Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ân đến Giáo sư, Tiến sĩ TRẦN LINH
THƯỚC, người đã dạy dỗ và tạo điều kiện tốt nhất cho em được học tập và
hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ VÕ MINH TRÍ, Tiến sĩ ĐẶNG
THỊ PHƯƠNG THẢO và Tiến sĩ TRẦN VĂN HIẾU vì đã giúp đỡ em trong suốt
quá trình nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn chị KIM HẰNG, chị PHƯƠNG HIẾU, anh
THANH HÒA, bạn VĂN ĐỨC, các em MAI PHƯƠNG, TUYẾT HUỆ, HƯƠNG
GIANG cùng tất cả các anh chị, các bạn và các em trong Bộ môn Công nghệ
Sinh học Phân tử & Môi trường, Phòng Thí Nghiệm Công nghệ Sinh học Phân
tử và Trung tâm Khoa học & Công nghệ Sinh học đã động viên và giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Và trên hết, con cảm ơn BA, MẸ và gia đình đã luôn ở bên con, nuôi
nấng, dạy dỗ, yêu thương và ủng hộ để con có được ngày hôm nay. BA, MẸ và
gia đình sẽ luôn là chỗ dựa vững chắc và là niềm tự hào của con.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011.
Nguyễn Thị Mỹ Trinh
- 1 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một
protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể
nhƣ cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì và tăng sinh tế bào
thần kinh, chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích

thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trƣởng của
tế bào cơ mềm, chữa lành vết thƣơng và sửa chữa mô…
Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang đƣợc quan tâm nghiên cứu để ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2
đang đƣợc sử dụng nhƣ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi
ngƣời. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng
làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng đƣợc các hãng mỹ phẩm tin tƣởng
và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học,
việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn
bệnh nhƣ bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo do phẫu thuật, chữa
bệnh viêm nha chu…
Trƣớc đây, sản phẩm FGF-2 thƣờng đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết từ các
dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phƣơng pháp này đảm bảo về hoạt
tính của sản phẩm nhƣng sản lƣợng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những
nhƣợc điểm trên, ngƣời ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất
nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và
không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ
E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào
động vật.
Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu đƣợc nhập từ các công ty nƣớc ngoài nên giá
thành rất cao (1mg protein FGF-2 ngƣời đƣợc sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng
1260 USD, ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2
trong nƣớc nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần đƣợc
quan tâm đầu tƣ.
- 2 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản
xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm tìm ra phƣơng án
sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nƣớc. Tuy nhiên, một

trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế bào chủ là protein thƣờng đƣợc
tạo ra dƣới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức
tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này đƣợc thực hiện với mục đích xây dựng quy trình
sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng
tan trong tế bào chất. Đây là hƣớng chiến lƣợc hiệu quả và triển vọng cho phép sản
xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản
phẩm.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:
- Tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF có khả năng biểu hiện vƣợt mức
protein FGF-2 tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF.
- Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít nhằm thu nhận FGF-
2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli.
- Chứng minh hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ
hợp.
- i -

Luận văn thạc sĩ sinh học
MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2 4
1.1.1. Họ nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF 4
1.1.2. Cấu trúc của FGF-2 4

1.1.3. Chức năng của FGF-2 7
1.1.4. Ứng dụng của FGF-2 8
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 13
1.2.1. Giới thiệu chung 13
1.2.2. Một số hệ thống biểu hiện ở E. coli 16
1.2.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli 18
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP 21
2.1. VẬT LIỆU 22
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 22
2.1.2. Hóa chất 22
2.1.3. Môi trƣờng 25
2.1.4. Vật liệu sinh học 26
2.2. PHƢƠNG PHÁP 28
2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-FGF mang gen mã hóa protein FGF-2 28
2.2.2. Cấu trúc chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-
FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) 36
2.2.3. Xác nhận sự biểu hiện FGF-2 dạng tan trong tế bào chất E. coli
BL21(DE3) 36
2.2.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận
protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 37
2.2.5. Kiểm tra hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ
hợp [23] 40
2.2.6. Các phƣơng pháp phân tích protein 41
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 46
3.1. CẤU TRÚC VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF MANG GEN MÃ HÓA
PROTEIN FGF-2 47
- ii -

Luận văn thạc sĩ sinh học
3.1.1. Thu nhận gen fgf 47

3.1.2. Thu nhận vector pET-19b 48
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pET-FGF 49
3.1.4. Chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET-FGF 50
3.2. CẤU TRÚC CHỦNG BIỂU HIỆN E. coli BL21(DE3) MANG VECTOR TÁI
TỔ HỢP pET-FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) 54
3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng
pháp hóa biến nạp 54
3.2.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF 55
3.3. XÁC ĐỊNH SỰ BIỂU HIỆN FGF-2 DẠNG TAN TRONG TẾ BÀO CHẤT
E. coli 55
3.4. BƢỚC ĐẦU LÊN MEN BẰNG HỆ THỐNG LÊN MEN Ở QUY MÔ 1 LÍT
ĐỂ THU NHẬN PROTEIN FGF-2 TÁI TỔ HỢP DẠNG TAN 57
3.5. KIỂM TRA HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ TĂNG SINH DÒNG TẾ BÀO
3T3 CỦA FGF-2 TÁI TỔ HỢP 60
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 63
4.1. KẾT LUẬN 64
4.2. ĐỀ NGHỊ 64
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 69
- iii -

Luận văn thạc sĩ sinh học
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Amp Ampicillin
Amp
r
Ampicillin resistance

APS Alkaline Phosphatases
bp Pase pair
CBB Coomassie Brilliant Blue
cDNA Complementary Deoxyribose Nucleic Acid
DCW Dry cell weight
dH
2
O Distilled water (nƣớc cất)
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMEM/F12 Dulbecco’s Modifed Eagle’s Medium and Ham’s F12 medium
DNA Deoxyribose Nucleic Acid
dNTP DeoxyNucleotide TriPhosphate
DTT Dithioerythritol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid
FBS Fetal Bovin Serum
fgf Fibroblast Growth Factor Gene
FGF Fibroblast Growth Factor
FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor
HRP Horseradish peroxidase
iFGF Intracellular Fibroblast Growth Factor
IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside
Kan Kanamycin
Kan
r
Kanamycin resistance
kDa kilo Dalton
LB Môi trƣờng Luria-Bertani
MCS Multiple Cloning Site
mRNA Messenger Ribose Nucleic Acid

- iv -

Luận văn thạc sĩ sinh học
OD Optical Density
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PBS Phosphate Buffered Saline
PBST Phosphate Buffered Saline Tween
PCA Phenol Chloroform isoamylalcohol
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribose Nucleic Acid
RNase Enzyme thuỷ giải RNA
rpm Round Per Minute
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel
TEMED Tetramethylethylenediamine
- v -

Luận văn thạc sĩ sinh học
DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước
khác nhau 5
Hình 1.2. Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2 6
Hình 1.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E. coli 15
Hình 1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E. coli 16
Hình 1.5. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG 17
Hình 2.1. Plasmid pFGF 26
Hình 2.2. Plasmid pET-19b 27
Hình 2.3. Các thang chuẩn 27

Hình 2.4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF 28
Hình 2.5. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men 37
Hình 2.6. Hệ thống thiết bị lên men 38
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng 43
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pFGF 47
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pET-19b 49
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 49
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 50
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E. coli
DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc 51
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp bằng PCR plasmid 52
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen fgf trên vector tái tổ hợp pET-FGF 53
Hình 3.8. Kết quả biến nạp plasmid pET-FGF vào tế bào E. coli BL21(DE3) 54
Hình 3.9. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF 55
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện FGF-2 bằng điện di SDS-PAGE
và lai Western Blot với kháng thể kháng FGF-2 56
Hình 3.11. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men 57
- vi -

Luận văn thạc sĩ sinh học
Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm
lên men. 58
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế
bào bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao 59
Hình 3.14. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên trạng thái tế bào 3T3 61
Hình 3.15. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên sự tăng sinh của tế bào 3T3 61
- vii -

Luận văn thạc sĩ sinh học

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau 8
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS – PAGE 41
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pFGF 47
Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pET-19b 48
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2
trong pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men 59
Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF sau
quá trình lên men 60
- 3 -

Luận văn thạc sĩ sinh học












CHƢƠNG I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- 4 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
1.1. NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2
1.1.1. Họ nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi đƣợc Amerlin tìm thấy lần đầu tiên trong
dịch chiết tuyến yên vào năm 1973 [4]. Năm 1974, Gospodarowicz công bố tìm thấy
nhân tố tăng trƣởng có tác dụng làm tăng sinh nguyên bào sợi trong dịch chiết não bò.
Sau đó, Gospodarowicz đã tiến hành phân đoạn dịch chiết này trong pH acid và base
[7]. Thí nghiệm này đã cô lập đƣợc hai dạng FGF khác nhau tƣơng ứng với từng phân
đoạn pH. Nhân tố tăng trƣởng thu nhận đƣợc ở pH acid gọi là FGF-1 và nhân tố tăng
trƣởng thu nhận đƣợc ở phân đoạn base gọi là FGF-2. Ngày nay, trên 23 nhân tố tăng
trƣởng đã đƣợc tìm thấy và đƣợc nghiên cứu về chức năng, cấu trúc,… Các nhân tố
này bao gồm:
- FGF1- FGF10 là các nhân tố tăng trƣởng có liên kết với thụ thể FGFR. Trong
đó, FGF-1 (hay aFGF) có kích thƣớc 16kDa là nhân tố tăng trƣởng có tính acid và
FGF-2 (hay bFGF) có kích thƣớc 18kDa là nhân tố tăng trƣởng có tính base.
- FGF11, FGF12, FGF13, FGF14 là các FGF tƣơng đồng và còn có tên gọi
khác là FHF1-FHF4 (FGF homologous factors 1-4), chúng không bám vào FGFR
nhƣng tham gia vào quá trình hoạt hóa nội bào, nên còn đƣợc gọi là iFGF (intracellular
FGF).
- FGF16 đến FGF23 là những protein mới và chƣa biết rõ đặc điểm.
Họ nhân tố tăng trƣởng không những tƣơng đồng cao về trình tự amino acid (13
-71%), cấu trúc gen cũng đƣợc bảo tồn cao giữa các loài động vật có xƣơng sống. Các
protein thuộc họ này có ái lực cao với heparan sulfate proteoglycan. Sự tƣơng tác với
heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong bốn receptor của FGF trên bề mặt tế bào [13].

1.1.2. Cấu trúc của FGF-2
FGF-2 đƣợc tìm thấy đầu tiên là dạng protein có 146 amino acid đƣợc phân lập
từ tuyến yên. Khi FGF-2 cDNA đƣợc tạo dòng, codon AUG đƣợc xác định nhƣ codon
mở đầu cho quá trình dịch mã của protein gồm 155 amino acid và không có bất cứ
codon AUG nào khác trong chuỗi polypeptide.
- 5 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não lợn, não chuột, gan, phôi
ngƣời, tuyến tiền liệt và một vài dạng vi môi trƣờng, ngƣời ta nhận thấy phân tử
protein FGF-2 trên thực tế có thể dài hơn hoặc ngắn kích thƣớc dự đoán. Dạng ngắn
hơn là kết quả của quá trình phân cắt phân tử FGF-2 155 amino acid. Sự hình thành
dạng trọng lƣợng phân tử lớn (196, 201 và 210 amino acid) đã đƣợc chứng minh bằng
phƣơng pháp thống kê phiên mã/dịch mã in vitro cho thấy codon CUG ở đầu 5’ so với
codon AUG (đƣợc sử dụng là codon mở đầu cho quá trình dịch mã của dạng 155
amino acid) đƣợc sử dụng làm codon mở đầu cho quá trình dịch mã của các dạng có
trọng lƣợng phân tử lớn (Hình 1.1) [5].

Hình 1.1. Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước khác nhau
(18; 22; 22,5; 24 và 34 kDa) [13].
Quá trình dịch mã khác nhau xảy ra do tồn tại các vị trí gắn ribosome khác nhau
trong mRNA của FGF-2. Khi biểu hiện FGF-2 cDNA trong tế bào và phân tách bằng
kỹ thuật SDS-PAGE, dạng mở đầu bằng AUG và 3 dạng mở đầu bằng CUG cho thấy
trọng lƣợng phân tử lần lƣợt là 18; 22; 22,5; và 24kDa. Dạng mở đầu bằng codon
CUG (22; 22,5 và 24 kDa) đƣợc tìm thấy chủ yếu trong nhân, trong khi đó dạng mở
- 6 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
đầu bằng codon AUG (18kDa) đƣợc tìm thấy nhiều trong tế bào chất. Tuy nhiên, điều
này còn tùy thuộc vào đặc điểm của tế bào thử nghiệm và mức độ biểu hiện của FGF-2

[5]. Ngoài những protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau nhƣ trên, một dạng FGF-2
hiếm gặp hơn cũng đƣợc tìm thấy có kích thƣớc 34kDa (Hình 1.1) [13]. Trong các
dạng FGF-2, FGF-2 có khối lƣợng phân tử 18kDa là dạng cơ bản vì trình tự amino
acid của dạng này có trong các dạng còn lại.
Phân tích FGF-2 tái tổ hợp bằng chiếu xạ tia X cho thấy protein này có dạng
hình cầu, đƣờng kính khoảng 4nm với lõi kị nƣớc ở giữa và những vùng tích điện trên
bề mặt. Phần lớn cấu trúc của FGF-2 có chứa 12 phiến β đối song và đƣợc sắp xếp
thành 3 phần có cấu trúc đối xứng với nhau, cấu trúc gấp cuộn của 12 phiến β này tạo
thành lõi kị nƣớc ở giữa (Hình 1.2) [12].

Hình 1.2. Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2[12].
Các vị trí tích điện dƣơng (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên
protein FGF-2 đƣợc xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF. Vị trí gắn receptor
của protein đƣợc tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên
protein FGF-2. Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có 2 gốc cysteine (Cys-
78 và Cys-96) đƣợc lộ ra ngoài và 2 gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101) đƣợc
quay vào phía bên trong lõi kị nƣớc. Do đó, 4 cysteine có thể tạo thành 2 cầu nối
- 7 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
diusulfide. Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa 2 cặp
cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối [13].
Phân tử FGF-2 tích điện dƣơng ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng
lƣợng trong phân tử, làm hoạt tính, cấu trúc của protein không ổn định. Những phân tử
tích điện âm nhƣ heparin tƣơng tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn
định hơn, bảo vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng nhƣ tác động của
protease. Do đó, có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt
tính của FGF-2. Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng
gắn vào các vị trí lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein
này giống nhƣ heparin. Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn đƣợc việc

hình thành cầu nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein [13].
Ngoài ra, trên FGF-2 có hai vị trí gắn với FGFR:
- Vị trí gắn sơ cấp đƣợc tạo bởi các amino acid Y24, E96, N101, Y103, L140 và
M142, tạo thành một nhóm kị nƣớc trên bề mặt FGF2
- Vị trí gắn thứ cấp đƣợc tạo bởi các amino acid K110, Y111, và W114 trong
trình tự mạch thẳng của FGF-2 (amino acid 106-115) [21].
1.1.3. Chức năng của FGF-2
Họ nhân tố tăng trƣởng FGF là một họ protein đa chức năng. Trong quá trình
phát triển phôi, FGF có vai trò trong sự tăng sinh tế bào, di chuyển và biệt hóa. Trong
cơ thể trƣởng thành, FGF là yếu tố cân bằng nội mô. Một nhóm nhỏ protein thuộc họ
FGF biểu hiện ở mô trƣởng thành có vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu thần
kinh trong hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi [5].
FGF-2 là một phân tử góp phần vào quá trình hình thành mạch máu mới từ
mạch máu sẵn có (angiogenesis) trong in vivo và in vitro, kích thích sự tăng trƣởng của
tế bào cơ mềm, chữa lành vết thƣơng và sửa chữa mô. Thêm vào đó, FGF-2 cũng có
thể kích thích các tế bào máu và cũng có chức năng quan trọng trong sự biệt hóa và
đóng vai trò trong chức năng của nhiều hệ cơ quan (Bảng1.1).

- 8 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
Bảng 1.1. Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau [5].
Cơ quan
Chức năng
Não
Duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh
Mạch máu
Tạo mạch và giúp tăng sinh tế bào cơ trơn
Giúp hạn chế xơ vữa và điều hòa áp lực máu
Phổi

Ngăn chặn xơ hóa
Chi
Giúp phát triển chi
Cơ
Hình thành mô cơ, đặc biệt là trong quá trình phát triển
phôi
Xƣơng
Chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng
Quá trình tạo máu
Kích thích hình thành bạch cầu
Cơ quan sinh sản
Góp phần vào quá trình trƣởng thành của tinh trùng
Mắt
Duy trì hoạt động của tế bào thu nhận ánh sáng và truyền
tín hiệu thần kinh
Da
Sửa chữa mô
Ảnh hƣởng đến hoạt động của tế bào tạo sắc tố da
Định hình sự phát triển của tế bào sừng
1.1.4. Ứng dụng của FGF-2
Là một protein đa chức năng, FGF-2 đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực
bao gồm nuôi cấy tế bào, mỹ phẩm và y-sinh học.
a) Ứng dụng của FGF-2 trong việc nuôi cấy tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chƣa biệt hóa, có khả năng phân chia không hạn
định trong điều kiện nuôi cấy phù hợp và biệt hóa thành các tế bào có hình dạng, chức
năng chuyên biệt nhƣ tế bào cơ tim, tế bào da, tế bào thần kinh… Các tế bào gốc hoạt
động nhƣ một hệ thống sửa chữa cho cơ thể, bù đắp cho tế bào chết đi trong suốt cuộc
đời của mỗi sinh vật. Nhƣ vậy, có thể nói tế bào gốc là nguồn gốc khởi đầu cho sự
sống của một cơ thể. Với những đặc điểm nhƣ vậy, tế bào gốc đang dần chiếm lĩnh vị
trí đứng đầu trong lĩnh vực y-sinh học cả về nghiên cứu lẫn ứng dụng. Để áp dụng tế

- 9 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
bào gốc vào chữa trị bệnh cũng nhƣ các ứng dụng khác, cần có một số lƣợng tế bào đủ
lớn. Do vậy, các nghiên cứu trƣớc đây đã tìm ra nhiều cách thức để nuôi tế bào gốc
nhƣ đồng nuôi cấy với lớp nguyên bào sợi của chuột (lớp feeder), nuôi trên màng nền
laminin hoặc matrigel có bổ sung môi trƣờng nuôi nguyên bào sợi của chuột hoặc nuôi
trong môi trƣờng có thành phần xác định. Trong đó, việc xây dựng môi trƣờng nuôi tế
bào có thành phần xác định đang đƣợc ƣa chuộng để dễ dàng trong việc kiểm soát và
tối ƣu hóa các thành phần, điều kiện nuôi. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trên môi trƣờng
này, các tế bào gốc thƣờng bị biệt hóa thành các tế bào chức năng.
Các kết quả nghiên cứu gần đây đã nhấn mạnh sự cần thiết của nhân tố FGF-2
trong việc duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi trong điều kiện nuôi
không có lớp tế bào feeder. Wang và cộng sự đã sử dụng FGF-2 ở nồng độ 26-36ng/ml
để tế bào duy trì trạng thái không biệt hóa sau 30 lần cấy chuyền. Kết quả nghiên cứu
của Xu và cộng sự cho thấy con đƣờng tín hiệu BMP kích thích tế bào biệt hóa sẽ bị
ức chế bởi noggin và FGF-2 ở nồng độ cao. Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi
0,5µg/ml noggin và 40ng/ml FGF-2 thì các dòng tế bào gốc phôi ngƣời duy trì tình
trạng không biệt hóa sau 18-32 lần cấy chuyền [22]. Do vậy, hiện nay FGF-2 đƣợc sử
dụng trong tất cả các môi trƣờng nuôi tế bào gốc để duy trì trạng thái không biệt hóa
của những tế bào này.
b) Triển vọng của FGF-2 trong Y học
- Triển vọng của FGF-2 trong việc chữa trị bệnh tim thiếu máu cục bộ
(ischemic heart disease)
Việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ vẫn đang là một thách thức lớn đối với
y học. Nguyên nhân của bệnh là do sự tắt nghẽn động mạch vành dẫn đến việc giảm
mô cơ tim do thiếu oxy và các chất chuyển hóa quan trọng khác. Một cách tiếp cận để
khắc phục hiện tƣợng này là phục hồi lƣợng máu đến khu vực bị ảnh hƣởng càng
nhanh càng tốt. Theo hƣớng này, một số phƣơng pháp đã đƣợc phát triển nhƣ sử dụng
bong bóng nong mạch vành, phẫu thuật bắc cầu mạch vành cũng nhƣ sử dụng các tác

nhân tan huyết. Các phƣơng pháp tiếp cận này đã đem lại hiệu quả khả quan trong việc
phục hồi lƣu lƣợng máu và cải thiện chất lƣợng cuộc sống bệnh nhân nhƣng lại cần
- 10 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
thời gian để phát huy hiệu quả trong khi các mô cơ tim vẫn tiếp tục chịu tình trạng
thiếu máu cục bộ, do đó mức độ tổn thƣơng càng tiến triển. Bên cạnh đó, việc phục hồi
lƣu lƣợng máu đến tim sau thời gian tim bị thiếu máu cục bộ sẽ gây ra một tổn thƣơng
thứ cấp, gọi là tổn thƣơng reperfusion (tổn thƣơng tái thông máu) do cơ tim bị co lại
dƣới điều kiện stress oxy hóa, giảm pH, tăng canxi nội bào và tăng áp suất thẩm thấu.
Trƣớc tình hình đó, các chất có tác dụng bảo vệ tim, trong đó có FGF-2 đƣợc sử dụng
để duy trì khả năng co bóp của cơ tim và làm giảm tổn thƣơng reperfusion. Tác dụng
bảo vệ tim của FGF-2 bao gồm làm giảm tổn thƣơng reperfusion, tái tạo cơ tim thông
qua việc kích thích tăng sinh tế bào gốc tim và kích thích sự tạo thành mạch máu mới
giúp làm tăng lƣu lƣợng máu tới vùng tim bị thiếu máu cục bộ [8].
Hiệu quả sử dụng FGF-2 trong điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ đã đƣợc
chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng phase I trên 52 bệnh nhân không đáp ứng với
các phƣơng pháp điều trị thông thƣờng. Kết quả sau 6 tháng điều trị cho thấy hiệu quả
tích cực của FGF-2 trong việc cải thiện cuộc sống của bệnh nhân, tăng cƣờng khả năng
vận động, tăng cƣờng chức năng của tâm thất trái và giảm thiểu vùng bị thiếu máu [8].
Tiếp theo thành công của thử nghiệm lâm sàng phase I, hiệu lực và tính an toàn của
FGF-2 trong việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ đang đƣợc thử nghiệm lâm sang
phase II với quy mô lớn hơn.
- Triển vọng của FGF-2 trong việc phục hồi mô bao răng ở những bệnh nhân bị
viêm nha chu (periodontitis)
Viêm nha chu là bệnh do vi khuẩn tạo thành lớp màng bao quanh răng, phá hủy
mô bao răng bao gồm dây chằng nha chu, xƣơng răng, xƣơng ổ răng, nứu răng và có
thể làm hƣ răng. Trên khắp thế giới, bệnh viêm nha chu là một chứng bệnh phổ biến
làm giảm chất lƣợng cuộc sống ở lứa tuổi trung niên và lứa tuổi già. Một số thành
công đã đạt đƣợc trong việc làm giảm sự phát triển của viêm nha chu nhƣ loại bỏ

màng bám vi khuẩn bằng cơ học kết hợp với phẫu thuật. Các phƣơng pháp này giúp
làm giảm sự viêm nhiễm nhƣng không thể khôi phục lại nhƣng mô bao răng bị mất
cũng nhƣ cấu trúc và chức năng răng. Để tái tạo những mô bao răng bị mất do viêm
nha chu, nhiều biện pháp đƣợc sử dụng nhằm kích thích nguyên bào xƣơng răng
- 11 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
(cementoblast) và nguyên bào xƣơng (osteoblast) biệt hóa để hình thành chân răng và
xƣơng khoang răng. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự hiện diện của tế bào gốc
trung mô trong dây chằn nha chu, tế bào gốc này sẽ đƣợc biệt hóa thành cementoblast
và osteoblast. Do vậy, hiện nay nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm tìm ra
phƣơng pháp mới để thúc đẩy sự tái sinh mô bao răng bằng cách ứng dụng những nhân
tố kích thích tế bào gốc trung mô tăng sinh và biệt hóa thành tế bào mô cứng.
Do FGF-2 đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mạch máu mới và có
khả năng làm tăng sinh tế bào gốc trung mô, nhân tố tăng trƣởng này đƣợc mong đợi
là có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh nhân bị viêm nha chu. Các nghiên cứu
đã chứng minh FGF-2 có hiệu quả trong việc tái tạo mô bao răng trên các mô hình mô
bao răng bị tổn thƣơng nhân tạo ở chó săn và động vật linh trƣởng
(Macaca fascicularis).
Hiện nay, FGF-2 trộn với hydroxypropylcelluloase đƣợc sử dụng nhƣ một tác
nhân chữa bệnh viêm nha chu trong những nghiên cứu lâm sang phase II. Thử nghiệm
đƣợc tiến hành trên 13 trung tâm y tế ở Nhật, bao gồm 74 bệnh nhân bị viêm nha chu
tham gia. FGF-2 ở các nồng độ 0% (nhóm P), 0,03% (nhóm L), 0,1% (nhóm M) và
0,3% (nhóm H) đƣợc trộn với 3% hydroxypropylcelluloase. Kết quả cho thấy khác
biệt đáng kể về sự gia tăng chiều cao xƣơng ổ răng sau 36 tuần ở các bệnh nhân nhóm
P (23,92%) vá nhóm H (58,62%). Sau 36 tuần, chiều cao xƣơng ổ răng gia tăng tuyến
tính ở nhóm P và nhóm H là 0,95 mm và 1,85 mm. Ngoài ra, tính an toàn của FGF-2
cũng đƣợc chứng minh khi không có bất cứ biểu hiện bất lợi nào đƣợc ghi nhận [9].
- Ứng dụng FGF-2 trong việc ghép da ở những bệnh nhân bị bỏng
Sẹo lồi (keloid scars) hoặc sẹo phì đại (hypertrophic scars) có thể gây ra những

tác hại khi hiện diện ở những vùng chức năng nhƣ khớp nối hay ảnh hƣởng đến thẩm
mỹ khi xuất hiện ở các khu vực dễ thấy nhƣ mặt hoặc tay chân. Những vết sẹo lớn do
bỏng có xu hƣớng phát triển thành những sẹo phì đại và việc ghép da có thể giúp cải
thiện chất lƣợng da cũng nhƣ rút ngắn thời gian nằm viện. Tuy nhiên, làm lành vết
thƣơng do bỏng là một quá trình phức tạp do khả năng bị nhiễm khuẩn lớn. Do đó,
FGF-2 đƣợc sử dụng nhằm đẩy nhanh quá trình làm lành vết thƣơng, giảm thiểu khả
- 12 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
năng nhiễm khuẩn. FGF-2 đóng vai trò quan trọng trong việc làm lành vết thƣơng ở da
bằng cách hoạt hóa macrophage, tác dụng của nó sẽ kéo dài đến giai đoạn tổ chức lại
mô da diễn ra vài tuần sau khi da bị tổn thƣơng. Một cơ chế khác của FGF-2 tác động
lên sự làm lành vết thƣơng là kích thích sự tăng sinh của tế bào gốc trung mô, do đó
đẩy nhanh quá trình đóng kín vết thƣơng. Để chứng minh hiệu quả của FGF-2, S.
Akita và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên 10 bệnh nhân bằng cách xử lý vết
thƣơng sau cấy ghép bằng FGF-2 với liều lƣợng 30µg trên 6 cm
2
diện tích da, một
ngày một lần cho đến khi vết thƣơng khép kín. Kết quả cho thấy khi so sánh với những
bệnh nhân không đƣợc điều trị FGF-2, ở những bệnh nhân đƣợc điều trị FGF-2 sự
hình thành biểu mô nhanh hơn 20% và vết sẹo mềm mại hơn tại thời điểm 1 năm sau
khi vết thƣơng đóng kín. Loại thuốc FGF-2 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này
(Trafermin) cũng đã đƣợc phát triển và sử dụng rộng rãi trong việc làm lành vết
thƣơng do bỏng ở Nhật Bản [3].
c) Ứng dụng của FGF-2 trong Mỹ phẩm
Nhân tố tăng trƣởng FGF-2 có khả năng kích thích sự tăng sinh của nhiều loại
tế bào trong da bao gồm tế bào melanocyte, keratinocyte, những tế bào chính của lớp
biểu bì và nguyên bào sợi trong hạ bì. Nhiều nghiên cứu cho thấy FGF-2 có thể liên
quan đến sự tái hình thành sắc tố da ở những đốm bạch biến (vitiligo macule) - một
hiện tƣợng rối loạn sắc tố da tạo ra những đốm trắng trên da. Những peptide có nguồn

gốc từ FGF-2 đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng trên những ngƣời bị bạch biến tại Ấn Độ
và đã thành công trong việc tái tạo sắc tố da cho 80% bệnh nhân tham gia.
Ngoài ra, FGF-2 còn đƣợc xem là nhân tố ngăn ngừa lão hóa da hiệu quả. Có
nhiều yếu tố gây ra lão hóa da nhƣ tuổi già, tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, rối loạn về
da, sử dụng thuốc và do ảnh hƣởng của môi trƣờng… Nguyên nhân của lão hóa da là
do lƣợng collagen và decorin bị giảm. Collagen là protein chủ yếu trong chất nền
ngoại bào của da (chiếm 70% hạ bì da) và có chức năng làm căng da. Decorin là
proteoglycan đóng vai trò quan trọng trong viếc điều hòa lƣợng collagen trong da.
Collagen hiện diện trong da nhiểu nhất ở lứa tuổi 30 và giảm đi với tốc độ 1% mỗi
năm. Cả collagen và decorin đều giảm đi theo thời gian và dƣới tác động của các nhân
- 13 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
tố gây tổn thƣơng da làm da bị lão hóa và xuất hiện vết nhăn. Các nghiên cứu cho thấy
việc ứng dụng FGF-2 và các peptide có nguồn gốc từ FGF-2 có thể làm giảm vết nhăn
của da. Nguyên nhân của việc giảm nếp nhăn là do FGF-2 kích thích sự tăng sinh các
các tế bào hạ bì, do đó làm tăng sự tổng hợp collagen [15].

Bên cạnh tác dụng chống lão hóa da, FGF-2 còn đƣợc chứng minh có khả năng
làm đen tóc do tác dụng kích thích sự tăng sinh tế bào melanocyte trong nang tóc, đây
là tế bào sản xuất melanin giúp tóc có màu đen. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy
FGF-2 có khả năng kích thích sự hình thành tế bào sinh tóc từ nhiều nguồn tế bào gốc
khác nhau [19].

Do khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da cũng nhƣ làm đen tóc, FGF-2 ngày càng
đƣợc các hãng mỹ phẩm tin tƣởng và bổ sung vào thành phần kem dƣỡng da và dƣỡng
tóc nhƣ bộ sản phẩm bao gồm kem và dung dịch chống lão hóa da, mặt nạ dƣỡng da,
dung dịch bảo vệ tóc, kem ngăn ngừa vết nhăn ở mắt của hãng Dermaheal (Hàn
Quốc), bộ sản phẩm chăm sóc da Skƣnmedia, D’Mark (Philippine), bộ sản phẩm Skin
Care Products, Elizabeth M. Spiers, MD (Mỹ), bộ sản phẩm chăm sóc da của NS của

SB Secrect (Hàn Quốc)…
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli
1.2.1. Giới thiệu chung
Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã
thành công ở vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao
ứng dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghệ sinh học. Từ các tế bào
prokaryote (vi khuẩn) cho đến các tế bào eukaryote (động vật, nấm men, côn trùng)
đều đƣợc sử dụng nhƣ nguồn tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp. Lựa chọn tế bào
thích hợp cho sản xuất còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ đặc điểm, ứng dụng của
protein mục tiêu, cũng nhƣ các đặc điểm tăng trƣởng, mức biểu hiện, các biến đổi hậu
dịch mã và chi phí. Hiện nay, Escherichia coli là chủng chủ đang đƣợc sử dụng phổ
biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có những ƣu thế nổi bật về tốc độ tăng
trƣởng nhanh chóng, đạt đƣợc mật độ tế bào cao, phát triển trên môi trƣờng đơn giản,
rẻ tiền, các đặc tính di truyền đƣợc hiểu biết rõ, sản lƣợng protein sản xuất cao (có thể
- 14 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di
truyền dễ dàng.
Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở E. coli có thể thực hiện theo ba hƣớng: sản
xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào.
a) Sản xuất nội bào
Là chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến, tuy nhiên protein tái tổ hợp tạo ra ở dạng
không tan (thể vùi), không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vƣợt mức, nên đòi hỏi
phải tái gấp cuộn protein mục tiêu sau khi thu nhận. Để khắc phục nhƣợc điểm này đã
có nhiều cải tiến khác nhau nhƣ nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các
amino acid, sử dụng các chủng E. coli khác nhau, đồng biểu hiện với chaperone gấp
cuộn, dung hợp hay đồng sản xuất với thioredoxin, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng
biểu hiện ở điều kiện stress… nhằm làm tăng khả năng tan của protein tái tổ hợp trong
tế bào chất của E. coli.

Một khía cạnh khác cần đƣợc quan tâm là sản xuất các protein có cầu nối
disulfide trong tế bào chất của E. coli. Do tế bào chất của E. coli là môi trƣờng có tính
oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống hình thành (protein DsbA và DsbB) hay có cơ chế
ngăn chặn sự hình thành cầu nối nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối
disulfide hay có nhƣng cấu hình sai. Hƣớng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và
DsbB, sử dụng các chủng đột biến gen trxB, nên sẽ không có enzyme thioredoxin
reductase, giúp tăng khả năng hình thành các nhóm sulfuhydryl [10].
b) Biểu hiện trong chu chất
Mặc dù chỉ biểu hiện khoảng 4% protein trong tế bào nhƣng vùng chu chất lại
có những ƣu điểm nổi bật nhƣ môi trƣờng oxi hoá khử giúp tăng tiềm năng hình thành
cầu nối disulfide cũng nhƣ cấu hình chính xác, ngoài ra do số lƣợng protein tiết ra thấp
nên khả năng tinh sạch protein đích tốt hơn, khả năng protein bị phân huỷ bởi protease
thấp. Tuy nhiên, đòi hỏi phải có sự tiết protein ra ngoài chu chất nên cần trình tự tín
hiệu tiết. Một số các peptide tín hiệu có thể đƣợc sử dụng là phoA, OmpT, OmpA, B-
lactamase, PelB… Để tăng cƣờng gấp cuộn có thể đồng biểu hiện với các chaperone
- 15 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
nhƣ: họ các protein Dsb, SurA, FkpA… Cũng có thể sử dụng các hệ thống tiết nhƣ
TAT, Sec YEG…(Hình 1.3) [6].

Hình 1.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E. coli [6].
c) Biểu hiện và tiết ra ngoại bào
Thông thƣờng tế bào E. coli chỉ tiết ra ngoài các protein gây độc và hemolysin,
nên protein đƣợc sản xuất tiết ra ngoại bào là rất ít. Một số biện pháp có thể kiểm soát
sự tiết protein ra ngoài tế bào nhƣ các hoá chất sinh học, phƣơng pháp vật lí (sốc thẩm
thấu, đông lạnh), xử lí lysozyme, sốc chloroform. Tuy nhiên những cách này chỉ dùng
sau khi thu hoạch tế bào.
Phƣơng pháp phổ biến là dung hợp protein đích với một protein mang mà bình
thƣờng nó đƣợc tiết ra ngoài (nhƣ hemolysin), hay protein ngoài màng của E. coli.

Cũng có thể đồng biểu hiện với các gen mã hoá nhƣ kil, BRP (mã hoá protein giải
phóng bacteriocin),…(Hình 1.4) [6].
- 16 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Hình 1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E. coli [6].
1.2.2. Một số hệ thống biểu hiện ở E. coli
a) Hệ thống cảm ứng bởi IPTG
Ở hệ thống biểu hiện đƣợc cảm ứng bằng IPTG, chủng chủ đƣợc biến đổi di
truyền để có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase trong bộ gen. Gen này đƣợc đặt
dƣới sự kiểm soát của lac promoter. Ngoài ra, gen lacI cũng đƣợc chèn vào bộ gen để
tạo lac repressor. Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trƣờng, lac repressor
tạo thành gắn với lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7
polymerase không đƣợc biểu hiện.
Vector pET đƣợc thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7 promoter.
Gen mục tiêu sẽ đƣợc thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để đƣợc kiểm soát biểu
hiện bởi T7 promoter. Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI
mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter.
Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric,
làm protein này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator. Nhờ đó lac
promoter đƣợc hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 RNA polymerase đƣợc biểu hiện tạo T7
- 17 -

Luận văn thạc sĩ sinh học
RNA polymerase. IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm
soát của lac repressor. Enzyme T7 RNA polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter
đã đƣợc hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã đƣợc tạo dòng vào vector (Hình
1.5)[17].

Hình 1.5. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG [11].
b) Hệ thống cảm ứng nhiệt
Một phƣơng pháp cảm ứng biểu hiện khác là cảm ứng nhiệt bằng cách sử dụng
các promoter đáp ứng với nhiệt độ thấp hay cao. Promoter đáp ứng với nhiệt độ thấp là
pL của phageλ, hoạt động tốt nhất ở 20
o
C với gen điều hòa là cspA. Bên cạnh đó,
promoter p
L
và p
R
đáp ứng với nhiệt độ cao. Các gen mục tiêu đặt ở vùng downstream
của hai promoter này sẽ đƣợc điều hoà biểu hiện bởi repressor cI. Thay vì sử dụng chất
cảm ứng hoá học thì điều kiện cảm ứng ở đây là nhiệt độ vì cI875 là một repressor đột
biến mẫn cảm nhiệt độ. Ở nhiệt độ 30
o
C thì cI875 làm ngừng sự biểu hiện nhƣng ở
nhiệt độ 42
o
C thì cI875 bị bất hoạt, do đó gen đích đƣợc cảm ứng biểu hiện. Ƣu điểm
chính của phƣơng pháp này là không sử dụng hoá chất cảm ứng, do đó tránh đƣợc tình