NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP

1



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG




VÕ PHAN HẢI ÂU




NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT
ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG
QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP


Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM





Cần Thơ, 2009

2



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG




VÕ PHAN HẢI ÂU


Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM




NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT
ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG
QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Ts. NGUYỄN CÔNG HÀ VÕ PHAN HẢI ÂU
MSSV: 2051615
Lớp: CNTP K31


Cần Thơ, 2009



i
LỜI CẢM TẠ
Xin thể hiện lòng biết ơn sâu sắc đến
Thầy hướng dẫn Nguyễn Công Hà đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành biết ơn
Tất cả Quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Cần Thơ đã
giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích để hoàn thành
đề tài luận văn cũng như trang bị cho tôi những kinh nghiệm để bước vào đời.
Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Xin cảm ơn
Tập thể lớp Công nghệ thực phẩm khóa 31 đã giúp đỡ, động viên, góp ý chân thành
giúp bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.
Bạn bè của tôi tại Tp Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập
tại đây.
Kính dâng cha mẹ đã nuôi con khôn lớn

Sinh viên thực hiện

Võ Phan Hải Âu










ii
TÓM LƯỢC
Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu tiếp nối nghiên cứu của Võ Văn Tuấn nhằm tối ưu
hóa quá trình thủy phân dịch nếp có sử dụng chế phẩm enzyme amylase.
Trên cơ sở những kết quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu “Ứng dụng enzyme α-
amylase và glucoamylase và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp”,
trong đề tài này chúng tôi tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố cần thiết cho quá
trình đường hóa nguyên liệu nếp trắng có sử dụng kết hợp chế phẩm enzyme α-
amylase và glucoamylase. Kết quả thu được như sau:
Đối với quá trình đường hóa sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase:
nồng độ enzyme glucoamylase thích hợp nhất là 0,4%, nhiệt độ thích hợp cho quá
trình xử lý enzme glucoamylase là 60
0
C, pH xử lý là 4,0 tương ứng với thời gian sử
dụng glucoamylase thích hợp cho hiệu quả kinh tế cao là 30 phút.


iii

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề..............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................1
1.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về gạo nếp ...........................................................................................3
2.2 Enzyme amylase ...................................................................................................3
2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase .........................................................3
2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase.................................................................4
2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase ......................................5
2.2.4 Hoạt lực của enzyme amylase ..................................................................11
2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase.......................12
2.3 Nấm men..............................................................................................................16
2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men .......................................................16
2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men...............................................17
2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...........................................17
2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp......................................19
2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp..................................................................19
2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu nếp .........................................20
2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp .....................................21
2.5 Quy trình sản xuất .............................................................................................23
2.5.1 Sơ đồ quy trình .......................................................................................23
2.5.2 Thuyết minh quy trình.............................................................................24
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26
3.1 Phương tiện thí nghiệm .....................................................................................26
3.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................26
3.1.2 Nguyên liệu .............................................................................................26
3.1.3 Dụng cụ trang thiết bị ..............................................................................26
3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................26

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu..............................................................................26
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................27
3.3 Bố trí thí nghiệm.................................................................................................27
3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme
glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme
glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng ..........................................................27
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme
glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme
glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. .........................................................29
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme
glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme
glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng...............................................................31
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme
glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme
glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng...............................................................35


iv
CHƯƠNG 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................39
5.1 Kết luận................................................................................................................39
5.2 Đề nghị .................................................................................................................39
5.3 Quy trình thủy phân tinh bột đề nghị ..............................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................41



v
DANH SÁCH BẢNG, HÌNH
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp.............................................................3

Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6
Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6
Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men ..............................................16
Bảng 4.1 Hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ enzyme glucoamylase.......32
Bảng 4.2 Hàm lượng đường khử khi đường hóa bằng enzyme glucoamylase ở các
mức nồng độ enzyme và nhiệt độ khác nhau. .......................................................35
Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase .........................................4
Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột....................................5
Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin ..............9
Hình 2.5 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột.........................................10
Hình 2.6 Tổng quát hóa quá trình thủy phân tinh bột của amylase........................11
Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................17
Hình 4.1 đồ thị biểu hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ
enzyme.................................................................................................................32
Hình 4.2 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với pH và nồng độ
enzyme.................................................................................................................33
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo nhiệt độ và nồng
độ enzyme glucoamylase xử lý.............................................................................36
Hình 4.4 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với nhiệt độ và nồng độ
enzyme……………………………………………………………………………37

1
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Rượu vang là một thức uống có độ cồn thấp, có hương vị đặc trưng của từng loại
nguyên liệu tạo thành, điều đặc biệt là rượu vang có độ cồn thấp, chỉ vào khoảng từ
11% cho đến 14%, so với rượu mạnh là từ 40% cho đến 45%. Vì vậy nếu sử dụng
rượu này một cách điều độ, vừa phải thì rất có lợi cho sức khỏe.
Ở điều kiện nước ta, ngoài các loại rượu vang được sản xuất bằng phương pháp lên
men dịch nước ép trái cây như nho, khóm,…các nhà sản xuất còn áp dụng trên nhiều
loại nguyên liệu khác nhau, chẳng hạn gạo nếp than, gạo nếp trắng,… nhờ đó sản
phẩm rượu vang ở nước ta ngày càng đa dạng, phong phú. Trong đó sản phẩm rượu
từ gạo nếp trắng vừa cho sản phẩm có hương thơm đặc trưng vừa là nguyên liệu được
trồng phổ biến ở nước ta nên có giá thành tương đối rẻ rất thích hợp cho việc đi sâu
nghiên cứu cho sản phẩm này.
Ngày nay, với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai
đoạn đường hoá và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như đảm bảo chất

lượng rượu vang thành phẩm sẽ giảm chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và giá trị
dinh dưỡng của sản phẩm này.
1.2 Mục tiêu đề tài
Như đã biết trong công nghệ sản xuất rượu nếp, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến
chất lượng và hiệu suất thu hồi rượu thành phẩm như các yếu tố tối ưu cho hoạt động
của enzyme sử dụng, loại và chất lượng nguyên liệu, loại nấm men sử dụng… Trên
cơ sở kế thừa những thành quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu của Võ Văn Tuấn,
chúng tôi tiếp tục thực hiện để tìm ra các yếu tố tối ưu cho quá trình đường hóa có sử
dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase. Vì vậy, đề tài này tập trung nghiên
cứu hướng đến những mục tiêu chính sau:
Tìm ra pH, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme glucoamylase cho quá trình
đường hóa.
Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích hợp cho quá trình đường
hóa.
Bổ sung kết quả đạt được vào quy trình sản xuất để thu được sản phẩm rượu có chất
lượng cao góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho sản phẩm.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường
khử sinh ra trong quá trình đường hóa.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng
đường khử sinh ra trong quá trình đường hóa.


2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về gạo nếp
Nguồn gốc
Gạo nếp là loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ. Hạt gạo này có màu
đục và có mùi thơm đặc trưng.
Thành phần hóa học

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp
Thành phần Hàm lượng (%)
Nước 14
Protein 8,2
Lipid 1,5
Glucid 74,9
Acid hữu cơ 0,6
Tro 0,8
(Nguyễn Đức Lượng, 2003)
2.2 Enzyme amylase
2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase
Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật
Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song
chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tượng có thể
dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase do chúng có khả năng tích trữ
một lượng lớn enzme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay, do có ưu thế về
nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều
loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các loại amylase. Những chủng vi sinh vật tạo
nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau
và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ
enzyme khác nhau.
Có nhiều nguồn thu enzyme amylase như các giống nấm sợi Aspergillus,
Rhizopus…. Nhiều loại thuộc giống này như Asp. Oryzae, Asp. Niger,…(Nguyễn
Đức Lượng, 2006)


3
2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase
Dựa theo tính chất và cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột. người ta xếp enzyme
amylase thành hai nhóm là endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme

ngoại phân). Chúng gồm sáu loại:
Endoamylase (enzyme nội phân) gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh
Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành hai loại, khử trực tiếp là pullulanase (α-
dextrin-6-glucanohydrolase), khử gián tiếp là tranglucosidase và amylase-1,6-
glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết trong chuỗi polysaccharide.
Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm β-amylase và glucoamylase. Đây là những
enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.















Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase
(Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2003)



Amylase
Khử gián tiếp là tranglucosidase
và amylase-1,6-glucosidase)

Khử trực tiếp là pullulanase (α-
dextrin-6-glucanohydrolase)
β-amylase
Endoamylase
Exoamylase
Glucoamylase
Enzyme khử
nhánh
α-amylase


4
2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase


Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột
2.2.3.1 α-amylase
Đặc tính
Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn khác
nhau có thành phần amino acid khác nhau. Enzyme α-amylase khá giàu tyrosine,
tryptophan nhưng ít methionine, có khoảng 7 ÷ 10 gốc cysteine.
Ion Ca
2+
là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình
thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò
duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến
tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu enzyme α-amylase bị mất
ion Ca
2+

thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất.
Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như Cl
-
> Br
-
> I
-
.
Chúng bị kìm hãm bởi
ion kim loại nặng như Cu
2+
, Hg
2+
.
Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. Điều
kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau thì
không giống nhau. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)




5


Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau
Nguồn gốc Ph tối thích Nhiệt độ tối thích
Malt
5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75
Vi khuẩn
5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60

Nấm mốc
6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70
(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)
Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau
Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu)
Nhiệt độ
Malt Nấm mốc Vi khuẩn
65
100 100 100
70
100 52 100
75
58 3 100
80
25 - 92
85
1 - 58
90
- - 52
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin
Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị
trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, enzyme này được gọi là enzyme
nội phân (endo enzyme). Enzyme α-amylase không những có khả năng phân hủy hồ
tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân cắt thành oligosaccharide hay
còn gọi là polyglucose (6 ÷ 7 gốc glucose), sau đó các oligosaccharide lại tiếp tục bị
phân cắt nên chuỗi ngắn hơn và tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác
dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylase là 13% glucose và 87% maltose.
Tác dụng của amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo

thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và


6
isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1,6-glycoside ở mạch nhánh
của phân tử amylopectin.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase
+ Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số cơ chất bị thuỷ phân nhánh tạo thành
một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.


+ Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thuỷ
phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose. Các chất này bị thuỷ phân rất chậm
bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosacharide. Dưới tác dụng của α- amylase,
amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose.
Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm các maltotetrose,
maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân của amylose
chứa 13% glucose và 87% maltose.









Dextrin phân tử lương thấp
Tinh bột

α-Amylase

Di và monosaccharide
Dextrin
Tetra và trimaltose
Amylose
Oligosaccharide
Polyglucose
Maltotetrose
Maltotriose
Maltose
α-Amylase
Hình 2.3 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin

α-Amylase


7
2.2.3.2 β-amylase
Đặc tính
Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, -
COOH, cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. Enzyme β-amylase chỉ phổ biến
trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nẩy mầm. Trong vi khuẩn không có β-
amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định.
Enzyme β-amylase rất bền khi không có Ca
2+
, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như:
Cu
2+
, Hg

2+
, acetanic, iod, ozon. pH tối thích trong dịch bột thuần khiết là 4 ÷ 6, trong
dung dịch nấu là 5 ÷ 5,6. Nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 50
0
C,
trong dung dịch nấu là 60 ÷ 65
0
C. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 70
0
C.
Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin
Enzyme β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glycoside trong tinh bột,
glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự gốc maltose một ở đầu không
khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại
phân (exoenzyme).
Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54 ÷ 58%
amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có 20 ÷ 25 phân tử
glucose nên sau khi thủy phân tạo 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4
glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn
lại là dextrin phân tử lớn. Các dextrin này có chứa nhiều liên kết α-1,6 glycoside bắt
màu đỏ tím với iod.

8

Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%)
Nếu sử dụng đồng thời α-amylase và β-amylase thì có thể thủy phân đến 5% tinh bột.

Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin
2.2.3.3 γ-amylase (glucoamylase)
Đặc tính
Enzyme γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự
tham gia của các enzyme amylase khác. Nó thủy phân các polysaccharide có phân tử
lớn nhanh hơn so với polysacchacaride có phân tử nhỏ.
So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của
rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng Cu
2+
,Hg
2+
. Enzyme này có
trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn .
Enzyme này hoạt động tốt ở 50
0
C. Hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5. (Bùi Thị
Quỳnh Hoa, 2004)
Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin
Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside
trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose, là enzyme ngoại phân (exo
enzyme). Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose

một. Chúng không thủy phân được các dextrin vòng.
Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo thành glucose còn có thể được tạo thành
oligosaccharide. Ngoài ra, γ-amylase còn có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3
glycoside.
β-amylase


9

Amylose Amylosepectin
Hình 2.5 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột
2.2.3.4 Oligo-1,6-glucosidase
Enzyme oligo-1,6-glucosidase thủy phân liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose,
panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi
sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm (malt, thóc mầm). Ngoài oligo-
1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylosepectin-1,6-
glucosidase và α-dextrin-1,6-glucosidase. Cả hai loại enzyme này đều thủy phân
dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase nên trong dịch thủy phân có nhiều
maltose hơn. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 40
0
C và pH tối
thích là 5,1.
2.2.3.5 Pullulanase
Enzyme pullulanase thủy phân các liên kêt α-1,6-glycoside trong tinh bột và
glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. Enzyme này có khả năng thủy phân
những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-
glycoside. pH tối thích cho enzyme này hoạt động là 5,0 và nhiệt độ là 47,5
0
C
2.2.3.6 Transglucosidase

Enzyme transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính
transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây
sự nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân
maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltotriose và panose, tức là
nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử
glucose khác bằng liên kêt α-1,6-glucosid để tạo thành panose hoặc izomaltose.



10

Hình 2.6 Tổng quát hóa quá trình thủy phân tinh bột của amylase
2.2.4 Hoạt lực của enzyme amylase
Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của
nó. Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả
năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các
chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase. Vì
vậy, hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong
chế phẩm. Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương
pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau. Để xác định hoạt độ của các
amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:
• Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác
dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của
dung dịch giảm dần.
• Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có
amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod.
• Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng
lên cơ chất. Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:
Hoạt độ của enzyme α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có
trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo

cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng
máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của α-


11
amylase là lượng enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân tử
lượng khác nhau ở 30
0
C trong một giờ.
Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến
glucose. Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành. Glucose trong
hỗn hợp các đường thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu. Đơn vị
hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở
30
o
C và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp
Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải
phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucose oxydase).
Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột
đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1
giờ ở 30
o
C và pH thích hợp làm phân giải được 1g tinh bột thành đường khử khi mức
độ thủy phân cơ chất không vượt 30%.
2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase
2.2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng
Khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng
độ enzyme. Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme
bằng biểu thức:
v = k.[E]

Trong đó: v: vận tốc phản ứng
k: hằng số tốc độp phản ứng
[E]: nồng độ enzyme sử dụng
Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều. Tuy nhiên
khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm lại.
2.2.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Phản ứng khi có enzyme xảy ra theo ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn
này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng
độ cơ chất.
Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn
không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.
Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được
xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Ở trường hợp này xảy ra ba
giai đoạn khác biệt:


12
Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc
tuyến tính với nồng độ cơ chất.
Ở giai đoạn kế tiếp tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc
vào nồng độ cơ chất.
Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc
độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng thêm. Ở giai đoạn này các
enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được.

E + S ES P + E (1)
Trong đó:
K1: hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES
K2: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại chất ban đầu và enzyme

K3: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P
Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ ES càng lớn vận
tốc phản ứng càng lớn.
Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất theo
chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian phản ứng thuỷ phân của
amylase.
2.2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng như các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme amylase
tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên do enzyme amylase cũng có bản chất là protein nên
nó kém bền đối với nhiệt độ. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao, enzyme
amylase cũng không ngoại lệ. Nhiệt độ vô hoạt tùy thuộc vào loại và nguồn gốc của
enzyme.
Tốc độ phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tại nhiệt độ mà enzyme có thể
tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt độ tăng 10
0
C. Tuy nhiên tốc độ
phản ứng tăng đến nhiệt độ nhất định. Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm
và enzyme có thể bị vô hoạt.
Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích của
enzyme. Mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc nguồn gốc
của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính của enzyme bị giảm,
khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của enzyme
phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của có các chất, kim loại, pH và chất bảo vệ. Ta
K1
K3
K2


13
thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng

theo yêu cầu của chế biến.
2.2.5.4 Ảnh hưởng của pH
Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường. Do pH ảnh hưởng đến mức
độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme – cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến
độ bền của enzyme.
Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối
thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung
tính, chỉ một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh.
2.2.5.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành trạng
thái hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có
bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là:
- Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa
nhóm, chuyển gốc hóa học.
- Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm
hoạt động của enzyme.
- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm
loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình
thành trung tâm hoạt động.
- Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65 A
0
(Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
) và

các anion Cl
-
, Br
-
, I
-
cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa các
ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme với
cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của
enzyme.
- Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua
nồng độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme.
2.2.5.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm
Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng
của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ
có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch
và không thuận nghịch. Trong chất kìm hãm thuận nghịch, ta có thể phân biệt hai
dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh.


14
Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong
trường hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung
tâm hoạt động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme.
Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với
enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của
phân tử enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng.
Kiềm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản
ứng enzyme tham gia có thành chất kìm hãm tốc độ thể tạo của chính phản ứng đó.
Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu

S
1
+ S
2
P
1
+ P
2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P
1
và P
2
tương
đương với S
1
và S
2
. Trong trường hợp như thế P
1
+ P
2
được coi như chất kìm hãm với
S
1
và S
2
.
Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở
thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng:

E + S ES E + P
Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó
trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức
hệ này coi như chất kìm hãm.
ES + S ESS
Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu
2+
, Ag
+
.
2.2.5.7 Ảnh hưởng của cơ chất
Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột. Tinh bột là nhóm carbohydrate thực vật có
chủ yếu trong các loại ngũ cốc như gạo, nếp, ngô, trong các loại củ như khoai lang,
khoai mì, sắn,…Công thức tổng quát của tinh bột là (C
6
H
12
O
6
)
n
. Tinh bột được cấu
tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất
dự trữ năng lượng quan trọng. Các loại tinh bột đều có chứa từ 20 ÷ 30% amylose và
70 ÷ 80% amylosepectin.
Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1000
phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn
dài không phân nhánh.
Amylosepectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6000
phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo

nhánh.


15
Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 85
0
C.
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị
phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và
đường hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian
dextrin, sau đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và
glucose.
Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành
phần amylose và amylosepectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột.
Chính vì vậy để quá trình thủy phân đạt hiệu quả ta cần chọn loại enzyme amylase và
nhiệt độ hồ hóa phù hợp với loại nguyên liệu tinh bột.
2.3 Nấm men
2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men
Nấm men có cấu tạo đơn bào. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như
hình hình cầu, hình elip, hình trứng,…Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8
÷ 15µm.
Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Thành phần Hàm lượng (%)
Carbon 49,8
CaO 12,4
Nitro 6,7
Hydro 3,54
P
2

O
5
2,34
K
2
O 0,04
SO
3
0,42
MgO 0,38
Fe
2
O
3
0,035
SiO 0,09
(Nguyễn Đức Lượng, 1996)


16
2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men
Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một
chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ.
Giai đoạn a (giai đoạn tiền phát) : giai đoạn này tế bào nấm men làm quen với
môi trường, sinh khối chưa tăng.
Giai đoạn b (giai đoạn phát triển logarit): đây là giai đoạn phát triển rất nhanh
của tế bào nấm men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân.
Trong giai đoạn này có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men.
Giai đoạn c (giai đoạn ổn định): số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc
độ sinh sản bằng tốc độ chết.

Giai đoạn d (giai đoạn chết): số lượng tế bào nấm men giảm dần do tốc độ
chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản chậm lại.

Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men
2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang
Trong sản xuất cồn, rượu vang và bia người ta thường sử dụng chủng nấm men
Saccharomyces, chủng này được phân chia thành các dạng:
Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt
một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết
thúc. Theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành
chuỗi. Đối với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 28
0
C.
Nấm men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường lên men, chúng không
tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men
xít, bám chắc ở đáy thùng. Nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 10
0
C.
Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α-
galactosidase lên men hoàn toàn đường rafinose. Còn nấm men nổi thì chỉ có một số
ít chủng có khả năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO
2
.
a
b
c
d


17

Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO
2

thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù. Ví dụ: nấm men dùng
trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng
thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng.
Các nòi nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ
thích hợp 18 ÷ 25
0
C. Ở 35
0
C, sinh sản của chúng bị ức chế, ở 40
0
C sinh sản bị ngừng
hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16
0
C sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện lý
hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn
đến quá trình sống của nấm men.
Ngày nay trong công nghệ sản xuất rượu vang, người ta còn sử dụng các chủng nấm
men như: Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis (Osterwalder) (Lê
Minh Châu, 2007). Các chủng nấm men này có tốc độ lên men mạnh mẽ, tạo ra các
sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol. Đặc trưng của nấm men vang là có hình elip hoặc
elip kéo dài. Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng cách nảy chồi; trong
điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử (Nguyễn Đức Lượng,
2003).
Saccharomyces vini: đây là tên dùng phổ biến hiện nay, trước đây người ta gọi là
Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là
Saccharomyces cerevisiae Hansen. Trong quá trình lên men nước quả, nấm men này
sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là đường, cồn và acid hữu cơ; có tác nhân sinh

trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit, tiamin và piridoxin; ngoài ra chúng còn
có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và
các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc trưng riêng biệt. Nhiều nòi của nấm
men này trong lên men tạo được một lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích. Ở
giai đoạn cuối của quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong
rượu. Sau đó chúng thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết
rất nhanh.
Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả
năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng cồn tới
18 độ cồn. Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccarose, maltose và
1/3 rafinose và không lên men được lactose, pectose (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Loại nấm men thường được sử dụng trong sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces
cerevisiae. Loại nấm men này có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như
glucose, fructose, saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau
như gạo, nếp, ngô, khoai, sắn. Nấm men này có thể lên men tốt với lượng đường
trong dung dịch từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ rượu trong dịch lên men từ
10 ÷ 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 32
0
C.


18
Yêu cầu đối với nấm men rượu vang:
 Khả năng lên men cao
 Chịu được nhiệt độ thấp
 Bền với etanol và nồng độ đường cao.
2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp
2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp
Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra
dễ dàng hơn.

Đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể tích. Khi nấu
tinh bột với nước đến nhiệt độ 40
0
C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng
nhiệt độ lên thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất
gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt
tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần. Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh bột
tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột . Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị
phá vỡ. Điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp
giữa các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành
những mạng, giữa các mạng là amylose và amylosepectin .
Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết
hydro. Ngoài các liên kết trên trong tinh bột còn có các liên kết khác chắn chắn hơn
(do sự xoắn mạch của các mạch amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính
hiện tượng này làm cho quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một
nhiệt lượng cần thiết.
Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu hạt, người ta thường bổ sung một
lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu
cầu.
Khi làm nguội, dung dịch amylosepectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 55
0
C chúng
biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng. Đối với dung dịch
amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt
nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Do đó
làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm
nguội nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 62
0
C và đường hoá. Một biện pháp kĩ thuật thường
dùng là sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu. (Bùi

Thị Quỳnh Hoa, 2004)