Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
TÊN TIỂU LUẬN:
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ Ở TẾ BÀO THỰC VẬT
THÁI NGUYÊN - 2014
MỤC LỤC
I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ xa xưa, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện
pháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để
trồng, gọi là giâm cành, chiết cành… hay ghép những thân cây này với thân cây
kia bằng cách ghép cành. Do đó, cùng một lúc chúng ta có thể nhân lên hàng
loạt cây trồng mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại, công nghệ nuôi cấy mô tế
bào ra đời, công nghệ này giúp tạo ra hàng loạt cây trồng mới một cách nhanh
chóng mà không nhất thiết là từ các hạt của cây mà có thể lấy từ bất kỳ mô bào
nào của cây, trừ những mô bào đã hóa gỗ.
Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ
quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng
các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trong những
năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại
hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Những
thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông
nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế.
2
1. 2. Mục tiêu nghiên cứu
- Hiểu rõ khái niệm và các căn cứ khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào ở
thực vật.

- Quy trình nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.
- Các vấn đề tồn tại trong nuôi cấy mô tế bào ở thực vật và công nghệ mới trong
nuôi cấy mô tế bào.
3
II. NỘI DUNG
2.1. Căn cứ khoa hoc
2.1.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại nuôi cấy mà nguyên liệu là thực vật hoàn toàn sạch bệnh trên môi
trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong
ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên
ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo.
Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…
- Nuôi cấy phôi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo.
- Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
Hiện nay trên thế giới kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt kĩ thuật nuôi cấy mô tế
bào được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới nhất là trong cây trồng và
vật nuôi, nhằm tăng năng suất trong trồng trọt và chăn nuôi đáp ứng được nhu
cầu lương thực, thực phẩm cho xã hội loài người ngày nay.
2.1.2. Căn cứ khoa học
* Tính toàn năng của tế bào thực vật
Lần đầu tiên Haberlandt (1992) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh và sau này đó chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật.

Ngày nay đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng
theo quan điểm sinh học hiện đại chính là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể sinh vật đó. Khi
4
gặp điều kiện thuận lợi mỗi tế bào đều có khả năng phát triển tạo thành một cơ
thể mới hoàn chỉnh.
* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
- Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phôi sinh ban đầu hình
thành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: mô
dậu ở lá làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ…
Sơ đồ: các giai đoạn phân hóa của tế bào
Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa (có chức năng riêng biệt).
- Sự phản phân hóa tế bào: Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức
năng chuyên hóa chúng vẫn không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của
mình. Trong những điều kiện nhất định cần thiết nếu chúng gặp điều kiện
thích hợp lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ.
Quá trình này gọi là sự phân hóa tế bào nó ngược lại với quá trình phân
hóa tế bào.
- Sơ đồ: Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện
thuận lợi của môi trường sẽ phân hóa và tiếp tục phân chia liên tục tạo thành các
mô sẹo. Các mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá nữa. Nếu
chuyển các mô sẹo sang các môi trường khác nhau tùy theo thành phần môi
trường mà tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ, và có
thể tạo thành cây hoàn chỉnh.
Như vậy, quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Vậy kĩ
5
thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chính là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản

phân hóa tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào.
Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là
auxin và xitokinin. Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sự
phát sinh hình thái khác nhau.
2.2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khả năng nuôi cấy của các loại mô và tế bào
Về nguyên tắc, mọi loại tế bào của một cơ thể thực vật đều giữ được tính
toàn năng có nghĩa là khả năng nuôi cấy thành công. Tuy nhiên trong thực tiễn
các loại tế bào và các loại mô khác nhau thì có biểu hiện rất khác nhau về triển
vọng nuôi cấy thành công. Một nguyên tắc cơ bản được tổng kết là càng gần
trạng tái tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy
nhiêu. Như vậy, tế bào và mô của phôi non là triển vọng nhất, sau đó là đến các
tế bào đỉnh sinh trưởng ở trạng thái hoạt động (như chồi ngọn, đầu rễ …) hay ở
trạng thái ngủ nghỉ (như phôi mầm, chồi nách …). Cũng rất gần với phôi là các
tế bào sinh dục như noãn bào, tế bào hạt phấn ở giai đoạn non…
2.2.2. Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô
* Các bước chính trong nhân giống in vitro
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các
bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ (các cây cho mẫu nuôi cấy)
- Sạch bệnh đặc biệt là các bệnh virus trong giai đoạn sinh trưởng mạnh.
- Các cây mẹ trồng trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm
sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu để cấy.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng mẫu đưa vào nuôi
cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ
6
sống sót cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Chú ý khi lấy mẫu cần chọn đúng
loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây thì sẽ đạt hiệu quả cao.
Bước 3: Nhân nhanh: là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình

thái và tăng số lượng thông qua các con đường như hoạt hóa chồi nách, tạo chồi
bất định và tạo phôi vô tính. Trong bước này phải cần chú ý đến môi trường
nuôi cấy và các điều kiện ngoại cảnh để có hiệu quả cao nhất.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao cây sinh trưởng
mạnh cần đảm bảo một số yêu cầu sau:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định.
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp thoát
nước…
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
* Ý nghĩa
Đây là lĩnh vực mang lại hiệu quả kinh tế cao. Một trong những ưu việt
của phương pháp này là việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ. Ở kích
thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Mô nuôi cấy
sẽ dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt hơn mà các phương pháp
khác không có được như: có thể sản xuất cây giống trên quy mô công nghiệp, có
hệ số nhân giống cao và tạo ra các cá thể có hệ gen hoàn toàn đồng nhất. Kỹ
thuật nhân nhanh được ứng dụng vào những mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các keieru gen quý làm vật liệu cho công tác chọn
tạo giống.
- Nhân nhanh các loài cây cảnh, loài hoa khó trồng bằng hạt.
7
- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
- bảo quản tập đoàn gen.
Với phương pháp này hiện nay người ta đã tạo ra được nhiều giống cây nông

nghiệp có năng suất cao tạo được các loài cây cảnh, cây lâm nghiệp được phổ
biến nhanh vào trong sản xuất.
2.3. Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào
2.3.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability)
Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số
lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra
những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại.
Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi
đỉnh.
Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:
- Kiểu di truyền: tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotyp của các loài cây
trồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến
dị.
- Số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Theo Amstrong và
Philips (1998): khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể.
- Loại mô: nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít
bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác.
2.3.2. Sự nhiễm mẫu đất
Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng
mẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium,
Bacills, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô
dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2
tuần nuôi cấy). Để khắc phục được hiện tượng trên trước hết cần lựa chọn cây
mẹ đúng tiêu chuẩn. Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng
nhiễm khuẩn và nấm. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và phản
ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất
8
kháng sinh thường gây ra những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng
đến di truyền tế bào chất.
2.3.3. Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu,
mẫu này có thể khuếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy
có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol
eucomicacid và tyramine đã làm hóa nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy. Các
phương pháp trừ sự hóa nâu:
- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuô cấy (0,1-0,3%), phương pháp
này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và
Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh
cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết
khác.
- Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu
một số cây ăn quả (táo, hồng).
- Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng.
- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.
- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxi thấp, không có ánh sáng (1-2
tuần).
- Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1-2
tuần.
2.3.4. Hiện tượng thủy tinh hóa
Cây bị “thủy tinh hóa” – thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó
sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh. Thường xảy ra khi
nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp. Đặc
biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền và hoa
cúc. Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có
nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây in vitro thường có mật độ khí
khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong
9
quá trình nuôi cấy. Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành một số
giải pháp:
- Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ chất đường hoặc các

chất gây áp suất thẩm thấu cao.
- Giảm nồng độ các chất chứa nito trong môi trường.
- Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.
- Sử lý axit adsixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng
2.4. Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng
Là bước phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo sư T.Koyoki
Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua. Công trình nghiên cứu tập
chung vào vấn đề nhân giống cây nuôi cấy mô trên môi trường không có đường
nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO
2.
Công nghệ
này đã được thử nghiệm thành công trên nhiều đối tượng cây trồng như cà chua,
khoai lang, rau spinach, dưa chuột, xà lách, keo, cà phê, xoài, tre, thông… Công
nghệ này đang được tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho hệ thống nhân giống
công nghiệp hóa.
Lợi ích của công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng:
- Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỷ lệ sống của mô thực vật được nâng
cao ở tất cả các bước trong nhân giống trong điều kiện tự dưỡng.
- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trong
môi trường.
- Tỷ lệ đột biến có thể được giảm vì cây được nuôi trong điều kiện môi
trường giống tự nhiên.
- Tự động hóa và do đó giảm được chi phí lao động.
Nhược điểm:
- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO
2,
O
2
).

- Cây vấn sinh trưởng trong điều kiện vô trùng vì vậy dẫn đến chi phí cao
cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể.
10
2.4.2. Bioreactor
* Sự phát triển công nghệ Bioractor trong vi nhân giống cây trồng
Takayama và Miasawa là những người đầu tiên nghiên cứu sử dụng
bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa
ly, hoa lan hồ điệp, cỏ ngọt với công suất 20000 chồi/bình bioreator 500lit….
Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết
bị bioreator hoàn toàn tự động hóa. Ví dụ: một bioreactor inbro – mier (rung và
trộn) trang bị với các ống silicone sục khí tự do đã có khả năng sản xuất 100000
phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu như
dung dịch đó được đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần.
Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành
rất phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.
* Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với môi trường nuôi cấy trong bình
- Thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1 lít. Điều này cho phép sản
xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kỹ thuật cao cấp
- Hầu hết các bình bioreator được thiết kế với một cơ chế khuấy, bằng cơ
học hay bằng thổi khí, để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.
- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lý
có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Có những chỉ dẫn về các nhân
tố môi trường như pH và oxygen hòa tan. Điều này không thể thực hiện được
với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.
* Cách nhân giống bằng bioreactor
Bioreator có thể được ứng dụng để vi nhân giống thực vật trên quy mô
thương mại theo 3 hướng:
(1) Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan…)
(2) Tạo củ in vitro (khoai tây, lily…)
(3) Tạo phôi soma (cà phê, cao su,…)

11
III KẾT LUẬN
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào hiện nay đang rất phổ biến và là ngành có
tiềm năng phát triển mạnh. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật này đã làm
nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta
đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương
mại. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp
nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công
nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Những
kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cố
và có nhiều bước tiến rõ rệt. Với phương pháp này người ta có thể nhân giống
rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương
pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được.
Ngoài ra, không chỉ riêng lĩnh vực cây trồng, công nghệ nuôi cấy này còn
có ở động vật và cả con người. Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi chi phí bảo
quản cao, thiết bị máy móc hiện đại đắt tiền và đội ngũ cán bộ lành nghề nên cần
được đầu tư hơn nữa mới đem lại hiệu quả cao.
12
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Văn Hoàng, 2008. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Đại
học Đà Nẵng.
2 Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên), 2011. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật – các
khái niệm và ứng dụng, NXB Đại học Huế.
3. Nguyễn Đức Thành, 2000. Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng
dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
13