tên là William Gowers(1888) và bác sĩ Adolph Strumpell mô tả
bệnh "pseudosclerosis" là bệnh xơ gan[26].
Bệnh mang tên của bác sĩ người Anh Samuel Alexander Kinnier Wilson
(1878-1937) một nhà thần kinh học , ông đã lần đầu tiên mô tả những thay
đổi bệnh lý trong gan và não vào năm 1912, sau đó Strpell nhận thấy sự tích
lũy sớm của đồng trong não và gan của các bệnh nhân này[36].
Năm 1948, Martins tìm thấy lượng đồng trong nước tiểu của bệnh nhân
Wilson tăng rất cao so với người bình thường [30].
Cùng năm đó, Cumings cùng nhóm nghiên cứu đã điều trị hiệu quả bệnh
Wilson lần đầu tiên với việc tiêm British anti- Lewisite ( BAL) vào năm
1951[14].
Năm 1952, Scheinberg và Gitlin phát hiện được enzym ferroxidase trong
huyết thanh gắn với đồng, được gọi là ceruloplasmin. Hoạt tính của enzym
này giảm trong huyết tương ở các bệnh nhân Wilson [25].
Bắt đầu năm 1956, một số thuốc được đưa vào điều trị. Nhà thần kinh
học người Anh John Walshe đã phát hiện ra penicillamine [41]. Vào năm 1982,
Walshe cũng giới thiệu trentine và người đầu tiên phát hiện tetrathiomolybdate
sử dụng cho lâm sàng [42]. Bác sĩ Schouwin và Hoogemraad sử dụng kẽm
acetate trong điều trị lần đầu tiên vào năm 1961,sau đó kẽm acetate được
Brewer và các đồng nghiệp tại đại học Michigan dùng để điều trị cho bệnh
nhân Wilson một cách phổ biến[10].
Cơ sở di truyền của bệnh Wilson và liên kết ATP7B đột biến đã được làm
sáng tỏ trong những năm 1980 và 1990 bởi một số nhóm nghiên cứu[38].
6
Tới năm 1994, Konstaintin petrukhin cùng nhóm nghiên cứu tại đại học
Columbia đã đưa ra bản đồ gen, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B[34].
Danadevi Kuppala cùng các đồng nghiệp đã phát hiện năm đột biến trên
gen ATP7B của các bệnh nhân Mỹ năm 2009, báo cáo cho thấy đột biến trên

exon 14 và exon 18 chiếm tới 84% tổng số đột biến và họ cũng chỉ ra rằng đột
biến H1069Q là đột biến phổ biến nhất được tìm thấy[16]
Các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng đưa ra một báo cáo về việc phát hiện
đột biến trên gen ATP7B một năm sau đó[37].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Xin- Hua Li, Yui Lu, Qing- Chun Fu đã
phát hiện thêm 14 đột biến mới trong các bệnh nhân người Trung Quốc[44].
1.1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở Việt Nam
Lần đầu tiên vào năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã báo cáo 8 trường
hợp bệnh Wilson tại hội nghị Thần kinh học quốc tế lần thứ IX tại Mỹ [1].
Sau đó vào những năm 2002-2005, Thái Duy Thành và cộng sự đã có
công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 29 trường
hợp bệnh nhân Wilson ở khoa Thần kinh - bệnh viện Bạch Mai [8].
Tiếp theo Quách Nguyễn Thu Thủy và cộng sự công bố nghiên cứu về
đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai
đoạn 2001 - 2006 [5]
Vào năm 2010, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Phương
Mai, W. Yoo cùng nhóm nghiên cứu đã phát hiện 4 loại đột biến điểm trên
gen ATP7B bằng phương pháp phân tích đột biến tại bệnh viện nhi trung
ương[6].
Năm 2011, Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường ĐH Y Hà Nội
tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson[7].
Nhìn chung tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở nước ta còn chưa nhiều.
Mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng và cận lâm
sàng[2,3,4].
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH WILON
2.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson
7
Bệnh Wilson có nhiều biểu hiện lâm sàng phức tạp, theo nghĩa rộng,
bệnh nhân Wilson có thể mắc các vấn đề liên quan tới thần kinh, gan, hoặc cả
hai. Trong những năm qua những tiến bộ trong việc chẩn đoán đã cho phép

đánh giá hệ thống của các cá nhân bị nghi ngờ mắc bệnh Wilson trước khi phát
triển các triệu chứng thần kinh. Bệnh nhân bị xơ gan, biểu hiện thần kinh, và vòng
Kayser-Fleischer( K-F) được dễ dàng chẩn đoán là mắc bệnh Wilson bởi vì các
bệnh nhân này có biểu hiện lâm sàng giống mô tả[30, 35]. Các bệnh nhân bị suy
gan, người từ 5-40 tuổi có nồng độ ceruloplasmin trong huyết thanh giảm, xuất
hiện vòng Kayser-Fleischer được coi là bệnh Wilson cổ điển[35]. Đặc điểm lâm
sàng của bệnh Wilson được tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 1.1. Các đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson[35]
Đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson
Gan
• không có triệu chứng gan to
• Lách to
• Nồng độ AST, ALT trong huyết thanh tăng cao liên tục
• Gan nhiễm mỡ
• Viêm gan cấp tính
• Viêm gan tự miễn
• Xơ gan: có bù hoặc mất bù
• Suy gan cấp tính
Thần kinh
• Chảy nước dãi
• Đau nửa đầu đau đầu
• Mất ngủ
• Động kinh
Tâm thần
• Trầm cảm
• Rối loạn hành vi
• Tính cách thay đổi
• Rối loạn tâm thần
8
Các hệ

thống khác
• Mắt: vòng Kayser-Fleischer, đục thủy tinh thể hướng dương
• Thận bất thường: sỏi thận
• Xương bất thường: loãng xương sớm,viêm khớp
• Viêm tụy
• Kinh nguyệt bất thường, vô sinh, sẩy thai lặp đi lặp lại
1.1.1.1. Bệnh về gan
Các loại bệnh về gan có thể là rất khác nhau, từ không có triệu chứng tới
bất thường chỉ số hóa sinh trong suy gan cấp[27]. Trẻ em có thể hoàn toàn
không có triệu chứng về bệnh gan hoặc một số bệnh nhân lại có triệu chứng
lâm sàng giống viêm gan virus. Bệnh Wilson có thể được mô tả như bệnh suy
gan kịch phát, rối loạn hệ thống đông máu và tan huyết cùng với xét nghiệm
Coomb âm tính, suy thận, và tăng đáng kể nồng độ đồng trong huyết thanh và
nước tiểu. Những hình ảnh lâm sàng của bệnh Wilson có thể tương tự như
bệnh viêm gan mãn tính, trong đó nhấn mạnh sự cần thiết cần phải sàng lọc
bệnh nhân cho bệnh Wilson. Ở những bệnh nhân mắc bệnh gan, các vấn đề
về thần kinh( nếu xảy ra) thường xảy ra sau 2-5 năm [9, 25].
Bệnh nhân có biểu hiện xơ gan đặc hiệu như lách to, huyết áp cao và cổ
chướng. Tất cả bệnh nhân trẻ bị viêm gan mạn tính không rõ nguyên nhân , có
hoặc không có xơ gan, cần được sàng lọc cho bệnh Wilson[28,35].
1.1.1.2. Những thay đổi về mắt
Vòng KF rõ ràng nhất tại vùng ngoại biên của giác mạc, vòng KF xuất
hiện do sự lắng đọng đồng bên trong giác mạc trong màng Descemet. Kiểm
tra bằng đèn khe dùng để xác định có hay không vòng KF. Vòng KF xuất hiện
ở hầu hết bệnh nhân mắc bệnh Wilson, tuy nhiên nó không hoàn toàn là đặc
hiệu, bởi vì vòng KF xuất hiện trong một số trường hợp bệnh lý khác như
gan mãn tính, ứ mật, xơ gan[9]
9
Hình 1.1. Vòng KF ở vùng ngoại biên giác mạc[24]
1.1.1.3. Triệu chứng về thần kinh

Những triệu chứng về thần kinh thường xuất hiện sau dấu hiệu về bệnh
gan. Một số dấu hiệu nhỏ có thể xuất hiện ở những bệnh nhân nhỏ tuổi bao
gồm các thay đổi trong hành vi, sự suy giảm về việc học hoặc không có khả
năng hoạt động cho mỗi hình thức đòi hỏi phối hợp tốt cả tay và mắt, trước
khi có các triệu về thần kinh điển hình như run, rối loạn nhận thức, chảy nước
dãi[16, 27].
1.1.1.4. Các dấu hiệu lâm sàng khác
Ngoài những bệnh lý về gan, thần kinh, mắt thì những bệnh nhân Wilson
còn có thể có những thay đổi bệnh lý về xương : nhuyễn xương, loãng xương,
gãy xương tự phát, bệnh còi xương ở người lớn [9,12].
10
1.2.2. Chẩn đoán bệnh Wilson.
Chẩn đoán bệnh Wilson thường kết hợp giữa các triệu chứng lâm sàng
đặc hiệu với các xét nghiệm sinh hóa.
Aminotransferase: Bệnh nhân mắc bệnh Wilson thường có nồng độ enzym
aminotransferase huyết thanh bất thường ngoại trừ ở 1 số trẻ nhỏ tuổi. Trong
một số trường hợp, mức độ tăng hoạt động của enzym aminotransferase có
thể là nhẹ và không phản ánh mức độ nghiêm trọng của bệnh gan[9,33].
Celuroplasmin : Protein được tổng hợp chủ yếu ở gan và là một chất phản
ứng trong giai đoạn cấp tính của bệnh, celuroplasmin là 1 protein mang chủ
yếu của đồng trong máu( chiếm 90% lượng đồng lưu hành trong người bình
thường). Nồng độ celuroplasmin huyết thanh thường cao trong các trường
hợp viêm cấp tính hoặc phụ nữ mang thai, hoặc dùng thuốc tránh thai. Bệnh
nhân Wilson có nồng độ celuroplasmin huyết thanh giảm, tuy nhiên trong 1
số trường hợp bệnh lý khác như mất protein niệu thì nồng độ enzym này cũng
giảm đáng kể[9,39].
Xét nghiệm nước tiểu 24h: Lượng đồng bài tiết qua nước tiểu 24h có thể hữu
ích trong việc chẩn đoán bệnh Wilson và theo dõi điều trị[9].
Các khuyến nghị trong chẩn đoán bệnh Wilson[35]:
• Một nồng độ celuroplasmin rất thấp trong huyết thanh( <50 mg/L

hay 5mg/dL) nên được xem là dấu hiệu mạnh mẽ cho việc chẩn
đoán bệnh Wilson.
• Nên xét nghiệm nước tiểu 24h trong tất cả các bệnh nhân đang
nghi nghờ mắc bệnh Wilson. Lượng đồng đào thải ra
>100µg( >1.6µmol) trong các bệnh nhân có triệu chứng, nếu lượng
đồng đào thải ra >40µg( >0.6µmol) thì cần phải xác định thêm.
• Lượng đồng trong gan khô > 250µg/g là một thông tin quan trọng
trong việc chẩn đoán bệnh Wilson.
• Đánh giá thần kinh và hình ảnh X- Quang của não bộ nên được
xem xét trong tất cả các bệnh nhân thần kinh.
11
• Trong trường hợp khó khăn trong chẩn đoán bằng các dấu hiệu lâm
sàng và các chỉ số sinh hóa thì nên thực hiện phân tich toàn bộ
chuỗi gen đột biến.
1.2.3.Điều trị bệnh Wilson
Dùng thuốc: Hiện nay vẫn chưa có biện pháp can thiệp vào gen đột biến mà
các thuốc dùng để điều trị bệnh Wilson nhằm giúp tăng đào thải đồng ra khỏi
cơ thể hoặc dùng để giảm hấp thu đồng. Hay nói cách khác, những thuốc này(
penicillamine, trientine, kẽm acetate ) chỉ có tác dụng lập lại trạng thái cân
bằng của đồng trong mô[11,42].
Chế độ ăn: Nên tránh ăn các loại thực phẩm như scola, gan, các loại hạt, nấm
và các loại tôm, cua ,sò ,hến [13,35]
Ghép gan: việc ghép gan chỉ có hiệu quả với những bệnh nhân Wilson có biểu
hiện suy gan cấp tính và xơ gan mất bù[9].
1.3.CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH WILSON
1.3.1. Cấu trúc, chức năng của protein ATP7B
Bệnh Wilson là do đột biến gen ATP7B. Gen ATP7B mã hóa cho protein
ATP7B là một thành viên trong nhóm ATPase P- một nhóm các protein vận
chuyển kim loại vào và ra khỏi tế bào bằng cách sử dụng năng lượng được
lưu trữ trong các phân tử adenosine triphosphate(ATP)[32,34]. ATP7B được

tìm thấy chủ yếu ở gan, với số lượng nhỏ trong thận và não. Nó đóng một vai
trò trong việc vận chuyển đồng từ gan đến các bộ phận khác của cơ thể. Đồng
là một phần quan trọng của một số enzym duy trì chức năng tế bào bình
thường. ATP7B cũng rất quan trọng cho việc loại bỏ đồng thừa khỏi cơ thể.
Trong các tế bào gan, ATP7B được tìm thấy trong bộ máy Golgi, sửa đổi
các enzyme mới được sản xuất và các protein khác. Ở đây, ATP7B là nguồn
cung cấp đồng cho một protein gọi là ceruloplasmin, vận chuyển đồng đến
các bộ phận khác của cơ thể qua máu. Nếu nồng độ đồng trong gan quá cao,
12
ATP7B sẽ vận chuyển đồng rời khỏi bộ máy Golgi và chuyển tới mật để đào
thải[32].
Hình 1.2. Chu trình vận chuyển đồng của protein ATP7B[32].
Protein ATP7B mang đầy đủ các đặc điểm đặc trưng cho một protein
thuộc họ protein P - type APTase với 5 vùng chức năng chính như: Vùng
MBSs, vùng N, vùng P, vùng A và vùng xuyên màng.
13
Hình 1.3. Cấu trúc của protein ATP7B[23].
Vùng MBSs: Là vị trí bám cho các nguyên tử đồng.Gồm 6 MBSs, mỗi
một MBSs gồm các trình tự MxCxxC, 1 MBSs sẽ gắn với một nguyên tử
đồng. Việc phân tích cấu trúc riêng biệt của MBSs trong ATP7B đã cho thấy
một cấu trúc nếp gấp βαββαβ được bảo tồn. Trình tự và cấu trúc của các
MBSs này được bảo tồn cao trong quá tiến hóa, ngay cả trong các protein
khác như ATOX1 liên kết đồng( Cu-chaperon ATOX1). Các MBSs trong
ATP7B có các chức năng quan trọng như: chuyển vị đồng, hợp nhất đồng
trong phức hợp enzym, hoạt hóa ATPase, tương tác giữa protein với protein.
Tuy nhiên, ATP7B tương đồng trên vi khuẩn và nấm men cho thấy chỉ chứa
một hoặc hai MBSs. Điều này cho thấy không phải tất cả 6 MBSs đều quan
trọng[32].
14
Vùng xuyên màng: Nằm trên 8 exon: từ exon 6- exon 12 và exon 19,

exon 20. Nhìn chung, typ P- ATPase có những vị trí bám cho các ion trong
vùng xuyên màng để tạo điều kiện thuận lợi cho các ion di chuyển qua màng.
Trên vị trí xuyên màng số 6 gồm 1 motif CPC được bảo tồn đặc hiệu cho
protein vận chuyển kim loại nặng . Peptid chứa các motif này được chỉ ra rằng
là có gắn với đồng , điều đó cho thấy vậy motif CPC thực sự tham gia vận
chuyển Cu qua màng tế bào[32].
Vùng N: Là vùng bám ATP, các vị trí liên kết chính xác với ATP trong
vùng N chưa được xác định, nhưng phân tích cấu trúc vùng N của ATP7B
thấy có liên quan đến một số đột biến bao gồm H1069, G1099, G1101, I1102,
G1149 và N1150. Đặc biệt, H1069, G1099, G1101 và I1102 đều là những vị
trí đột biến được tìm thấy trên bệnh nhân Wilson. Và đột biến H1069Q là đột
biến điển hình gây bệnh Wilson ở quần thể người Châu Âu và Bắc Mỹ. Điều
này phù hợp với vị trí liên kết ATP, nghĩa là, đột biến H1069Q đồng nghĩa
với việc mất vị trí gắn của ATP vào ATP7B. Tuy nhiên, trong vùng N, hơn 40
đột biến gây bệnh Wilson đã được tìm thấy, điều này chỉ ra rằng có thể có
nhiều vị trí tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình liên kết với ATP.
Điều này được khẳng định rõ hơn khi đột biến E1064A gây ra sự thiếu hụt
hoàn toàn sự liên kết của ATP vào vùng N trên ATP7B[32].
Vùng P: Có chức năng phosphor hóa. Việc phân tích mô hình thực
nghiệm phân tử cho thấy rằng ATP gắn vào vùng N của protein ATP7B tạo
ra thay đổi về mặt hình thái làm cho vị trí gắn ATP trong vùng N gần với
vùng P hơn. Điều này có thể thúc đẩy việc gắn ATP và phosphoryl hóa của
vùng P. Việc gắn ATP trong vùng P của ATP7B xảy ra trong vùng lân cận
của axit amin aspartic vị trí 1027. Vị trí này là một phần của motif bảo tồn
cao DKTG(D: axit aspartic, K: Lysin, T: Threonin, G: Glycine) ở typ P-
ATPase. Và là vị trí phosphor hóa bằng γ-phosphate của ATP[32].
15
Vùng A: Có chức năng khử phosphoryl hóa. Sự khử phospho của axit
aspartic được thực hiện nhờ phản ứng trung gian của enzyme phosphatase nội
bào, trong đó vùng A đóng 1 vai trò then chốt[32].

1.3.2. Vị trí, cấu trúc của gen ATP7B
1.1.1.5. Vị trí, kích thước của gen ATP7B
Gen ATP7B nằm ở vị trí 13q14.3 trên cánh dài NST 13[21].
Vị trí phân tử trên NST 13 là: Từ vị trí 52.505.804 bp đến 52.585.629
bp[22].
Gen có kích thước vào khoảng 80 kb[44].
Hình 1.4. Vị trí của gen ATP7B[22]
1.1.1.6. Cấu trúc của gen ATP7B
Cấu trúc của gen ATP7B như sau:
Vùng khởi động: Điều khiển hoạt động của gen để sản xuất ra các protein
đặc hiệu.
Exon: Gen ATP7B có 21 exon, đây chính là vùng gen mã hóa để phiên
mã thành mRNA, chứa đựng thông tin di truyền để tổng hợp nên protein
ATP7B.
Intron: Đây là vùng không mã hóa của gen, nằm xen kẽ giữa những exon,
vùng intron đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoàn thiện mRNA
16
Hình 1.5. Cấu trúc của gen ATP7B[15].
1.3.2. Liên hệ giữa đột biến gen ATP7B và chức năng của protein
Theo các báo cáo nghiên cứu thì hiện nay có khoảng hơn 500 đột biến
được tìm trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson, bao gồm các đột biến thay thế,
mất đoạn, thêm hoặc bớt nucleotid gây lệch khung dịch mã protein [44].
Trong đó, đột biến dạng thay thế nucleotit chiếm khoảng 79.5% các dạng đột
biến gây bệnh( Hình 1.6). Ảnh hưởng của các đột biến có thể làm giảm thậm
chí làm mất hoàn toàn khả năng sinh tổng hợp protein của gen ATP7B[32]
( Bảng 2).
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của đột biến tới chức năng và điều hòa của
ATP7B[9]
Ảnh hưởng của đột biến tới chức năng
và điều hòa của ATP7B

Đột
biến
Sự hoạt động xúc tác ATPase Tương tác Protein-Protein
G85V
L4925
A604P
E1064A
H1069Q
R1115H
N1270S
R778L
R778Q
Không gắn ATP
Không gắn ATP
Không thủy phân ATP
Tăng nhẹ gắn ATP
Giảm thủy phân ATP
Giảm tương tác với ATOX1
Tăng tương tác với ATOX1
Tăng tương tác với ATOX1
17
Trong chu trình vận chuyển đồng, ảnh hưởng của đồng tới việc hình
thành trung gian acylphosphat đã được chứng minh, điều này cho thấy 6
MBSs có vai trò điều tiết sự hình thành trung gian acylphosphat. Tuy nhiên,
đột biến của vùng MBSs này chỉ ảnh hưởng nhẹ đến tốc độ và mức độ
phosphoryl hóa. Các đột biến tập trung chủ yếu ở vùng N và vùng xuyên
màng. Có rất nhiều đột biến xảy ra ở vùng N, trong số chúng đột biến
H1069Q là đột biến điển hình nhất[18,31]. Khi đột biến này xảy ra đồng
nghĩa với việc mất đi vị trí gắn của ATP vào ATP7B. Theo một nghiên cứu
của Kuppala cho thấy đột biến H1069Q là phổ biến nhất trong các bệnh nhân

Wilson người Mỹ( chiếm tới 40.3 % tổng số đột biến) [16], theo một báo các
khác, đột biến này chiếm tới 37-63% tổng số đột biến ở người da trắng[9].
Đây là đột biến dạng thay thế Histidin bằng Glutamin. Bằng việc sử dụng kỹ
thuật giải trình tự gen ATP7B, các nhóm nghiên cứu của Tanzi, Caca, Ferenci
đã phát hiện ra dạng đột biến H1069Q (exon 14) phổ biến nhất trên bệnh nhân
Wilson ở các nước Trung, Bắc và Đông Âu. Khoảng 50-80% bệnh nhân
Wilson ở các nước này có ít nhất một alen mang đột biến H1069Q. Một số
các đột biến khác như 2299insC, G710S (exon 8); 3400 delC (exon 15) và
R969Q (exon 13) chiếm tỷ lệ khoảng 10% [39]. Nghiên cứu của Loudianos và
cộng sự cho thấy đột biến mất 15 bp (-441/-427 del) nằm trong vùng promoter
gen ATP7B là dạng đột biến đặc trưng cho nhóm bệnh nhân Wilson ở quốc
đảo Sardinia thuộc vùng Địa Trung Hải [29]. Bằng việc sử dụng kỹ thuật PCR
kết hợp với dHPLC trước khi giải trình tự gen, Curtist và cộng sự năm 1999
đã cho thấy các đột biến ở exon 8, 14 và 18 chiếm đến 60% tỷ lệ các alen đột
biến ở bệnh nhân Wilson nước Anh [15].
18
Hình 1.6. Biểu đồ tỉ lệ giữa các đột biến
Tuy nhiên, đột biến này ít gặp hơn ở người châu á, thay vào đó đột biến
R778L dạng Arginine chuyển thành Leucin (CGG → CTG) lại phổ biến hơn.
Xin-Hua Li cùng nhóm nghiên cứu của mình đã tiến hành trên 68 bệnh nhân
Trung Quốc đã cho kết quả là hai đột biến phổ biến nhất là :
p.Arg778Leu(31.9%) và p.Pro992Leu(11.2%)[44]. Theo một báo cáo
từ Ấn Độ cũng đã xác nhận có cả đột biến H1069Q và R778L[9].
1.3.3. Đặc điểm di truyền của bệnh Wilson
Bệnh Wilson do thiếu enzym P-type ATPase là bệnh di truyền gen lặn
nằm trên nhiễm sắc thể thường nên tuân theo qui luật di truyền Menden.
Nếu gọi A là allen bình thường và a là allen bệnh thì AA là người bình
thường, Aa là người bình thường mang gen bệnh (dị hợp tử) và aa là người
bệnh. Các con của người bệnh với một người bình thường (aa×AA) có kiểu
hình bình thường nhưng là người ở thể dị hợp tử mang gen bệnh (Aa).

19
Bảng 1.3. Kiểu gen bố mẹ và tỉ lệ bị bệnh di truyền lặn
nhiễm sắc thể thường ở thế hệ con
Kiểu gen của bố mẹ Tỉ lệ con bị bệnh và kiểu gen
Bố hoặc mẹ Mẹ hoặc bố AA Aa Aa
AA AA 1 0 0
AA Aa ½ ½ 0
AA Aa 0 1 0
Aa Aa ¼ ½ ¼
Aa Aa 0 ½ ½
Aa Aa 0 0 1
(AA – đồng hợp tử lành, Aa – lành mang gen, aa – đồng hợp tử bệnh)
Bệnh nhân Wilson có thể mang một gen bệnh của người bố hoặc
một gen bệnh của người mẹ hoặc cả hai gen bệnh của người bố và người
mẹ. Bố, mẹ của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen dị hợp.
Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen bệnh hoặc không. Những
người mang gen bệnh đều có khả năng di truyền cho con cháu. Có một
điểm khác biệt so với nhiều bệnh di truyền khác là người mang gen dị hợp
cũng biểu hiện bệnh và thường kèm theo dạng đột biến khác[17,40].
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT
BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON
1.4.1. Phản ứng PCR
Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA.
Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn DNA mạch
đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ trợ và cần phải có các mồi
oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp.
Các bước cơ bản của phản ứng PCR được mô tả bởi hình 1.6. Mỗi chu
kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởi nhiệt độ:
+ Giai đoạn 1: Phân tử DNA được xử lý ở nhiệt độ cao để tách DNA
khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thường là 94 – 95

o
C.
20
+ Giai đoạn 2: Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi,
cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNA khuôn theo nguyên
tắc tạo cặp bổ sung. Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền
với nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi. Thường nhiệt độ
khoảng 40 -70
0
C, tùy thuộc vào kích thước và Tm của các mồi.
+ Giai đoạn 3: Tổng hợp bởi Taq polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4
nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dCTP) viết tắt là dNTP. 4 loại dNTP để kéo
dài sợi mồi, tổng hợp sợi DNA mới.
Ba giai đoạn tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR . Khi các chu kỳ
được lặp lại, các đoạn DNA vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành
khuôn cho chu kỳ sau. Số lượng phân tử DNA tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu
kỳ. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường từ 30→40 chu kỳ và
mỗi chu kỳ thường kéo dài khoảng 2 phút. Đoạn khuôn có thể là DNA mạch
kép, mạch đơn hoặc ARN. Mồi oligonucleotid thường có kích thước 6 - 30
nucleotid.
1.4.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing)
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai
mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucletid khác nhau nhờ các base của chúng, đó
là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotid này nối
kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự gen tức là phát hiện
được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid này trên phân tử DNA.
Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản
sinh trong ống phản ứng giải trình phải được đánh dấu huỳnh quang để các
vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng
laser. Bốn loại ddNTP thường được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang

khác nhau. Cấu tạo của một máy tự động gồm hai phần chính yếu, đó là: phần
điện di với gel polyacrylamid và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di
poluacrylamid có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần
21
phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm ti laser đi
qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di,
mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia sáng laser thì vạch điện di sẽ
phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu
lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Tù biểu đồ của các đỉnh
cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để
cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).
Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thên
nucleotid trên gen. Do phần lớn các đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson là
đột biến điểm như trên đã trình bày nên cho đến nay phương pháp giải trình tự
gen ATP7B vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến
của gen gây bệnh.
22
Hình 1.7. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP

23
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.2. Nhóm bệnh
n = 5 bệnh nhân (bn) được chẩn đoán bệnh WD do thiếu enzym P-
ATPase . Bệnh nhân được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng
và hóa sinh đặc hiệu.

2.1.3. Nhóm chứng
n = 1 người bình thường, tiền sử gia đình không có người mắc bệnh di
truyền. Nhóm chứng được sử dụng như chứng dương bình thường để tiến
hành phản ứng PCR và giải trình tự cùng với mẫu của bệnh nhân
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein,
trường Đại học Y Hà Nội
2.2.1. Hóa chất
- Dung dịch Lysis buffer
- Dung dịch Sodium acetat
- Dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl (25: 24: 1)
- Dung dịch Chlroform: Isoamyl (24:1)
- Dung dịch SDS 10%
- Dung dịch K
- Ethanol tuyệt đối và 70° lạnh
- Nước cất khử ion
- Dung dịch đệm T.E
- Dung dịch đệm TBE 1x
- Loading Dye
- Agarose
- DNA thang chuẩn (marker)
- Thành phần của PCR Master mix: Buffer, dNTPs, Primer, Taq
polymerase, MgCl
2
24
2.2.2. Trang thiết bị máy móc
- Pipet và đầu côn các loại 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl
- Ống Eppendoff
- Ống nghiệm pha hóa chất
- Cốc thủy tinh

- Ống đong, bình nón
- Khay đổ gel
- Cân điện tử
- Tủ sấy
- Lò vi sóng
- Máy Votex
- Máy ly tâm lạnh, máy ly tâm thường
- Máy lắc nhiệt
- Máy điện di
- Máy chụp ảnh gel
- Máy đọc huỳnh quan
- Máy đo OD
- Máy PCR
- Máy giải trình tự gen tự động
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi
Các mẫu DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp
Phenol/chloroform
Nguyên tắc cơ bản bao gồm các bước: Loại hồng cầu và phá vỡ màng tế
bào → Phá vỡ màng nhân → Loại protein → Tủa DNA → Rửa tủa → Hòa
tan DNA
Quy trình cụ thể:
− 0,5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer) + 0,5ml máu toàn phần
chống đông EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần)
+ Trộn đều, ủ 10 phút trong đá
+ Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi thu cặn A
− Cặn A + 0,5ml dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào và cố định nhân (dung
dịch K)
+ Trộn đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng

+ Ly tâm 8000v/10'/4ºC
25