Nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ một số chủng nấm mốc và ứng dụng

-i-




LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến
PGS TS. Đồng Thị Thanh
Thu
Người đã luôn luôn tận tình hướng dẫn, định hướng cho tôi từ lúc bắt
đầu cho đến khi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa Trường
Đại học Khoa học tự nhiên Tp.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
làm việc trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin cảm ơn Ths. Trần Quốc Tuấn đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp
đỡ tôi trong quá trình làm đề tài.

Xin cảm ơn chị Hiền, chị Mai, các bạn Tú Minh, Hồng Vân, Thùy Nhi,
Bảo Trân, Bảo Yến và các bạn lớp cao học Hóa Sinh K17 đã giúp đỡ,
chia sẽ kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.

Cảm ơn các em Khuê, Khoa, Nguyên, Phát, Nhã, Vy đã luôn động
viên và khích lệ tinh thần để tôi hoàn thành tốt luận văn.

Cuối cùng con xin gửi lòng biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ và những người
thân trong gia đình đã hỗ trợ cả vật chất lẫn tinh thần để con bước tiếp
trên con đường học vấn của mình.

Tác giả
Nguyễn Thị Lệ Ngọc
-ii-






MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng biểu
Danh mục các hình, biểu đồ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME 3
1.1.1. Bản chất sinh học của enzyme 3
1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme 4
1.1.3. Cơ chế xúc tác của enzyme 5
1.1.4. Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác 6
1.1.5. Công nghệ enzyme và ứng dụng 7
1.2. ENZYME GLUCOAMYLASE 10
1.2.1. Giới thiệu chung 10
1.2.2. Cơ chế tác động 10
1.2.3. Tính chất của glucoamylase 11
1.2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước
…………….…….…………… 13

1.2.5. Ứng dụng của enzyme glucoamylase 13
1.2.6. Đặc điểm các chủng nấm mốc tổng hợp glucoamylase 14
1.2.6.1. Aspergillus 14
1.2.6.2. Rhizopus 15
1.3. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ
VI SINH VẬT 16
-iii-




1.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt 16
1.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn 16
1.3.1.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng 17
1.3.2.Phương pháp nuôi cấy chìm 17
1.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme 17
1.3.3.1. Chủng giống vi sinh vật 18
1.3.3.2. Môi trường dinh dưỡng 18
1.3.3.3. Nhiệt độ 19
1.3.3.4. Độ ẩm 19
1.3.3.5. pH 19
1.3.3.6. Cung cấp oxy 19
1.3.4. Thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy 20
1.3.5. Phương pháp tinh sạch enzyme 21
1.3.5.1. Kết tủa enzyme dựa trên tính hoà tan 21
1.3.5.2. Tủa bằng muối 21
1.3.5.3. Tủa bằng dung môi hữu cơ 21
1.3.5.4. Tủa bằng điểm đẳng điện 21
1.3.5.5. Tủa bằng vật liệu polymer không ion 22
1.3.5.6. Tủa bằng ion kim loại 22

1.4. NẤM MEN VÀ NUÔI CẤY NẤM MEN THU SINH KHỐI
GIÀU PROTEIN 22
1.4.1. Nấm men 22
1.4.2. Các chất dinh dưỡng cho nấm men 24
1.4.2.1. Dinh dưỡng Carbon 24
1.4.2.2. Dinh dưỡng nitơ 26
1.4.2.3. Dinh dưỡng khoáng 26
1.4.2.4. Dinh dưỡng các chất sinh trưởng 28
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng dến hoạt động sống của nấm men 28
1.4.3.1. Nhiệt độ 28
-iv-




1.4.3.2. pH của môi trường 28
1.4.3.3. Thành phần môi trường 29
1.4.3.4. Oxy hòa tan 29
1.4.4 Ý nghĩa của việc sản xuất và ứng dụng của sinh khối nấm men 30
1.4.4.1. Ý nghĩa của việc sản xuất sinh khối nấm men [48] 30
1.4.4.1. Ứng dụng của sinh khối nấm
men………………………………… 31
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 32
2.1. VẬT LIỆU: 32
2.1.1. Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 32
2.1.2. Nguyên liệu. 32
2.1.3. Môi trường nuôi cấy nấm mốc 32
2.1.3.1. Môi trường giữ giống 32
2.1.3.2. Môi trường bán rắn nuôi nấm mốc thu enzyme 32
2.1.4. Môi trường nuôi nấm men 33

2.1.4.1. Môi trường giữ giống 33
2.1.4.2. Môi trường nuôi nấm men thu sinh khối 33
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.2.1. Phương pháp xác định pH 33
2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm 33
2.2.3. Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller 34
2.2.3.1. Nguyên tắc 34
2.2.3.2. Hoá chất: 34
2.2.3.3. Cách tiến hành 34
2.2.4. Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid 35
2.2.5. Xác định Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 36
2.2.5.1. Nguyên tắc 36
2.2.5.2. Cách tiến
hành……………………………………………………….36
-v-




2.2.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật 38
2.2.6.1. Định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 38
2.2.6.2. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang 39
2.2.7. Phương pháp nuôi vi sinh vật 39
2.2.7.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc thu enzyme 39
2.2.7.2. Phương pháp nuôi cấy nấm men thu sinh khối 40
2.2.8. Phương pháp xác định thời gian thích hợp để thu nhận enzyme
glucoamylase có hoạt độ cao nhất 41
2.2.9. Phương pháp tách chiết và thu nhận dung dịch enzyme 41
2.2.9.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận dịch enzyme thô 41
2.2.9.2. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase từ dịch

enzyme bởi tác nhân tủa cồn 42
2.2.9.3. Phương pháp tính hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme 42
2.2.10. Phương pháp xác định hoạt độ glucoamylase 43
2.2.11. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 44
2.2.12. Phương pháp xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme 46
2.2.13. Phương pháp khảo sát đặc tính enzyme glucoamylase 46
2.2.14. Phương pháp ứng dụng chế phẩm enzyme glucoamylase để thủy
phân các loại tinh bột 47
2.2.15. Phương pháp sử dụng phần mềm Microsoft Excel trong xử lý tính
toán kết quả 48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN………………………………………48
3.1.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU
LÀM CƠ CHẤT 49

3.2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE CỦA CANH
TRƯỜNG NẤM MỐC TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU 49
3.2.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo 49
-vi-




3.2.2. Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc nuôi trên môi trường
bã khoai mì 51
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa cám gạo và bã khoai mì để làm
môi trường nuôi nấm mốc thu nhận enzyme glucoamylase 53
3.2.3.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori 53
3.2.3.2. Hoạt độ enzyme glucoamylase trong canh trường Asp.niger 54
3.2.3.3. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp 56

3.3. KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN
ENZYME GLUCOAMYLASE 57
3.3.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori 57
3.3.2.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.niger 59
3.3.3.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp 61
3.4. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME GLUCOAMYLASE 63
3.4.1.Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 63
3.4.1.1. Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 63
3.4.1.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường
Asp.awamori 64
3.4.1.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh
trường nuôi cấy Asp.awamori 65
3.4.2. Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 65
3.4.2.1.Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 66
3.4.2.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Asp.niger 66
3.4.2.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh
trường nuôi cấy Asp.niger 67
3.4.3. Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp 67
3.4.3.1. Hiệu suất thu nhận CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp 68
3.4.3.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp 68
3.4.3.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng CPE thu nhận từ canh
trường nuôi cấy Rhizopus.sp 69
-vii-




3.4.4. So sánh hoạt độ của các CPE thu nhận từ các chủng nấm mốc 70
3.5 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH ENZYME GLUCOAMYLASE 71
3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme glucoamylase 71

3.5.1.1. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 71
3.5.1.2. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 72
3.5.1.3. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopu.sp 74
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme glucoamylase 76
3.5.2.1. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 76
3.5.2.2. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 78
3.5.2.3. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopus.sp 80
3.6. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG CPE THỦY PHÂN TINH BỘT TẠO DUNG
DỊCH GLUCOSE ĐỂ NUÔI NẤM MEN THU SINH KHỐI GIÀU PROTEIN 82
3.6.1. Khảo sát sự thủy phân tinh bột của CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Aspergillus niger 82
3.6.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thủy phân tinh bột 83
3.6.1.2. Hàm lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân 84
3.6.2. Nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae trên dịch đường sau
thủy phân để thu sinh khối giàu protein 86
3.7.2.1. Khảo sát sự tạo thành sinh khối nấm men 86
3.6.2.2. Xác định hàm lượng N tổng số và hàm lượng protein thô từ sinh
khối nấm men thu được 87
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 89
4.1. KẾT LUẬN 89
4.2. ĐỀ NGHỊ 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
-viii-

Asp: Aspergillus
%H: hiệu suất thu nhận CPE
C: cacbon
CPE: chế phẩm enzyme
CT: canh trường
dd E: dung dịch enzyme
HLpr: hàm lượng protein
Hđ: hoạt độ
HđC: hoạt độ chung
HđR: hoạt độ riêng
KLCT: khối lượng canh trường
N: Nitơ
OD: mật độ quang
ODtb: giá trị OD trung bình
DOD: hiệu số giữa mật độ quang thử thật và thử không
TB: trung bình
TN: thí nghiệm
UI: đơn vị hoạt độ (International Unit – đơn vị quốc tế)
-ix-





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số enzyme sản xuất công nghiệp từ các chủng vi sinh vật

Bảng 1.2: Một số chủng nấm men tương ứng với nguyên liệu sử dụng
Bảng 3.1: Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu
Bảng 3.2: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo
Bảng 3.3: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường bã khoai mì
Bảng 3.4: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Asp.awamori
Bảng 3.5: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Asp.niger
Bảng 3.6: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Rhizopus.sp Bảng 3.7: Biến thiên hoạt độ enzyme
glucoamylase theo thời gian nuôi Asp.awamori
Bảng 3.8: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Asp.niger
Bảng 3.9: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Rhizopus.sp
Bảng 3.10 : Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường Asp.awamori
Bảng 3.11: Hàm lượng protein của CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori
Bảng 3.12: Hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE từ canh trường nuôi cấy
Asp.awamori
Bảng 3.13: Hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.
niger
Bảng 3.14: Hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE từ canh trường nuôi cấy
Rhizopus.sp
Bảng 3.15 : Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường Asp.niger
Bảng 3.16: Hàm lượng protein của CPE từ canh trường nuôi cấy Asp. niger
-x-

Bảng 3.17 : Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường Rhizopus.sp
Bảng 3.18: Hàm lượng protein của CPE từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Asp.awamori
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Asp.niger
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Rhizopus.sp
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc
Asp.awamori
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc
Asp.niger
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc
Rhizopus
Bảng 3.25: Sự thay đổi nồng độ đường khử tạo thành theo nồng độ enzyme sử
dụng
Bảng 3.26 : Sự thay đổi hàm lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy
phân
Bảng 3.27: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối
Bảng 3.28: Hàm lượng Nitơ tổng và hàm lượng protein thô







-xi-

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ


HÌNH
Hình 1.1: Cơ chế xúc tác của enzyme
Hình 1.2: Sơ đồ phân giải của glucoamylase
Hình 1.3: Đặc điểm hình thái Aspergillus awamori
Hình 1.4: Đặc điểm hình thái Aspergillus niger
Hình 1.5: Đặc điểm hình thái Rhizopus sp
Hình 2.1: Cơ sở hóa học của phản ứng định lượng đường khử

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo
Biểu đồ 3.2: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường bã khoai
mì
Biểu đồ 3.3: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Asp.awamori
Biểu đồ 3.4: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Asp.niger
Biểu đồ 3.5: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi
trường nuôi cấy Rhizopus
Biểu đồ 3.6 : So sánh hoạt độ của các CPE thu nhận từ các chủng nấm mốc
Biểu đồ 3.7: Sự thay đổi nồng độ đường khử tạo thành theo nồng độ enzyme sử
dụng

-xii-

ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Asp.awamori
Đồ thị 3.2: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Asp.niger
Đồ thị 3.3: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Rhizopus
Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Asp.awamori
Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Asp.niger
Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm
mốc Rhizopus
Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường
nấm mốc Asp.awamori
Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường
nấm mốc Asp.niger
Đồ thị 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường
nấm mốc Rhizopus
Đồ thị 3.10: Sự thay đổi hàm lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy
phân
Đồ thị 3.11: Trọng lượng sinh khối nấm men thu được theo thời gian
Đồ thị 3.12: Biến thiên hàm lượng đường khử theo thời gian nuôi



-1-

MỞ ĐẦU
Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức
độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được
là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các
ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y
dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20
công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase,
8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme
khác … Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v…
ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi
nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế
tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại
a-amylase, b-amylase, g-amylase hay glucosamylase, oligo-1,6- glucosidase,
transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công
nghiệp thực phẩm.
Hiện nay GA là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công
nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do
khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là
a-glucose, nên GA được sử dụng trong quy trình sản xuất a-glucose. Glucose
có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công
nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng GA
trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột
khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm
giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt
nguyên liệu như Việt Nam.

Tuy nhiên, cho đến nay ngành công nghệ enzyme của Việt Nam chưa
được phát triển mạnh, lượng enzyme sử dụng đa phần phụ thuộc vào nguồn
-2-




nhập khẩu. Do đó việc nghiên cứu, tìm hiểu, phát triển sản xuất enzyme nói
chung và GA nói riêng có ý nghĩa thực tế quan trọng.
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các
điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ
một số chủng nấm mốc và ứng dụng”, tập trung vào các nội dung chính sau
đây:
- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để đạt hiệu suất thu nhận
enzyme GA cao nhất từ 3 chủng nấm mốc: Aspergillus niger,
Aspergillus awamori, Rhizopus sp.
- Thu nhận CPE GA từ các canh trường.
- Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của CPE.
- Bước đầu ứng dụng CPE để thủy phân tinh bột tạo dung dịch glucose
để nuôi nấm men thu sinh khối giàu protein.

-3-





CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, sự

trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Các quá trình trao đổi chất
này là kết quả của hàng loạt các phản ứng hóa học kế tiếp nhau. Hầu hết các
phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc biệt xúc
tác, các protein này gọi là enzyme hay là fecment (ferment) [3]. Enzyme là
những protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trò xúc tác sinh học. Chúng có
khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các
phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong
cơ thể sống.
Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những
tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất
xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa
học.
1.1.1. Bản chất sinh học của enzyme [14] ,[24], [27]
Enzyme là những đại phân tử, hầu hết enzyme có bản chất là protein được
sinh vật tổng hợp nên, tham gia xúc tác các phản ứng sinh học.
Bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học,
thực hiện xúc tác các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật. Các
enzyme đều có đặc tính sinh học chung:
- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật.
- Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi
enzyme được tách ra khỏi tế bào sống.
- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa.
-4-




- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ
thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ
trong các hợp chất hóa học.

- Enzyme có thể thực hiện một phản ứng. Các phản ứng này
thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm).
Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn mà thường xảy
ra các phản ứng theo chuỗi.
- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.
1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme [3], [23]
Nếu ta tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa
học của enzyme, ta sẽ thấy enzyme thuộc hai nhóm:
· Enzyme đơn cấu tử: bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo từ
một thành phần hóa học duy nhất là protein. Tính xúc tác của những
enzym này hoàn toàn do cấc trúc không gian quyết định: ví dụ như
enzym amylase, urease…
· Enzyme đa cấu tử: bao gồm những enzyme có hai thành phần:
- Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzyme.
- Phần không phải là protein gọi là cofactor (yếu tố phối
hợp) có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Các cofactor có thể
là các ion kim loại (Cu
2+
, Zn
2+
, Fe
2+
,…), nhóm prostetec (nhóm
ngoại) chứa vòng hem, các coenzyme là dẫn xuất của các
vitamin hòa tan trong nước.
v Trung tâm hoạt động của enzyme: một phần nhỏ của phân tử enzyme
kết hợp với cơ chất biến đổi cơ chất thành sản phẩm phản ứng. Số trung tâm
hoạt động của enzyme có thể là 1 hay nhiều hơn. Mỗi trung tâm hoạt động của
enzyme thường gồm 2 vùng:
- Vùng gắn cơ chất: còn gọi là trung tâm tiếp xúc hay trung tâm cơ

chất, là vùng liên quan tới tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất.
Trong vùng này có chứa 1 số nhóm định chức có chức năng đặc biệt gắn
-5-




cơ chất lên vị trí xác định của enzyme, tạo điều kiện cho vùng xúc tác
hoạt động như:
. Nhóm –SH (của Cystein).
. Nhóm –OH (của Serin).
. e - NH
2
(của Lizin).
. w - COOH (của acid Aspactic và acid Glutamic).
. a - COOH (của acid amin cuối mạch).
Ngoài ra các tương tác đồng hóa trị, các lực liên kết thứ cấp khác
đều có thể tham gia quá trình liên kết này.
- Vùng xúc tác: có nhiệm vụ tạo ra khả năng cần thiết nhằm biến
đổi chuyển hóa cơ chất đã được gắn vào enzyme, làm cho các liên kết trong
phân tử cơ chất trở nên lỏng lẻo, phân tử cơ chất bị biến dạng tạo điều kiện để
chuyển thành sản phẩm phản ứng dễ hơn. Vì vậy, vùng xúc tác liên quan tới
kiểu phản ứng.
1.1.3. Cơ chế xúc tác của enzyme [27]
Điều kiện để enzyme tác dụng với cơ chất là trung tâm hoạt động của
enzyme phải có cấu trúc không gian tương ứng phù hợp với cấu trúc không
gian của cơ chất như “chìa khóa với ổ khóa” nhưng có sự “linh động” nhất định
(Thuyết Fisher và Kosland).

Với:
- E: enzyme
- S: cơ chất
- ES: phức trung
gian E và S
- P: sản phẩm phản
ứng

Hình 1-1: Cơ chế xúc tác của enzyme [59]


cơ chất



s
ản phẩm

phức trung gian
-6-




Trong quá trình hoạt hóa enzyme, có sự cắt bỏ một số peptide “kìm hãm”
hoạt động enzyme hoặc “bao vây” các nhóm chức hoạt động enzyme, nhờ đó
có sự sắp xếp lại nội tại của phân tử enzyme để hình thành trung tâm hoạt động,
giúp enzyme có khả năng hoạt động.
Ví dụ: một số enzyme tiêu hóa như pepsin, trypsin, chymotrypsin,… khi
mới tiết ra ở dạng không hoạt động gọi là pepsinogen, trypsinogen,

chymotrypsinogen… Chúng chỉ hoạt động khi được hoạt hóa.
1.1.4. Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác
[11], [27]
Enzyme có nguồn gốc từ sinh vật (có thể từ động vật, thực vật hay vi sinh
vật) nên enzyme hầu như không độc hại.
Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ngay cả ở điều kiện
nhiệt độ và áp suất bình thường thì sự xúc tác của enzyme vẫn cho hiệu quả
phản ứng cao nhất.
Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn những các xúc tác khác, chỉ tác dụng lên
những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do đó rất ít
tạo sản phẩm phụ, hiệu suất thu được sản phẩm chính khá cao.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể được điều chỉnh dễ dàng
thậm chí có thể ngừng phản ứng bằng cách tác động vào các yếu tố như nhiệt
độ, pH, hoặc áp suất, nồng độ cơ chất.
Enzyme có cường lực xúc tác cao hơn hẳn xúc tác thông thường, chỉ cần
một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong khoảng
thời gian ngắn.
Enzyme là chất xúc tác do đó không bị mất đi khi phản ứng kết thúc.
1.1.5. Công nghệ enzyme và ứng dụng [4], [12], [14], [28], [31]
Chính vì những ưu điểm trên của enzyme so với chất xúc tác hóa học do
đó việc sử dụng enzyme vào các lĩnh vực sản xuất và đời sống trong những
năm cuối thế kỷ XX đầu thế kỷ XXI rất đa dạng và phong phú. Nhờ đó mà
-7-




những nghiên cứu về enzyme và các ứng dụng của chúng trong thực tiễn sản
xuất đã trở thành ngành công nghệ enzyme.
Cùng với sự bùng nổ của công nghệ sinh học, công nghệ enzyme đã sản

xuất ngày càng nhiều các chế phẩm enzyme và được sử dụng rộng rãi trong
mọi lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, công nghiêp dược phẩm, mỹ phẩm,
công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc và phân bón…
Nhờ có các chế phẩm enzyme mà các quy trình chế biến lương thực, thực
phẩm được cải tiến ở nhiều khâu, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm,
đa dạng hóa các mặt hàng công nghiệp nhẹ, cải thiện đáng kể về năng suất và
chất lượng cây trồng, vật nuôi, biến phế thải thành nguồn thức ăn gia súc giàu
dinh dưỡng, đồng thời tạo nguồn khí đốt phục vụ sản xuất trong sinh hoạt
(biogas), cải tạo nhanh chóng tình trạng ô nhiễm môi trường ở khu vực sản xuất
và khu vực dân cư.
Hiện nay, hàng năm trên thế giới đã sản xuất khoảng trên 300.000 tấn
enzyme, giá trị khoảng trên 500 triệu USD (chủ yếu tập trung ở Châu Âu, Châu
Mỹ và Nhật Bản), đã đáp ứng được nhu cầu sử dụng enzyme của nhiều nước
trên thế giới.
Nguyên liệu để thu nhận enzyme rất đa dạng và phong phú nhưng đa phần
lấy từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Từ tuyến tụy, màng nhầy dạ dày của
động vật có thể thu nhận chế phẩm của enzyme amylase, ligase, protease,
ribonuclease, đặc biệt là thu nhận các enzyme có độ tinh sạch và tính đặc hiệu
cao như enzyme pepsine, trypsine, chymotrypsine. Từ tế bào thực vật này cũng
có thể thu nhận một số enzyme như tách chiết enzyme papain từ nhựa của cây
đu đủ ( carica papaya), chiết enzyme bromelain từ vỏ, lõi, thịt quả của quả dứa,
tách enzyme Ficin từ các cây họ Ficus (sung, vả).
Trong ba nguồn enzyme được trình bày ở phần trên, nguồn enzyme từ vi
sinh vật được quan tâm và sản xuất nhiều nhất không chỉ ở khối lượng mà ở cả
chất lượng các loại enzyme.
-8-

Khoa học nghiên cứu về vi sinh vật chậm hơn khoa học nghiên cứu về
động vật và thực vật. Mãi đến thế kỷ XVIII người ta mới biết về sự tồn tại của
vi sinh vật trong thế giới sinh vật, tuy nhiên về việc ứng dụng các công nghệ có
hoạt động của vi sinh vật thì có từ rất lâu đời. Dựa trên nền tảng đó nên vi sinh
vật ứng dụng đã phát triển rất nhanh đặc biệt là trong thế kỷ XX. Trong đó
công nghệ enzyme từ vi sinh vật đặc biệt phát triển rất mạnh ở thế kỷ XX đầu
thế kỷ XXI. Nguồn enzyme này dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực
vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất.
Nguồn enzyme từ vi sinh vật cũng là nguồn enzyme duy nhất được đưa
vào sản xuất theo quy mô công nghiệp. Khác với động vật và thực vật, cơ thể vi
sinh vật chỉ được cấu tạo từ một tế bào, chính vì cơ thể chỉ được cấu tạo từ một
tế bào nên vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật. Có thể
tóm tắt những ưu điểm của vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme được như sau:
- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn
hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm, đòi hỏi một
khối lượng enzyme tương ứng. Trong khi đó, động vật và thực vật không thể
thực hiện được khối lượng chuyển hóa lớn như vậy. Do đó, vi sinh vật phải
tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn, điều này
cũng đồng nghĩa với khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật hơn hẳn khả
năng tổng hợp enzyme ở động vật và thực vật.
- Hoạt độ enzyme của vi sinh vật cao hơn hoạt độ enzyme được
tổng hợp từ động vật và từ thực vật.
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất cao, trong khoảng thời gian
ngắn ta có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn. Đặc điểm này giúp
ta trong một thời gian ngắn ta thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng
các sản phẩm trao đổi chất cao.
- Đặc điểm quan trọng nhất ở vi sinh vật là chúng là những cơ thể
rất nhỏ bé, ta có thể đưa chúng vào các thiết bị lên men. Chuyển sản xuất
-9-

enzyme bởi vi sinh vật từ hình thức thủ công, sang hình thức công nghiệp hiện
đại với sản phẩm được sản xuất hàng loạt và có kiểm soát.
- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những
nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe các yếu
tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme,
nhiều khi những nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme chỉ là phế liệu của một
ngành sản xuất nào đó. Điều này không những có ý nghĩa về mặt kinh tế
(nguyên liệu rẻ tiền) mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. Chính
vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các
nguồn khác.
- Điểm cuối cùng cũng rất quan trọng là ta hoàn toàn có thể điều
khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất bằng cách điều chỉnh các
điều kiện pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất cảm ứng để điều khiển quá trình
tổng hợp enzyme.
Bảng 1.1: Một số enzyme sản xuất công nghiệp từ các chủng vi sinh vật
Tên enzyme Nguồn vi sinh vật Lĩnh vực sử dụng
α- Amylase Aspergillus oryzae
Bacillus subtilis
Bacillus lichemiformic
Chế biến tinh bột, sản xuất
rượu, bia, tương…

Cellulase Trichoderma viride
Penicilium sp
Phân hủy các chất có chứa
cellulose
Glucoamylase Aspergillus niger

Rhizopus sp
Đường hóa tinh bột, sản xuất
cồn
Lipase Aspergillus niger
Candiala allindracae
Mucor michici
Muror sp
Phân giải dầu mỡ, bột giặt
Pectinase Aspergillus sp
Rhizopus sp
Sản xuất nước trái cây, bia.

-10-




Protease Aspergillus sp
Rhizopus sp
Bacillus subtilis
Bacillus lichemiformic
Bacillus alkalophicloc
Chất tẩy rửa, phân giải
protein thuộc da, sản xuất
bia.
L.Asparaginase E.coli Chữa bệnh bạch huyết
Catalase Aspergillusniger

Phân giải H
2

O
2

Penicillincylase

E.coli Sản xuất penicillin

1.2. ENZYME GLUCOAMYLASE
1.2.1. Giới thiệu chung
Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ
Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở
Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh
vật khác cũng như ở mô động vật [14].
Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao
động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Các glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác
nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng.
Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại
glucoamylase II không có cả hai tinh chất này.
1.2.2. Cơ chế tác động [31]
Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết -1,4 lẫn -
1,6 glucoside của phân tử tinh bột.
-11-





Hình 1.2: Sơ đồ phân giải của glucoamylase [60]
Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết -1,4 lẫn -1,6 glucoside

glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực
xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các
chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa
triển vọng rất lớn.
Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không
khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là
glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O-glucoside là do hoạt động chủ yếu
của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với
cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid,
nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết O-glucoside).
Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin
này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H
+
của phân tử nước làm giải phóng
gốc OH
-
, gốc OH
-
này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên
kết O-glucoside của phân tử cơ chất sẽ bị phá vỡ.
1.2.3. Tính chất của glucoamylase [1], [31]
Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử
thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose.
Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các
liên -1,4 và -1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu,
chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợp
-12-

Glucoamylase
kiểu Rh. delemar
Glucoamylase
kiểu Asp.niger khác nhau
chất lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu
là tinh bột.
Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật
tuy có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau.
Ngay cả các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng
khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc
điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu
với cơ chất và điều kiện hoạt động.
Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và
polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng
sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải
theo cơ chế đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:

Tinh bột hay oligosaccharide 100% glucose


Tinh bột 80-85%glucose +
oligosaccharide
hay oligosaccharide

Enzyme glucoamylase là enzyme ngoại bào thể hiện hoạt độ tối đa ở vùng
pH 3,5-5,5. So với a-amylase thì glucoamylase bền với acid hơn, nhưng lại
kém bền dưới tác dụng rượu etylic, aceton, không được bảo vệ bằng Ca
+2

.
1.2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme
glucoamylase
Đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về sinh tổng hợp GA theo
phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bán rắn trên các chủng
nấm mốc khác nhau. J.M.Zaldivar-Aguero và cộng sự (1997) nghiên cứu
sự ảnh hưởng của phosphor trong quá trình sinh tổng hợp GA của