khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenen bằng kỹ thuật mlpa

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khãa 2009-2013
Hà Nội – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
1
1
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KhÓa 2009-2013
Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh
Hà Nội – 2013
2
2
3
LỜI CẢM ƠN
Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học
hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinh
nghiệm làm việc.
Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS. Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc
trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã
giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa
luận cho tôi.
GS.TS. Tạ Thành Văn, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy
tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở, động
viên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóa luận
tại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thành khóa
luận một cách tốt nhất.
ThS. Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng,
cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã
dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện
đề tài
Ban giám hiệu, phòng quản lí và đào tạo đại học, bộ môn bệnh học
phân tử và các phòng ban trong trường Đại học y Hà Nội
Những người thân trong gia đình, bạn bè, các anh chị đã động viên,
chia sẻ khó khăn với tôi trong quá trình làm khóa luận.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013.
Đỗ Thị Mai
3
3
4
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
***
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ

của thầy cô và các anh chị tại trung tâm nghiên cứu, tất cả các số liệu trong
khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công
trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Người viết khóa luận
Đỗ Thị Mai
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DMD
BMD
DNA
Duchene muscular dystrophy
Becker muscular dystrophy
Deoxyribonucleic Acid
4
4
5
cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid
CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử
CK Creatin kinase
bp
PCR
Basepair
Polymerase chain reaction
MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification
NST Nhiễm sắc thể
RNA
dNTP
ddNTP
BN
Ribo Nucleic Acid

Deoxyribonucleoside triphosphate
Dideoxyribonucleoside triphosphate
Bệnh nhân
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne Muscular
Dystrophy (DMD)hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại, được phát hiện trên
nhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới, là bệnh di truyền lặn liên kết với giới
tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai (7)
5
5
6
DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa có
phương pháp điều trị hiệu quả. Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết
do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20
tuổi. Bệnh nhân có các biểu hiện suy yếu cơ: khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên
ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày
càng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại (7)
Nguyên nhân gây bệnh DMD là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm
ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X, có chiều dài 2500 Kb, bao gồm 79 exon với
7 promoter khác nhau. Gen dystropin sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng
hợp protein dystrophin. Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ,
có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ khỏi bị
tổn thương trong quá trình co cơ. Gen dystropin bị đột biến, quá trình tổng hợp
protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và
gây nên bệnh DMD. Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker Muscular
Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất hiện muộn
hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.(7)
Các đột biến có thể xảy ra trên gendystropin là đột biến mất đoạn, đột
biến điểm, và lặp đoạn. Mất đoạn là loại đột biến hay gặp nhất, chiếm khoảng
65% trong số các đột biến. Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra trong vùng

“hotspots”là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’của gen dystropin(7)
6
6
7
DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi vậy, việc chẩn
đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnh
loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại các
biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho người
bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài ra,việc phát hiện
đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọng
trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con
bị bệnh. Phương pháp MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification) hiện đang là phương pháp tối ưu trong xác định đột biến xoá
đoạn, được ứng dụng rộng rãi.
Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất
đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”
được thực hiệnnhằm mục tiêu:
Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân
loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
7
7
8
1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.
1.1.1. Trên thế giới.
- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chi
tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là
bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (29)
- Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp

mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân
biệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông (29)
- Năm 1879, Gowers thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ càng
bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết (29)
- Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dài
bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ
trong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân.
- Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc
biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện
dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụ
cho điều trị và tư vấn di truyền(27)
- Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sựphát hiện ra gen dystrophin nằm ở
vị trí Xp21 (28)
- Từ năm 1984 – 1987, Hoffman và các cộng sự của ông phát hiện gen
dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen (23)
- Sau những năm 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di
truyền phân tử phát triển mạnh nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến
tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn
8
8
9
di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bị bệnh
DMD (23)
- Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu chỉ biết gen dystrophin gồm 60 exon.
- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb
- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện
đầy đủ gồm 79 exon
Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng
được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng

nề của bệnh gây ra.
1.1.2. Ở Việt Nam.
DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam
do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía
trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể:
- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS nghiên cứu
xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại Viện
BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107 gia
đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh (1)
- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang sử dụng một cặp
mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ gen
cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh.
- Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biến
xoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR(2)
- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng công
bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lần
thứ 23 (1).
9
9
10
- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 nghiên cứu đột biến gen
gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6 trường
hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu.
- Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhân
Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38%
có đột biến xóa đoạn gen dystrophin.
- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện
13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán
là DMD.
- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58

bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là
23/58, chiếm tỷ lệ 39,7%.
1.2. Đặc điểm bệnh DMD
1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD
Hình 1.1 Người bình thường và bệnh nhân DMD
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn sau:
Giai đoạn 1 (khi trẻ được 3-5 tuổi) Trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi
lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiện
10
10
11
teo cơ.
Giai đoạn 2 (khi trẻ được 6-7 tuổi) Trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện
dấu hiệu Gowers rõ, trẻ đang ngồi
xổm phải đứng thẳng lên hoặc đang
nằm phải ngồi dậy, trẻ phải quay
người sang một bên, gấp đầu gối vào
mông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân
để giữ một tư thế như quỳ bắn, sau
đó, bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên
cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho
thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động
tác như vậy được xem là đặc hiệu cho
bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
Giai đoạn 3 (khi trẻ được12-15 tuổi) Trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12
tuổi, sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện
do trẻ không đi lại được, cuối cùng trẻ
bị tử vong ở lứa tuổi 20-25 do tổn
thương cơ tim và rối loạn hô hấp(7)
11

11
12
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.2.2.1. Định lượng hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK) trong huyết thanh
Creatin Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàu năng
lượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ.
Creatine + ATP
→←
CK
phosphocreatine + ADP
Phosphocreatin là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và vận
chuyển chất trong tế bào cơ.
Có ba dạng isoenzym của CK, đó là CK-MM, CK-MB và CK-BB.
Dạng đồng phân CK-MM chiếm 95% của CK toàn phần và tập trung chủ yếu
ở tổ chức cơ vân. Dạng CK-MB chiếm khoảng 5% và tập trung chủ yếu ở mô
cơ tim. Dạng CK-BB chiếm tỷ lệ không đáng kể và khu trú chủ yếu ở tổ chức
não, nó không qua được hàng rào mạch máu não, do đó CK-BB không xuất
hiện trong huyết thanh (11)
Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào nồng độ enzym CK trong máu.
Ở bệnh nhân DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc potein
dystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giải
phóng một lượng lớn enzym CK vào máu. Ở bệnh nhân DMD, enzym CK
tăng cao ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/l). Tuy
nhiên, ở giai đoạn muộn của quá trình bệnh, khối cơ còn lại ít và lượng cơ
thoái hóa cũng ítkhiến hoạt độ enzym này giảm thấp (23,11)
1.2.2.3. Sinh thiết cơ
Sinh thiết cơ là một tiêu chuẩn chẩn đoán chính xác nhất. Phản ứng miễn
dịch huỳnh quang khi nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ cho thấy sự vắng mặt hoàn
toàn của protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ. Các sợi cơ với đường kính
không đều và có dấu hiệu của sự thoái hóa hoại tử, thâm nhiễm mô mỡ, mô liên

12
12
13
kết và những tế bào đơn nhân. Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn
dưỡng cơ Becker (BMD). Bệnh nhân BMD xuất hiện triệu chứng lâm sàng
muộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn.
Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein Dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bào
sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD (20).
1.2.3. Điều trị bệnh DMD
Hiện nay phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trì
hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMD
như: prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặc
aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ. Vật
lý trị liệu có tác dụng giúp cho trẻ hạn chế bớt mức độ co kéo cơ (30).
Hiện nay, liệu pháp gen trong điều trị căn bệnh này đang được thực
hiện với mục đích đưa vào trong tế bào một hoặc nhiều gen có khả năng tổng
hợp ra protein dytrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ
(16, 22).Hai phương pháp đã được thử nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ
những plasmid và sử dụng vật truyền trung gian virut. Nhưng phương pháp
này còn nhiều hạn chế do gặp phải nhiều trở ngại nên chưa được áp dụng để
điều trị bệnh trên người. Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen
mới, sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhân, các nhà khoa học đã
chọn lọc, xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột biến tạo ra
một cắt đoạn lớn bên trong gen mà vẫn duy trì được khung dịch mã và protein
vẫn được sản xuất bán phần giúp cho người bệnh chuyển từ thể bệnh nặng
(DMD) sang thể bệnh nhẹ (BMD) và giúp kéo dài thời gian sống.
1.2.4. Phòng bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khả
năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có phương pháp
13

13
14
điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định
rằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh
DMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó là
việc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnh
nhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ
và đang mang thai có nguy cơ cao. Phương pháp để phát hiện bệnh được đánh
giá có độ chính xác cao đang được sử dụng là kỹ thuật MLPA (Multiplex
ligation dependent probe amplification) và cách sàng lọc trước sinh cho phụ
nữ mang thai là chọc hút dịch ối, tách DNA của thai nhi và phân tích gen
dytrophin đột biến .Trước khi phân tích DNA của thai nhi phải loại trừ khả
năng nhiễm DNA của người mẹ trong quá trình chọc hút dịch
1.3.Cơ chế di truyền của bệnh
DMD là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Mẹ là người
bình thường mang gen bệnh, di truyền bệnh cho con trai. Trong một lần sinh,
nguy cơ của những người mẹ này như sau:
* 50% số con gái là người bình thường mang gen bệnh.
* 50% số con gái là người bình thường không mang gen bệnh
* 50% số con trai là người bình thường không mang gen bệnh
* 50% số con trai là người mắc bệnh DMD
14
14
15
Hình 1.2. Cơ chế di truyền bệnh DMD
(http://di truyền.com)
Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X
không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ
biểu hiện bệnh. Francke (1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen
có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt. Có khoảng 30%

bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ .
1.4. Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin
1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin
Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X.
Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin.
(ghr.nlm.nih.gov)
15
15
16
1.4.2. Cấu trúc gen Dystrophin
Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin.
(actionduchene.com)
Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất của người đã được
biết tới, gen có kích thước khoảng gần 3000kb, trong đó hơn 99% chiều dài
gen là intron .
Gen Dystrophin gồm 7 promoter: Promoter não, promotor cơ, promotor
tiểu não, promoter Dp 260, Dp 140, Dp 116, Dp 71.
Gen Dystrophin gồm 79 exon, là vùng gen mã hoá để phiên mã thành
mRNA, chứa đựng thông tin di truyền cho sự tổng hợp protein Dystrophin. Các
vùng intron xen kẽ các vùng exon đóng vai trò quan trọng cho quá trình hoàn
thiện mRNA và nó được loại bỏ khi quá trình hoàn thiện mRNA kết thúc .
16
16
17
Hình 1.5:Kích thước của các exon trên gen dystropin
(cureduchene.org)
1.5. Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin
Protein Dystrophin gồm 3685 acid amin, dài 427 kD, nằm ở màng bào
tương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng,

bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ.
Dystrophin được phân chia làm 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng gắn
với actin, vùng cấu trúc xoắn bậc 3, vùng giàu cystein và vùng C-tận . Bốn
vùng này có chức năng rất khác nhau, một số tác giả đã chứng minh rằng
vùng N-tận, vùng giàu cystein và vùng C-tận có vai trò rất quan trọng với
chức năng của dystrophin, bệnh nhân có đột biến vùng này biểu hiện triệu
chứng lâm sàng rất nặng nề.
17
17
18
Dystrophin liên kết với phức hợp Dystrophin- glycoprotein-complex
(DGC) thông qua sự sự tương tác của vùng C-tận với phức hợp Dystroglycan và
Syntrophin. DGC có vai trò quan trọng đối với chức năng của Dystrophin trong
sự ổn định màng bào tương và là cầu nối tế bào cơ với vùng ngoại bào(7)
Hình 1.6: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin tại màng tế bào cơ
(actionduchene.org.com)
1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin
1.6.1. Đột biến mất đoạn gen Dystrophin
Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân
DMD. Đột biến này chiếm khoảng 60÷65% trong tổng số các dạng đột biến.
Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspots region) đó là vùng tận
cùng 5’ (exon 1÷19) và vùng trung tâm (43÷60). Khi tiến hành phân tích đột
biến gen Dystrophin, người ta thường hay tập trung phân tích hai vùng này
trước để phát hiện đột biến mất đoạn [29].
1.6.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp, chiếm 25 ÷ 30%, hầu
hết đột biến điểm là dạng tạo ra mã kết thúc sớm (nonsense mutation) và gây
18
18
19

nên thể bệnh nặng, đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen đã gây nên
một trở ngại lớn khi xác định đột biến [29].
1.6.3. Đột biến lặp đoạn trong gen Dystrophin
Đột biến lặp đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn, khoảng 10 ÷ 15%, tập trung chủ
yếu ở đầu 5’ tận của gen Dystrophin.
1.7. Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn
gen dystropin.
1.7.1. Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA (Multiplex Ligation-
Dependent Probe Amplification)
Kỹ thuật MLPA là một phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong
chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen, cho phép phát hiện các tổn
thương gen một cách nhanh chóng.
Kỹ thuật sử dụng bộ kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam,
Hà Lan sản xuất. Các qui trình kỹ thuật đều thực hiện theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.
• Nguyên lý: Đột biến được phát hiện bằng các đoạn dò (probe). Mỗi probe gồm
hai chuỗi oligonucleotid, các probe này lai đặc hiệu với 79 exon của đoạn gen
đích. Mỗi chuỗi đều có vị trí gắn đặc hiệu với exon đích và có gắn sẵn mồi, khi
hai chuỗi này đã gắn được vào vị trí exon đích, enzym ligase sẽ gắn 2 chuỗi
thành probe hoàn chỉnh. Nếu gen bị đột biến, probe tương ứng với exon bị xóa
không được hình thành do 2 chuỗi không gắn được vào exon này.
Mồi gắn sẵn trên probe có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp
mồi duy nhất để khuếch đại tất cả probe.
Riêng ở chuỗi dài có thêm một đoạn đệm có số nucleotid khác nhau,
nhờ đó các probe có sự khác biệt về kích thước, giúp phân tách khi điện
di mao quản sau khuếch đại probe.
19
19
20
Kết quả phân tích sẽ cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng với 79 probe

đặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa đã xảy ra đột
biến mất đoạn trên exon.
Cấu trúc probe:
Hình 1.7: Cấu trúc của probe
- Chuỗi oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai
với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.
+ Đoạn 2 chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của đoạn này
giống nhau cho tất cả các probe. Đây là vị trí gắn với mồi xuôi
- Chuỗi oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,
+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’,trình tự nucleotid giống nhau cho
tất cả các probe. Đây là vị trí gắn mồi ngược
+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’
và 2’,cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu
với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác
nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do
đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di (6).
20
Vị trí gắn
đặc hiệu
trên gen
đích
Thuốc
nhuộm
huỳnh
quang
Đoạn
đệm

Mồi
xuôi
Mồi
ngược
2’3’1’21
3’5’5’
3’
20
21
Các bước của kỹ thuật MLPA
Hình 1.8. Sơ đồ quy trình kỹ thuật MLPA
MLPA cũng có thể coi là một loại phản ứng PCR, tuân theo một quy trình nhiệt
gồm nhiều bước.
 Bước 1: Biến tính (ngày 1): Biến tính DNA trong môi trường nhiệt độ cao (98
o
C
trong 5’). Bước này giúpDNA mạch đôi tách ra thành 2 mạch đơn.
 Bước 2: Lai hóa (ngày 1): Cho thêm probe, tạo điều kiện cho các probe gắn
vào các vị trí đích trên mạch DNA sợi đơn. Tiếp tục chu trình nhiệt: 95
o
C
trong 1’ rồi ủ qua đêm từ 16-24h (60
o
C)
21
Gen đích
probe
Khuếch
đại
Nối ghép

sau lai
Biến tính và
lai hóa
21
22
 Bước 3: Nối ghép sau lai(ngày 2): Probe đã gắn vào đọan DNA đích. Giai
đoạn này hai mồi đặc hiệu trên hai chuỗi ngắn và dài kích hoạt kéo dài mạch
theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích và nối liền hai chuỗi lại với
nhau. Như vậy sản phẩm thu được là các probe khác nhau với hai chuỗi
oligonucleotid ngắn và dài đã được nối liền.
 Bước 4: Phản ứng PCR (ngày 2) sản phẩm là các probe đã được nối liền được
cung cấp thêm các thành phần cần thiết và thực hiện theo chu trình nhiệt đã
được cài đặt đểnhân bản các probe lên nhiều lần (23, 24).
Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện di phân tách trên hệ thống
CEQ 8000 (Beckman Coulter). Sau khi điện di mao quản, kết quả được phân
tích bằng phần mềm Gene Marker. Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạng
biểu đồ sóng và dưới dạng bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn sẽ không có đỉnh
tín hiệu xuất hiện.
1.7.2 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm.Kỹ thuật này dựa trên
những nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép DNA trong cơ thể sống. Từ
một khuôn ban đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích
cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao, thường là 94
o
C - 95
o

C trong vòng 30 – 60 giây. Bước này
DNA sợi kép tách ra thành hai mạch đơn.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi cặp với khuôn là các DNA mạch đơn, dao động trong khoảng
40
o
C – 70
o
C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 – 60 giây.
22
22
23
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extennsion) Nhiệt độ tăng
lên 72
0
C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động
tổng hợp sợi DNA mới bằng cách kéo dài sợi mồi sử dụng 4 loại nucleotid
(dATP, dCTP, dGTP, dCTP). Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự
DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Hình 1.9. Các giai đoạn trong phản ứng PCR
Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làm
khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Như vậy sản
phẩm của phản ứng sẽ tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ. Vậy sau n chu
kỳ số lượng DNA thu được là 2
n
bản copy. Tuy nhiên, thông thường hiệu suất
của phản ứng sẽ không đạt 100% và chúng ta tiến hành 25-40 chu kỳ tùy theo
nồng độ sản phẩm của DNA.
Kết quả là từ một lượng nhỏ chất khuôn ban đầu, chúng ta có thể thu
được một lượng lớn DNA. Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiến

23
23
24
hành PCR việc nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể đưa tới sự
thất bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được một
lượng nhỏ sản phẩm DNA mong muốn(6).
1.7.3.Giải trình tự gen (DNA sequencing):
Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid
(A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine)) trên phân tử DNA.
Hiện này phương pháp enzyme của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở
Việt Nam lẫn thế giới. Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP
(dideoxyribonucleoside triphosphate) là các đồng phân của dNTP
(deoxyribonucleoside triphosphate. Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có
một điểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở đầu 3’ (vị trí
carbon 3 của deoxyribose), là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào. Do đó,
phản ứng tổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn
ngẫu nhiên vào thay cho dNTP.
24
24
25
Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp
Sanger [32].
Kết quả của phản ứng PCR giải trình tự là có rất nhiều sợi DNA được
tạo thành. Các sợi này có độ dài hơn kém nhau 1 nucleotid.
Sản phẩm PCR giải trình tự sẽ được điện di và đọc kết quả trên máy tự động.
25
25