Nuôi cấy tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong phòng
thí nghiệm.
Tác Giả : Lê Hoàng Duy
Danh mục :
Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi
cấy.
Chương 2 : Hướng dẫn nuôi cấy Vi khuẩn.
Chương 3 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật.
Chương 4 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật
và động vật hữu nhũ.
Lời Ngỏ :
Tài liệu tham khảo từ 1 cuốn sách chuyên nghành sinh học xuất bản năm 1972, tài liệu để tham
khảo thêm cho sinh viên chuyên nghành công nghệ sinh học. Tài liệu này không phải tài liệu xét
nghiệm chỉ tập trung vào kiến thức nuôi cấy tế vào và vi sinh vật, kiến thức cơ bản cho công
nghệ tế bào gốc sau này, nhìn chung công nghệ hiện nay sử dụng máy móc để giảm gánh
nặng cho các nhà nghiện cứu nhưng cách thức nuôi cấy vẫn không khác gì những năm đầu
của công nghệ sinh học.
Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi cấy.
Dung dịch Hanks
Đậm gấp 10 lần.
Cách pha :
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
1
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Pha 2 dung dịch riêng A và B riêng rẽ sau đó kết hợp lại :
Dung dịch A :
NaCl : 80g.
KCl : 40g.

7H2O + MgSO4 : 1g.
MaCl2. .6H2O : 1g.
CaCl2 : 1,4g
Nước cất 2 lần 500ml.
Dung dịch B :
Na2HPO4.2H2O : 0,75g
Na2HPO4.12H2O : 1,5g.
KH2PO4 : 0,6g.
Glucozơ : 10g
Nước cất 2 lần 480 ml.
** Pha 2 dung dịch muối như trên sau đó đổ dung dịch A vào dung dịch B một cách từ từ vừa
đổ vừa khuấy. Cuối cùng cứ mỗi lít dung dịch cho thêm 20 ml dung dịch 1% đỏ phenol. Lọc qua
lọc giấy, để làm tiệt trùng thì có 2 cách :
+ Cách thứ 1 là cách tốt nhất là lọc qua Seitz (lọc ngăn vi khuẩn).
+ Cách 2 sấy ước ở 100 độ C trong 20 phút, sấy 3 lần trong 3 ngày liên tiếp. Nhưng trong
trường hợp này CaCl2 phải pha riêng vào cho thêm sau khi sấy, trước khi dùng.
 Tiệt trùng xong thì đóng vào lọ 500-1000 ml đậy kín bằng nút cao su. Thử vô trùng
bằng cách cấy 0,5 ml dung dịch vào môi trường canh thang thịt – pepton và thách
Sabouraud.
 Bảo quản dung dịch mẹ trong tủ lạnh có thể bảo quản được đến 6 tháng. Trước khi
dùng đem pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần vô trùng. Dung dịch làm việc đem sấy
100 độ C, 10 phút với áp suất 0,7 at , điều chỉnh PH bằngng dung dịch bica 1,4% có
PH = 7,2 – 7,4.
 Cứ 100 ml dung dịch cho 2,5 – 3 ml.
Chú ý :
+ Dung dịch làm việc trong phòng không quá 1 tháng.
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
2
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011

+ Chưa pha bica có thể sử dụng 6 tháng.
Bica là tên viết tắt : Bicacbonat Na, Bicacbonat Ca, Bicacbonat Mg....
Dung dịch Earle
Thành phần dung dịch chuẩn đặc 10 lần trong 1 lít như sau :
NaCl : 68g.
KCl : 4g.
CaCl2 : 2g.
MgSO4.7H2O : 2g.
NaH2PO4.7H2O : 1,25g.
Glucozơ : 10g.
Đỏ Phenol : 0,2g.
Hòa tan các thành phần mưới theo trật tự kể trên trong nước cất 2 lần. Riêng CaCl2 thì
phải pha riêng và cho vào sau vừa cho vừa trộn lọc qua lọc Seitz. Khử vô trùng đậy nút
cao su. Bảo quản ở buồng lạnh. Trước khi pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần. Lọc lại
lần thứ 2. Điều chỉnh PH để có PH = 7,4 – 7,5 bằng cách cho thêm vào 4 – 4,4 ml dung
dịch 5% Bica vào 100 ml dung dịch muối. Nếu cần thì cho giảm PH thì cho luồn khí CO2
đi qua sau khi khí này đã được đi qua bình chứa axit H2SO4 hay đi qua lọc bông.
Dung dịch đệm FotFat
Tùy theo yêu cầu cụ thể của công tác có thể cần cụ thể của công tác có thể cần đến
dung dịch đệm Fotfat chứa các ion Ca và Mg.
Cách pha 1 lít dung dịch này đặc 10 lần như sau :
Dung dịch A :
NaCl : 80g
KCl : 2g
CaCl2 : 80g.
KCl : 2g
CaCl2 : 1g
MgCl2.6H2O : 1g
Nước cất 2 lần 1000 ml.
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy

3
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Dung dịch B :
Na2HPO4.12H2O : 28,98g
KH2PO4 : 2g
Nước cất 2 lần : 10 ml
Trước khi dùng cứ 100ml dung dịch A cho thêm 800 ml nước cất 2 lần sau đó cho thêm
100 ml dung dịch B. Lọc qua lọc Seitz và giữ ở tủ lạnh.
Nếu trong dung dịch đệm Fotfat không cần các Ion Ca và Mg thì cách pha như sau :
NaCl : 8g.
KCl : 0,2g
Na2HPO4.12H2O : 2,9g
KH2PO4 : 0,2g
Nước cất 2 lần cho đầy 1 lít sấy vô trùng 110 độ trong 30 phút có thể giữ được ở nhiệt
độ phòng.
Dung dịch Trypsin
Hòa tan 1g Trypsin Difco trong 100ml dung dịch đệp Fotfat. Lọc qua lọc giấy hay lọc
bông sau đó lọc qua lọc Seitz thử vô trùng bằng các cấy vào canh thang thịt Pepton và
thạch Sabouraud.
Ở trạng thái đống băng (-20 độ C) dung dịch Trypsin có thể bảo quản được mấy tháng ở
+ 4 độ C, chỉ giữ được vài tuần lễ. Trước khi dùng đem pha loãng 4 lần với dung dịch
đệm Fotfat hay dung dịch Hanks vô trùng để có nồng độ cuối cùng là 0,25%.
Dung dịch Vecxen
(Vecxen là muối của axit etylen diamin tetra-axetic)
Để điều chế dung dịch 0,02% người ta cấy 0,5g Vecxen hòa tan trong 2500ml dung dịch
đệm Fotfat không chứa Ion Ca và Mg rót vào lọ 50ml, sấy vô trùng dưới áp suất 1 at, 30
phút. Bảo quản ở 4 độ C trong thời gian 1 -2 tháng tránh ánh sáng.
Dung dịch đỏ Phenol 1%
Trước hết chứa 100ml 1N NaOH bằng cách trộn 10ml dung dịch NaOH bảo hòa(li tâm

dung dịch NaOH bảo hòa để bỏ hết cặn) với 90 ml nước cất 2 lần. Sau đó cứ 10g đỏ
Phenol hòa tan trong cồn cho thêm 20ml dung dịch 1N NaOH lắc đều để lắng mấy phút.
Hút hết nước trong ở bên trên cho vào ống đo lường 1 lít và cho thêm vào chỗ cặn độ
10ml 1N NaOH lại lắc và hút lấy nước trong hộp vào ống đong, cứ tiếp tục như thế cho
đến khi thuốc đỏ Phenol tan hết. Tuy nhiên 1N NaOH dùng để hòa tan 10g Phenol
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
4
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
không được quá 70ml vì nếu số lượng NaOH nhiều quá thì dung dịch có màu đỏ thẫm
không dùng được vào nuôi cấy tế bào.
Dung dịch đỏ trung tính
Muốn chế dung dịch 0,1% đỏ trung tính người ta hòa tan 0,1g thuốc vào 100ml cồn Etyl
60 độ dung dịch này dùng để nhuộm ống tế bào để đếm và để phát hiện Plecơ .
Dung dịch Cristal Violet(xem thêm)
Dung dịch này cũng dùng để nhuộm sống tế bào để đếm trong khi làm Trypsin hóa mô.
Pha 0,1% dung dịch Cristal Violet trong 0,1N axit Nitric.
Tạo Huyết Thanh
Ứng dụng dùng để thêm vào môi trường dinh dưỡng 1 lượng nhất định từ 5 – 10% để tế
bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh
Điều chế : Lấy máu của động vật thường là của Bê, Ngựa & của người.....
Cho vào lọ rộng cổ để trong tủ ấm 20 – 30 độ C cho máu đông, sau đó dùng que tách
máu đông ra khỏi lọ, đặt lọ vào tủ lạnh +4 độ C trong 1 – 2 ngày.
Chắt huyết thanh li tâm 2000 vòng/phút trong 20 phút lọc lấy huyết thanh qua lọc Seitz
rót vào lọ hay ống và đậy nắm cao su, thử vô trùng và bảo quản ở tủ từ 4 – 20 độ C.
Tùy mục đích sử dụng có thể dùng tươi hay đun ở 50 độ C trên 30 phút trước khi dùng
cần thử độc tính đối với tế bào.
Chất làm nhũ hóa
Liên quan đến chất béo chia nhỏ chất béo...
Dung dịch Glyxerin 15% trong H2O huyết thanh ngựa bình thường không chứa chất bảo

quản, dung dịch Sacarozơ 10% với Gelatinh 1% có PH 6,8 – 7 hoặc các dung dịch chứa
glucozơ, lactozơ có 10 – 30% sữa.
Thủy phân tinh bột
Nguyên lí : Dùng(H2SO4 hoặc HCl) với áp lực dư. Dịch thủy phân thu được trung hòa
bằng Na2CO3 hoặc NaOH. Nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân thì có thể dùng
CaCO3 hoặc nước vôi để trung hòa, sau đó lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính
để khử màu : Dịch thủy phân thường là glucoza, 1 lượng nhỏ aa, khoán chất có thể đem
làm cô đặc lại 60-70% để sử dụng dần.
• Dùng enzim : Bột gạo, bột ngô đã tách phôi men α amilaza hay β Amilaza, Bột đậu
tương là 1 nguồn Nitơ kỹ thuật chứa 40% Protein 19% chất béo và các Axit amin.
Cách làm cao ngô Bắp
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
5
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Cách làm cao ngô thường có màu nâu sẫm 150 kg hạt không mọt không mốc, rửa sạch
ngậm với 220l nước, máy tỉ lệ nước bằng 1:1,3 thêm 2 lít HCl 30% và 1,2 kg Na2SO3 để
làm dịch ngâm có PH = 3 và nồng độ SO2 có 0,25% ngâm 48 giờ ở 50 – 55 độ C.
Sau khi kết thúc dịch ngâm được gia nhiệt tới 75 – 80 độ C dùng sữa vô đã lọc sạch, chỉnh
PH 8 – 8,2 để lắng 30 phút cho protein kết tủa. Lọc qua lọc ép khung bản và rữa bả bằng
nước nóng. Dịch lọc và nước rửa được điều chỉnh PH bằng HCl tới 5 và cô chân không ở
60 độ C tới 28 độ bé.
Thành phần lớp tạo phủ dùng để làm phương pháp plecơ :
1. Dung dịch Earcle đặc 10 lần không chứa đỏ 18 ml Phenol và Bica.
2. Nước cất vô trùng : 60 ml
3. Huyết thanh bê hoặc khỉ 3,6 ml
4. NaHCO2 (7,5%) : 5,4 ml
5. Đỏ trung tính (1:1000) : 3 ml
6. Penixilin : 18.000 đơn vị
7. Streptomixin : 18.000 đơn vị

Thạch phủ này đảm bảo tế bào sống được 8 – 12 ngày
• 2% thạch
• Môi trường dinh dưỡng dung dịch Gey A đặc 10 lần 20%
• Dung dịch Gey B đặc 10 lần 10%
• Tris 0,2 M, PH = 7,6 đặc 10 lần 10%
• 5% Lactoalbumin Hydrolisat 10%
• Chứa 10% huyết thanh bê
• Đỏ trung tính 1:1000
• Nước cất 30%
Dung dịch Gey B
NaCl : 8g
KCl : 0,375g
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
6
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
CaCl2 : 0,275g
MgCl2 : 0,21g
Na2HPO4 : 0,15g
KH2PO4 : 0,025g
Glucoza : 2g
NaHCO3 : 0,25g
Nước cất 2 lần 1000ml có thêm đỏ Phenol làm chất chỉ thị màu, bảo quản ở nhiệt độ +4 độ
C thời gian 1 tháng.
Tách Enzim dùng muối trung tính kết tủa là Sunfat amon [(NH4)2SO4] tỉ lệ 50 – 60 % dùng
(Etanol, Izopropanol và axeton) chiết nước nấm men cho 3-4 thể tích cồn vào 1 thể tích
nước chiết enzim để trách giảm hoạt tích enzim cần lạnh xuống 3 – 5 độ C khuấy mạnh, khi
enzim kết tủa lắng xuống cần li tam cần rửa đến 2 – 3 lần ca độ cho vào bình hút ẩm hoặc
máy sấy chân kh6ong sản phẩm thu được ở dạng bột.
Chương 2 : Nuôi cấy vi khuẩn.

Tóm tắt nội dung chương 2 : bài này hướng dẫn nuôi cấy những vi khuẩn có lợi, và ứng dụng
vào cuộc sống, cách nuôi cấy vi khuẩn khác cũng tương tự các bạn tìm hiểu thêm tại trường
hoặc hỏi những người có chuyên môn.
Bảng vi khuẩn và ứng dụng của vi khuẩn.
Vi sinh vật sản sinh Bản chất sản phẩm trao đổi chất Hoạt tính Dược học
Aerobacter cloal Amanita
muscaria và các nấm khác.
Polisacarit Muscarin. Chống viêm tăng phó
giao cảm.
Bacillus anthracis. Dịch lọc thô nước chiết. Giống Eponefrin hoat
tính tim mạch.
Bacillus licheniforms. Nước chiết thô Giống ACTH
Bacillus subtilis. // //
Các loài Claviceps. Ecgotalcaloit Phong bế adreneric
kích thích cơ trơn hoạt
tính CNS
Corticium caeruleum. Ruglovasin A & B Hạ huyết áp.
Fusarium oxysporum. Axit Fusaric Caxit5-butylpicolinic Hạ huyết áp.
Nhiều loài Fusarium. Nước chiết thô. Gây buồn nôn.
Gibbrella Zea Zlagenin Gây hạ protein, gây
động dục.
Zearalenon Gây động dục.
Lactobacillus leichmannii Nước chiết thô. Giống ACTH.
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
7
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Lenzites trabea Rugulovasin A & B Hạ huyết áp
Lentinus Edodes Lentysin Giảm lipit máu.
Lenzites trabea Rugulovasin A & B Hạ huyết áp.

Naematoloma fasciculare Naemototin Giảm động mạch vành
Oospora-astringenes Oosponals oospo lacton, oospong
lycol
Co cơ.
Oudemansiella radicata Oudenon Hạ huyết áp.
Nhiều loài Panaeolus Serotonin 5 hydroxytriptophan Co mạch.
Pellicularia filamentosa Rugulovasin A & B Hạ huyết áp.
Penicillium convor ruglosum Rugulovasin A & B Hạ huyết áp.
Penicillium corylophiloides Rugulovasin A & B Hạ huyết áp.
Penicilium purpurogenum Rugulovasin A & B Hạ huyết áp
Penicilium Rugulosum // //
Phialocepphala repens Phialoxin Chống đông.
Psilocybe mexicana và các
nấm khác
Psiloxin Tăng hoạt động tâm
thần.
Rhizoc tonia leguminicola Slaframin Tăng phó giao cảm.
Salmoella enteriditis Nước chiết thô. Giống ACTH.
Salmonella tiphi // //
Serratia marcescens // //
Nhiều loài Serratia Proteaza(TSP) Chống viêm.
Streptomyces allbire ticuli Leupeptin Chống Plaxmin, chống
viêm ức chế, các men
Trypsin Papainmen
chống đông máu và
các men khác.
Streptomyces argenteolus
Var.toyonakensis
Pepstatin Ức chế Pepxin.
Treptomyces cacaoi

Varasoensis
Proteinnaza trung tín. Chống viêm.
Treptomyces caespitosus Pepstatin Ức chế pepsin
Treptomyces chartreusis Leupeptin Như stm.albireticuli
Streptomyces grioseolus Proteinnaza trung tín Chống viêm.
Streptomyces griseus proteaza Giống Insulin
Streptomyces hygroc picus Chimostatin. ức chế chimotripsin
Streptomyces kinoluteus Kinonaza B1 Proteinnaza Chống viêm
Streptomyces lavendulae Chimostatin Leupeptin ức chế chimotripsin
như stm.albireticuli
Streptomyces nigrifaciens
Var.FFD-101
Nigrifactin Chống hixtamin
Streptomyces : noboritoensis Leupeptin Như stm.albiraticuli
Streptomyces :
roseochromogenes
// //
Streptomyces roseus Leupeptin Như stm.albiraticuli
Streptomyces testaceus Leupeptin Ức chế Peptin
Streptomyces thioluteus Leupeptin Như stm.albiraticuli
Streptomyces Verticillatus
Var Zynogenes
Retikinonaza I & II Proteinaza trung
tin.
Chống Viêm.
Streptomyces EF-44-201 4 thành phần S-PI Ức chế pepsin
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
8
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011

Các loài streptomyces Enzim Giảm nhóm Protein A
& B của máu.
Zygosporiu Masonii Zygosporin A Chống Viêm
Zygosporium Mycophilum Zygosporin A Chống Viêm
Penicillium chrysogenum Penixylin Điều trị các bệnh
nhiễm trùng do vi
khuẩn, nấm hoặc
virus.
Streptomyces Erythryus Tetraxiclin //
Streptomyces Griseus Streptomyxin //
Striptomyces erythreus Eritromixin //
Penixillium patulum Grizeofulvin //
Clavileps purpurea Alcaloit của nấm cựa gà như :
Ecgotamin, Ecgotoxin
Trong khoa sản (giúp
vào việc co tử cung)
và điều trị các bệnh
mạch máu, bệnh nhứt
đầu 1 bên.
Propionibacterium Shermanii Vitamin(B12) corinoit Điều trị thiếu máu ác
tính.
Ca1v loại vi khuẩn xạ khuẩn
và nấm.
Steroit có cấu trúc được thay đổi 1
cách đặc hiệu nhờ vi sinh vật.
Chế phẩm hoocmon
Ví dụ để kìm hãm sự
rụng trứng để điều trị
viêm và thấp khớp.
Acetobacter subboxy dans L-socboza (Tiền chất để tổng hợp

axit ascorbic)
Tiền chất của Vitamin
C
Dextran Chất thay thế huyết tương. Leuconostoe
mesenteroides
Aspergllus niger Enzim Chuẩn đoán lâm sàn
hóa sinh.
Penixilium chryso genum Glucozooxydaza Chuẩn đoán bệnh đái
đường.
Escherichia coli Asparaginaza Kiềm hãm khối u và
bệnh bạch cầu.
Streppiococcus spec Streptokinaza Điều trị bệnh mạch
máu.
Bacillus subtilis Penixilinaza Loại trừ Penixilin
Rhizpus spec. Lipaza. Thuốc trị tiêu hóa.
Môi trường nuôi dưỡng kháng sinh
Penixilin
Các chủng Penixilin :
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
9
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2011
Penicyllum, Aspergllus Penicillum notatum, Pichrysogenum.
Môi trường nuôi cấy :
30g Lactozơ kỹ thuật, 3g NaNO3, o,5g KH2PO4, 0,25g MgSO4
0,2g C6H5Ch2CooH, 0,044g ZnSO4
Nước cất vừa đủ 1 lít dùng NaOH điều chỉnh PH tới 5,5
Cấy chìm gam/lít:
Cao ngô : 2
Glucozơ : 2

Lactozơ : 0,5
Nitrat amol : 0,125
Sunfat Magie : 0,025
Sunfat Nitrat : 0,05
Kali Photohat monobazic : 0,2
CaCO3 : 0,5
Treptomixin
Môi trường :
Có glucoz ơ, bột đậu tương, cao ngô, ngoài ra còn có muối Amon, photphat và CaCO3 điều
chỉnh PH.
Giberelin
Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy
10