Tạo kháng thể đa dòng kháng duch(drosophila ubiquitin carboxyl terminal hydrolase) và bước đầu ứng dụng trong nghiên cứu vai trò của protein uch đối với bệnh parkinson

H








TO KHÁNG TH Drosophila
UBIQUITIN CARBOXYL-TERMINAL HYDROLASE)
U NG DNG TRONG NGHIÊN CU VAI
TRÒ CA PROTEIN I VI BNH PARKINSON














- 2011
t nghip Li c

LỜI CÁM ƠN
Trong suốt thời gian dài học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp, em luôn
nhận được sự chia sẽ, giúp đỡ của rất nhiều Thầy Cô, bạn bè, người thân. Bằng tất
cả lòng biết ơn em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người!
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả Quý Thầy Cô trường trường
Đại học Khoa học Tự Nhiên đã truyền đạt cho em những kiến thức nền tảng và sâu
rộng, giúp em có được lượng kiến thức vững chắc, tự tin trong ngành nghề chuyên
môn của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy GS.TS. Trần Linh Thước đã truyền đạt
những kiến thức quý báu cho biết bao thế hệ sinh viên một cách tận tâm, nghiêm túc.
Cám ơn Thầy đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận trong Phòng thí nghiệm
Công Nghệ Sinh Học Phân Tử và Môi Trường, trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên.
Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn đến Cô TS. Đặng Thị Phương Thảo, người
trực tiếp hướng dẫn và tạo nhiều điều kiện để em thực hiện tốt khóa luận này. Cô
hay nói em rất may mắn. Em nhận thấy may mắn lớn nhất của em khi được là học
trò của Cô. Cô là người Thầy tận tâm chỉ dẫn về mặt kiến thức chuyên môn cũng
như truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong quá trình làm thí nghiệm, là người
chị gần gũi chia sẽ những khó khăn cùng em, giúp em tự tin hơn về bản thân mình.
Em xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Thu Trang, Trang luôn là người bạn giúp đỡ
chia sẽ với em trong mọi việc, là người truyền đạt cho em những kiến thức quý báu
một cách nhiệt tình và tận tâm.
Em xin cảm ơn Ths. Trần Thanh Hòa, chị Hà Minh Nguyệt, em Phan Nguyễn
Thụy An, em Nguyễn Thị Tường Vy, nhóc Đặng Ngọc Ánh Sương sẵn sàng hỗ trợ
em hết mình. Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người trong Lab A đã tạo điều
kiện thuận lợi về mọi mặt đặc biệt là tinh thần để em luôn cảm thấy thật vui và thật
may mắn được gặp mọi người.
Em xin chân thành cám ơn các đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện để em có
thể hoàn thành tốt mọi việc như thời gian qua. Mọi người như những người bạn
thật sự luôn chia sẽ, động viên khi em gặp khó khăn.
t nghip Li c

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba má. Với niềm tự hào là con
của ba má giúp con luôn vững bước, cố gắng trong đường đời. Em xin cảm ơn các
anh chị em đã luôn thương yêu, quan tâm. Gia đình luôn là nơi chốn yên lành để
mỗi người cảm thấy được yêu thương nhất!
Em xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08/2011

Nguyễn Thị Quỳnh Trâm




tt nghip Li m u

Trang 1

LI M U
Parkinsonmt trong các i,
là v 
  

 liu ch  mc tm thn hu qu ca bnh
ch không th cha khi hoàn toàn. 
 ch phát sunh bnh Parkinson vn    Parkinson vn còn
. Ðiu mà y khoa hc bit rõ v bnh Parkinson là t
bào vùng cht xám ca não b i bnh b hy hoi và không sn xuc cht
dopamine.
Nguyên nhân gây ra s hy hoi các t bào ca vùng cht xám v 

c bit rõ. Tuy nhiên, nhiu công b khoa hc cho thy s suy thoái t bào thn
kinh gây ra bi s ri lon cha h thng ubiquitin-i vi
bnh Parkinson, có nhiu nghi ng v vai trò ca protein UCH-L1 (Ubiquitin
Carboxyl-terminal Hydrolase L1), mt protein có vai trò trung tâm trong h thng
ubiquitin-proteasome, trong tin trình phát sinh bnh.
Trong nhiu mô hình nghiên cu bc s dng
rng rãi, mô hình rui gim chuyn gen cho thy nhim ni trVòng
i ngn, th h con khá nhiu, b máy di truyn nh gc bit rõ v c
m di truyn, tng vi gen gây bnh  i, có th thc hin
thao tác trên các dòng rui khác nhau mà không b gii hn bnh v o
c sinh hc
  ca chúng tôi tp trung vào nghiên cu trên
protein UCH-L1, Drosophila melanogaster. 
-


tt nghip Li m u

Trang 2

-             

-  mt cha gen thông qua táng ca k thut
knock-out hoc knock-down.


 t ra
nhm mc tiêu:
 UCH-L1 ca rui gim và
 

.
Vi m  tài thc hin mt s 
1. To dòng t bào E. coli mang gen duch
2. Biu hin gen duch và thu nhn, tinh sch protein dUCH
3. S d ng min dch to kháng th kháng
dUCH
4. Kim tra kháng th
5. ng dng kháng th trong các nghiên cu vai trò dUCH trên mô hình
rui gim chuyn gen.
a. Biu hit mc protein dUCH ti nhng mô chuyên bit: mô
mt và mô não rui.
b. Kho sát ng trên kiu hình ca rui gim chuyn gen biu
hit mc dUCH ti mô mt và não.

t nghip Mc lc



DANH MC CÁC CH VIT TT i
 ii
DANH MC HÌNH iii
Li m u 1

1.1. -- 3
1.1.1. -proteasome 3
1.1.2. - 5
a.  5
b. - 8
1.2.  12
1.2.1.  12

1.2.2.          Drosophila
melanogaster 13
1.2.3.  GAL4 15
1.2.4.     Drosophila Ubiquitin carboxyl-terminal
hydrolase L1) 18
1.3.  19
1.3.1.  thng min dch 19
1.3.2. S to máu 20
1.3.3.  ng min dch to kháng th 23
a.  23
b.  30
1.4.  40
1.4.1.  41
1.4.2.  42
-
2.1. VT LIU 44
t nghip Mc lc


2.1.1. Dng c và thit b 44
2.1.2. ng 52
2.1.3. Nguyên vt liu 53
2.2.  55
2.2.1. To dòng E.coli  hp pET28a/duch 55
2.2.2. Cm ng biu hi t mc protein tái t hp 6xHis-dUCH trong E.
coli BL21 62
2.2.3. Tinh ch và thu nhn protein tái t hp 6xHis  dUCH 68
2.2.4. ng min dch trên th 69
2.2.5. X lý huyt thanh th c 70
2.2.6. Kim tra kh n ng ca kháng huyt thanh b

ELISA 70
2.2.7. ng dng trong nghiên cu bnh Parkinson trên mô hình rui gim
chuyn gen 72
-
3.1. To dòng E.coli mang gen biu hin protein dUCH 80
3.1.1. Thu nhn gen mã hóa cho protein dUCH 81
3.1.2. Thu nhn plasmid pET28a 81
3.1.3. To dòng t bào E. coli  hp pET28a/duch 82
3.2. Sàng lc và kim tra vector tái t hp mang gen mc tiêu 83
3.2.1. Sàng lc th bin np mang cDNA ca gen duch b pháp PCR
khun lc 83
3.2.2. Kim tra vector tái t hp 85
3.3. Cm ng biu hin protein tái t hp 6xHis-dUCH trong E.coli 87
3.3.1. Bin np pET28a/duch vào chng biu hin E. coli BL21(DE3) 87
3.3.2.             
 PAGE 88
3.3.3. Chng minh s biu hin ca protein tái t hp 6xHis-dUCH bng
 90
t nghip Mc lc


3.4. Tinh ch thu nhn protein tái t hp 6xHis-dUCH 91
3.5.  ng c 93
3.6.  96
3.6.1. 
E.coli 96
3.6.2.  97
3.7.              
 98
3.7.1.  GAL4 98

3.7.2.  GAL4 102
-
 106
 ngh: 107
TÀI LIU THAM KHO 109















PHN I
TNG QUAN TÀI LIU
tt nghip 

Trang 3

1.1. --
1.1.1. -proteasome [2], [22], [28]
V
            
Rose, chúng tac 
 là nh h thng ubiquitin-proteasome.
Proteasome là phc hp protein bên trong tt c các sinh vt nhân tht và c
vi khun, t s vi khun. Ubiquitin-p

t bin, gp cun sai, bin tính, b oxi hóa, nhng
protein b sai hubiquitin-proteasome tham gia vào
nhii sng ca t bào:
 Loi b n sai khi t bào.
 ng stress ca t bào bng cách phân hy các protein
u hòa.
 u hòa chu trình t bào.
 n s bit hóa t bào (bng cách phân hy các nhân t dch mã
và các enzyme bing).
 Có vai trò quan trng trong h thng min dch bng cách to ra các peptid
c trình dicác phân t MHC lp I.

tt nghip 


Trang 4

Hình 1.1 phân hy protein không mong mun ca h thng ubiquitin-
proteasome [22]
H thng ubiquitin-proteasome gm hai quá trình xy ra liên ti phân
hy protein không mong mun, quay vòng nh  u hòa có vòn i
ngn.
 
               t phân t
ubiquitin (polypeptide 76 amino acid, 8.5 kDa) liên kt v
bng liên kt cng hóa tr giu cui C Glycine ca ubiquitin và mt lysine c
t phân t ubiquitin khác gn vào phân t 
 tip ty hình thành chui ubiquitin. Quá trình ubiquitin hóa là
quá trình ph thuc thc hin bi ba enzyme:
E1 - ubiquitin activating enzyme - hot hóa uniquitin thông qua mt thioester.
E2 - ubiquitin conjugating enzyme - t hóa.
tt nghip 


Trang 5

E3 - ubiquitin ligase - chuy  t  n g 



 Khu là nhóm terminal carboxyl ca ubiquitin c gn vào cu ni
thioester vi mt gc cysteine trên Ubiquitin-Activating Enzyme (E1).
c có tiêu tng ATP.
Ub-COOH + ATP + E1  Ub-CO-S-E1 + AMP + PPi
 c chuyn cho mt nhóm cystein nm trên Ubiquitin-
Conjugating Enzyme (E2).
Ub-CO-E1 + E2  Ub-CO-E2 + E1

 Ubiquitin-Protein Ligase (E3) nh protein mc tiêu cc phá
hyc hiu ca enzyme E3 có th nh rõ protein trong
t bào c phá hy trong các proteasome. E3 xúc tác
cho vic chuyn ubiquitin t E2 ti nhóm -amino ca mt gc Lysin
c c nhn din bi E3, hình thành mt liên kt isopeptide
[22], [28].
Bc th n ubiquitin s c tháo xon b vào
khoang 26S ca phc h   b phân hy. Sn phm ca
proteasome là nhn peptide ngn s c thy phân bi enzyme peptidase
thành các amino acid tái s dng cho quá trình sinh tng hc
khi vào proteasome, chui ubiquitin s tách khc tháo ri thành các
monomer ubiquitin b          UBPs
(ubiquitin processing       
 dng cho quá trình ubiquitin hóa [22].
1.1.2. -n
a.  [7], [12], [19], [20], [35]
Bng gi cho chng bn là bnh Lit
rung. Bnh Parkinson là bnh ri lon thn kinh ph bin nh   
tt nghip 


Trang 6

 ng sau bnh Alzheimer [5]. Nhiu báo cáo
cho thy t l mc bnh và t l u ht các nghiên
cu ch ra rng b tung thy  li ngoài 50
tui [17].
Parkinson là tên ca v  gii phi Anh, James Parkinson (1755 
t bn tác phn t rõ ràng
 a các bnh nhân mà các thy thui nói ti. Ông thy

ri bnh bt ngt quãng  mt chi, r
nên không kii bi v t ng
 chân hoc cánh n mnh
ti s liên h gia rung vi lit, vo, vi dá
cng nhc ci bi ta cho rng lit rung gây ra do tai bin
não, bnh ca ty sng, c       n t
ba Lit rung. Ðó là s hoi t
ca vùng cht xám (substantia nigra) trong não b [37].
Parkinson vt bnh
c bit rõ. Ðiu mà y khoa hc bit rõ v bnh Parkinson
là não b i bnh không sn xuc cht dopamine. Dopamine là mt trong
nhiu cht dn truyn thn kinh (neurotransmitter), do mt nhóm t bào não gi là
cht xám (substantia nigra) sn xut. Não b u khin mi hong thông qua
cht dn truyn thn kinh truyn mnh lnh ti các b ph to ra hành
ng. Trong bnh Parkinson, t bào ca vùng cht xám b hy hoi và không sn
xut ra dopamine. Các tín hiu xut phát t não b n, khii bnh
không kic các c u m
ca bnh thoái hóa thi s tích t, tp hp protein và s hình
thành các th Lewy  bnh Parkinson [17], [22], [37].
             
h. Nguyên nhân gây ra s hy hoi các t bào ca vùng
cht xám vc bing tin b ca di truyn hc, k
tt nghip 


Trang 7

thut y khoa tiên tin và nhng bng chng thc nghiu quy v mt mi rng
s sai hng h thng ubiquitin-proteasome và s tích t nhng protein b bii
n bnh Parkinson. Mt vài nghiên cu cho thy bnh Parkinson có

n mt s t bi  synucein (SNCA), ubiquitin carboxy-
terminal hydrolase L1 (UCH-L1), parkin (PRKN), leucine-rich repeat kinase 2
(LRRK2 hay dardarin), PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), DJ-1. Tuy nhiên,
 phân t ca bnh vc bit rõ [13],[34].

18].
SNCA: SNCA  alpha-synuclein. Trong các t bào não
ca  nhân bnh Parkinson, y tp hp c gi là 
Lewy. t bin  gen SNCA c tìm thy trong    bnh
Parkinson.
PARK2 (bnh Parkinson ln, ng): PARK2 
Parkin. t bin ca gen PARK2 ch yu c tìm thy  nhi 
thành niên mc bnh Parkinson. Parkin ng giúp các t bào phân hy và tái ch
các protein.
tt nghip 


Trang 8

PARK3: 

PARK5:gen uch-l1-L1
PARK7 (Parkinson ln, ng): PARK7 t bin c tìm thy
trong  bnh Parkinson. PARK7  DJ-1, 
a.
PARK12: 
LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2): LRRK2 là    
dardarin. t bin  gen LRRK2 có liên quan n  ca nh
Parkinson.
PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1): t bin ca gen này c tìm

thy trong s khu sm bnh Parkinson. Ch chính xác ca các protein
do PINK1 ,  có th bo v .
Mt s nhim sc th khác và các gen GBA (glucosidase beta acid),
SNCAIP (synuclein alpha interacting protein), UCH-L1 (ubiquitin carboxyl-
terminal esterase L1)  có th liên quan n bnh Parkinson.
gen38],[39].
b. - [5], [7], [15],
[24], [31], [32], [33]
-
  

-
 [20],
[22].
-            - 2%)
(    [16]  -   
enzyme có vai trò trong vic hình thành liên kt  u C
ca protein trong quy trình gn ubiquitin ca nhng protein gp cun sai, protein
tt nghip 


Trang 9

già ci không mong mun cn phân hy b  -  

-
     -      

rng s sai hng h thng ubiquitin-proteasome và s tích t nhng protein b bin
n bnh Parkinson [3]. Protein -

-
- [22].
   t bi    - t bin thay th
isoleucine thành methionine ti amino acid th 93 ca UCH-L1 (UCH-L1
I93M
), 
exon 4 c c tìm thy    c có
b
           c gii
trình t  72 nh Parkinson và vn cht bin  exon 4
ca UCH-L1 [3], [16]t bin này làm gim hoa UCH-L1,
làm gim hot tính thy phân, dn s phá v h thng ubiquitin-proteasome.
Kt qu là thay vì b phân hy, các protein không mong mun có th b tích t hình
thành các th ng hoc git cht các t
--

t nghiên cu gt chuyn gen biu hit mc ca
UCH-L1
I93M
 i cho thy tín hiu làm mt t bào thn kinh sn xu

protein [23].
-
-synuclein [16-synuc
-
         -L1
I93M
   
tt nghip 

Trang 10

-L1
WT

-
-
-in vitro

-
 -  ubiquitin-- 
 -             -
- 

-
16].

-
momomer [16].
-t bin S18Y, kt qu ca s
thay th serine thành tyrosine ti amino acid th 18 ca UCH-L1 (UCH-L1
S18Y



-L1
S18Y

              

16-L1
S18Y

c
-L1
I93M
,  
tt nghip 


Trang 11

-L1
S18Y


  -L1
S18Y
          
 -L
S18Y
      -      
UCH-L1
WT
-L1
I93M

  -L1
S18Y
  

-L1
WT
[10].
-

-

-21].

-


tt nghip 


Trang 12

1.2. 
1.2.1. 36], [37], [38]


Tt c nhu tr
c thit k  ng dopamine trong não bng cách thay th dopamine,
bc dopamine, hoc kéo dài tác dng ca dopamine bng cách c ch phân
hy ca nó.
Liu pháp hiu qu nht   bnh Parkinson là   levodopa
(Sinemet),     dopamine. Tuy nhiên, v u tr lâu dài vi
levodopa có th dn tác dng ph khó chu, chut rút và
c ng không 
 c kê

 cùng vi carbidopa (Sinemet)a levodopa   c khi
n não.  vi carbidopa cho phép  levodopagim
tác dng ph.
u ca bnh Parkinson, các cht bc  ca
dopamine (dopamine agonists) và các cht làm gim s phân hy ca dopamine
(monoamine oxidase loi B (MAO-B)) có th rt hiu qu trong vic
làm gim các triu chng . Tác dng ph ca các ch
phm này là khá ph bin, bao gy gây ra do tích t 
th, bun ng, táo bón, chóng mt, o giác và bun nôn.
i vi mt s  hc hu
thut có th là mt la chn. , thay vì phá
hy hn cc ci vi mt
máy gây nhp   kim soát. Công hiu ca loi kích thích này là gim
thi  ng b ng. Trong dng phu thut , 
gây ra các triu chng Parkinson  tiêu .