Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN




NGUYỄN THỊ THOA





ĐỘC LỰC VÀ THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN Vibrio alginolyticus PHÂN LẬP TỪ
CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BỊ BỆNH LỞ LOÉT TẠI
CÁC BÈ NUÔI THƯƠNG PHẨM Ở KHÁNH HÒA


LUẬN VĂN THẠC SỸ





Cán bộ hướng dẫn Khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng





Nha Trang, tháng 07/2011

i
LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong luận văn này là do chính bản thân
tôi thực hiện dưới sự chỉ bảo tận tình, chu đáo của Thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Hữu
Dũng.
Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào.

Tác giả




Nguyễn Thị Thoa

ii
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu nhà trường Đại Học
Nha Trang, các thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp thạc sỹ.
Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự chỉ dẫn tận tình, những góp
ý quý báu, kịp thời của thầy giáo hướng dẫn TS. Nguyễn Hữu Dũng. Tôi cũng xin
chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy đã luôn bên cạnh và
hướng dẫn nhiệt tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi nghiên cứu tại
hợp phần bệnh, dự án Nufu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản
III, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa
Dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Trung, trưởng phòng bệnh Thủy sản và Dự báo,
Giám đốc Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Trung, các anh chị và các bạn
đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể tham gia và hoàn
thành khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban điều phối dự án NUFU đã cung cấp
mọi điều kiện vật chất trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi: Bố, mẹ cùng anh, chị và các em,

chồng tôi Trần Huy Chinh và hai con:Khánh Ninh và Khánh Ngân đã luôn là chỗ dựa
tinh thần vững chắc và tạo mọi điều kiện thời gian và vật chất giúp tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn.



Nguyễn Thị Thoa


iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt v
Danh mục các hình ảnh vi
Danh mục các bảng vii
Mở đầu. 1
Chương 1 - Tổng quan 3
1.1. Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam 3
1.1.1. Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 3
1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam 5
1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở thế giới 5
1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam 7
1.4. Một vài đặc điểm vi khuẩn V. alginolyticus 8
1.4.1. Hệ thống phân loại của V. alginolyticus 8
1.4.2. Đặc điểm phân bố của V. alginolyticus 8

1.4.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V. alginolyticus 9
1.4.4. Yếu tố gây độc của V. alginolyticus 11
Chương II: Phương pháp nghiên cứu 14
2.1. Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1. Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng 14
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 14
2.2.3. Nghiên cứu độc lực, LD
50
của vi khuẩn 16
2.2.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực 16
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm 17
2.2.3.3. Phân lập lại vi khuẩn 18
iv
2.2.4. Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS)
của vi khuẩn 19
2.2.4.1. Phương pháp nhuộm Pr 20
2.2.4.2. Phương pháp nhuộm LPS 21
2.3. Phương pháp xủ lý số liệu 22
Chương III: Kết quả nghiên cứu 23
3.1. Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V. alginolyticus gây bệnh lở loét
trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa 23
3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V. alginolyticus 25
3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10 26
3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01 28
3.2.3 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoK03 30
3.2.4 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoVL03 31
3.2.5. Kết quả phân lập trở lại V. alginolyticus 32
3.2.6. Kết quả kiểm tra độc lực 4 chủng V. alginolyticus đợt 2 33
3.3 Thành phần Protein và LPS của 4 chủng V. alginolytics 35

3.3.1. Thành phần Protein của 4 chủng V. alginolytics 35
3.3.2. Kết quả phân tích LPS của 4 chủng V. alginolytics 37
Chương IV: Kết luận và đề xuất ý kiến 38
4.1. Kết luận 38
4.2. Đề xuất ý kiến 38
Tài liệu tham khảo 39
Phụ lục








v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
cs: cộng sự
S‰: Độ mặn
t
0
C: Nhiệt độ
TB: Trung bình
VK: Vi khuẩn
PBS: Phosphate Buffered Saline
TLBH: Tỷ lệ biểu hiện
APS: Ammonium Persulphate
SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED : Tetramethylethylenediamine
SDS: Sodium dodecyl sulfate Electrophoresis purity reagent

Tris: Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) - aminomethane
Rpm: Revolutions per minute
KDa : Kilodalton
DNA : Deoxyribonucleic acid
TSA: Tryptic Soy Agar
TSB: Tryptic Soy Broth
API: Analytical Profile Index
TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar
CFU: Colony forming units.
LD
50
: Mean Lethal Dose, 50% (Liều gây chết 50%).
NMSL: Nước muối sinh lý.
LPS : lipopolysaccharides
P : page (trang)




vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia giá trị ở khu vực
châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006 3
Hinh 1.2. Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở Australia
từ năm 1986 đến năm 2004 5
Hình 2.1. Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm 18
Hình 3.1. Đặc điểm sinh hóa trên test kit API - 20E của vi khuẩn V. alginolyticus 25
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và
nhuộm Gram 25

Hình 3.3. Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 25
Hình 3.4. Độc lực chủng CH10 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy và b: tỷ
lệ biểu hiện bệnh 26
Hình 3.5. Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CH10 28
Hình 3.6. Độc lực chủng CoS01 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy và b: tỷ
lệ biểu hiện bệnh 28
Hình 3.7. Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CoS01 30
Hình 3.8. Tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét của cá chẽm đối với chủng CoK03 31
Hình 3.9. Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CoK03 31
Hình 3.10. Biểu hiện cá bị bệnh khi tiêm kiểm tra độc lực vi khuẩn V.
alginolyticus và cá khỏe mạnh ở lô đối chứng 32
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc V. alginolyticus trên môi trường TCBS và TSA 32
Hình 3.12. Độc lực và tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét của hai chủng CH10 và CoS01
trên cá chẽm khỏe đợt 2 33
Hình 3.13. SDS-PAGE protein của 4 chủng V. alginolyticus 35
Hình 3.14. SDS-PAGE lipopolysaccharides của 4 chủng V. alginolyticus 37



Trang

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập của đối tượng nghiên cứu 14
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hoá của 4 chủng V. alginolyticus 23
Bảng 3.2. LD50 của các chủng V. alginolyticus qua 2 đợt thí nghiệm 34

1
MỞ ĐẦU
Nghề nuôi cá biển Việt Nam trong vài năm trở lại đây đã phát triển mạnh mẽ. Nhiều
đối tượng cá biển được đưa vào nuôi với nhiều hình thức nuôi ao đìa hoặc nuôi lồng, bè.
Trong đó, cá chẽm với nhiều ưu điểm như lớn nhanh, phân bố rộng muối, có giá trị kinh
tế, và đã được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo thành công, nên nghề nuôi cá chẽm đã
phát triển mạnh ở khu vực miền Trung (Khánh Hòa, Phú Yên) và một số nơi ở phía Bắc
như Hải Phòng, Quảng Ninh … Đến nay cá chẽm trở thành đối tượng nuôi xóa đói giảm
nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang bị suy thoái. Tuy nhiên, trong quá trình
nuôi do kỹ thuật chăm sóc, quản lý môi trường còn nhiều hạn chế nên nghề nuôi cá chẽm
đang đối mặt với nhiều đợt dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi.
Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán -
Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân với tốc độ lây lan nhanh, gây chết khoảng 80% trong
vòng 1 tuần, bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôi lớn
(2 - 3kg). Nguyên nhân ban đầu xác định do vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra.
Trước tình hình thực tế trên và để có cơ sở cho việc xác định chính xác tác nhân
gây bệnh, nghiên cứu vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, tôi đề xuất thực hiện đề tài: “
Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ
cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa”.
Mục tiêu của đề tài:
Xác định mối tương quan giữa độc lực và thành phần protein của chủng vi khuẩn
V.alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất
vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, giúp giảm thiệt hại và nâng cao hiệu quả kinh tế cho
nghề nuôi cá biển.
Nội dung thực hiện đề tài:
1. Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn V.alginolyticus
2. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn V.alginolyticus

3. Xác định thành phần protein của chủng vi khuẩn V.alginolyticus
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu các nghiên cứu
cơ bản về chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm: đặc điểm sinh
hóa, độc lực và thành phần protein.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở cho nghiên cứu sản
xuất vaccin phòng bệnh trên cá chẽm cũng như các đối tượng cá biển nuôi thương phẩm ở
nước ta.

3
Chương I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới
Cá chẽm có giá trị dinh dưỡng cao, là loài phân bố rộng và dễ nuôi nên đã trở
thành một trong những đối tượng được lựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi
trồng thủy sản ở nhiều nước trong khu vực. Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu
tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên
1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam và Australia, và gần đây
ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh và Israel [35].
Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á -
Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần lớn cá chẽm được
nuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển [36]. Năm 2004, sản lượng cá
chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn [61] và năm 2006 tăng lên 27.522
tấn

[62].

Thái Lan: Là nước dẫn đầu về sản lượng nuôi cá chẽm trong khu vực Châu Á -
Thái Bình Dương. Năm 2004, giá trị sản lượng cá chẽm của Thái Lan là 65,08 triệu USD,
Hình 1
.
1
S
ản l
ư
ợng cá
ch
ẽm
(Lates calcarifer) theo qu
ốc gia (cột) v
à giá
trị (đường) ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006.
(Nguồn Mike ) [61].

4
năm 2005 là 68,52 triệu USD với giá bán khá ổn định, trung bình mỗi kg cá thương phẩm
dao động trong khoảng 2,50 - 2,60 USD [62]. Theo FAO (2006), sản lượng cá chẽm nước
mặn và lợ của Thái Lan tăng hằng năm, từ 3.884 tấn (năm 1995) và tăng lên 14.550 tấn
(năm 2004) [36].
Malaysia: Cá chẽm là loài được nuôi truyền thống, đến năm 2007 vẫn là loài nuôi
dẫn đầu trong nghề nuôi cá lồng ở Malaysia. Theo thống kê của FAO (2006) sản lượng cá

chẽm của Malaysia là 4.003,73 tấn (năm 2002), 4.210,93 tấn (năm 2003), và 4.000,54 tấn
(năm 2004) [36].
Indonesia: Là quốc gia có sản lượng cá có vảy (finfish) biển lớn nhất trong khu
vực Đông Nam Á. Trong đó cá chẽm cũng là một trong những loài nuôi chính của nước
này với sản lượng năm 2004 vào khoảng 2.900 tấn

[36].
Singapore: Dự tính đến năm 2012 sản lượng cá chẽm là 3.000 tấn và đến năm
2020 sản lượng sẽ tăng lên 20.000 tấn [94].
Hàn Quốc: Tổng sản lượng cá nuôi của Hàn Quốc năm 2003 khoảng 72.393 tấn,
trong đó cá chẽm khoảng 2.778 tấn [36].
Australia: Cá chẽm được nuôi ở hầu hết các bang của Australia (ngoại trừ bang
Tasmania)[36], [93], nhưng sản lượng cá chẽm tập trung chủ yếu ở Queensland (phần lớn
là nuôi nước ngọt), Northern Territory (nuôi lồng biển và nuôi ao nước lợ) và Nam
Australia (nuôi nước ngọt) [26]. Cá chẽm được nuôi công nghiệp bắt đầu từ những năm
1980, hiện nay có khoảng 100 trang trại được cấp phép nuôi [93]. Theo dữ liệu của FAO
năm 2004, sản lượng cá chẽm khoảng 1.600 tấn, giá trị đạt 9,9 triệu USD [36]. Theo báo
cáo của O’Sullivan và cộng sự (2005) niên vụ 2003/2004 sản lượng cá chẽm khoảng
2.800 tấn, đạt giá trị 17,6 triệu USD [36]. Niên vụ 2008/2009 sản lượng cá chẽm cả nước
ước khoảng 6.000 tấn và sẽ tăng lên 7.000 tấn trong niên vụ 2009/2010 [93]

.







5

1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam
Ở nước ta, cá biển được nuôi chủ yếu ở 3 vùng là vùng biển phía Bắc, vùng Nam
Trung Bộ và vùng phía Nam. Năm 2001, sản lượng cá nuôi biển cả nước khoảng 2.600
tấn, năm 2002 sản lượng tăng lên 5.000 tấn, ước tính năm 2010 sẽ đạt 20.000 tấn. Các loài
nuôi chính là các loài cá mú (Epinephelus sp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm
(Lates calcarifer), cá vược mõm nhọn (Psammoperca waigiensis), cá hồng đỏ (Lutjanus
erythropterus), cá tráp đen (Rhabdosargus sarba) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) [36].
Cá chẽm được xem như là vật nuôi xóa đói giảm nghèo và là đối tượng nuôi thay thế cho
diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta. Hiện nay
chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta,
nhưng qua tìm hiểu thông tin từ các báo cho thấy cá chẽm đã nuôi thành công ở một số
nơi như ở Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa) [87], [88], [89], Hương Trà (Thừa Thiên
Huế) [90], Hà Tĩnh [91], Đồng Nai, Bình Định [92], Cà Mau [86].
1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá chẽm (Lates calcarifer) trên thế giới
Tác nhân do vi khuẩn, phần lớn bệnh do vi khuẩn xuất hiện do sự tương tác giữa tác
nhân, cá và môi trường. Cá nuôi trong điều kiện mật độ cao dẫn đến môi trường bị thay
đổi bất thường, điều này ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của cá.
Bệnh Vibriosis: là bệnh do một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V.
anguillarum and V. alginolyticus… gây nên với biểu hiện gây mòn vây, cụt đuôi, xuất

Hình 1.2
S
ản l
ư
ợng cá chẽm (cột) v
à giá tr
ị (đ
ư
ờng) của cá chẽm nuôi ở
Australia từ năm 1986 đến năm 2004 (nguồn FAO, 2006 được trích dẫn bởi [36].

6
hiện nhiều đốm xuất huyết trên bề mặt cơ thể gây lở loét, xuất huyết dưới da và phần cơ.
Đôi khi phần mô xung quanh hậu môn bị viêm và sưng đỏ. Nội quan bên trong cũng bị
sung huyết ở gan, lá lách và thận, thường đi kèm bị hoại tử. Bệnh xảy ra ở nhiều loài cá
biển và cửa sông, chúng thường xuất hiện khi môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu
dinh dưỡng [35]. Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên sậm màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết
loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng [32].
Nghiên cứu của Renaul cho thấy V. damsela là nguyên nhân gây chết hàng loạt ở
cá chẽm con nuôi ở Tahiti (nằm ở khu vực Thái Bình Dương, thuộc Pháp), dấu hiệu chính
của bệnh là cá lờ đờ, xuất huyết ở gốc đuôi và lở loét lan rộng ra [59].
Theo nghiên cứu của Ransangan và cs (2009) thấy sự xuất hiện bệnh do Vibriosis
gây ra cá chẽm Lates calcarifer nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao, tác động rất lớn
đến sản lượng cá nuôi ở nước này. Thông thường cá ở giai đoạn nhỏ biểu hiện bỏ ăn, cơ thể
sậm màu, sau đó chết hàng loạt. Ở giai đoạn trưởng thành, cá có biểu hiện xuất huyết quanh
hậu môn và các gốc vây. Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn
từ các cơ quan bên trong như thận, tim, lá lách và gan. Dựa vào đặc điểm hình thái và hóa
sinh đã xác định sự có mặt của V. alginolyticus [56].
Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do Pseudomonas sp. gây ra và tác động lên cá ở
tất cả các giai đoạn phát triển và gây cá chết từ 20 – 60%. Kumaran

(2009) nghiên cứu
trên cá chẽm Lates calcarifer ở một trang trại vùng bờ biển Đông Nam của Ấn Độ. Cá bị
bệnh thối vây, xuất huyết ở vây, lớp cơ ở miệng và da, màu sắc nhạt. Phân lập vi khuẩn từ
mẫu cá bệnh cho thấy sự có mặt của vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn. Định danh bằng
thử phản ứng hóa sinh và giải trình tự 16S rDNA đã xác định là Pseudomonas sp.
KUMS3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn này trên cá khỏe thấy cá chết sau 2 ngày tiêm
và tỷ lệ chết tích lũy sau 12 ngày tiêm là 70% [46].
Ngoài giống vi khuẩn Vibrio và Pseudomonas thì vi khuẩn Aeromonas cũng gây
xuất huyết trên cá. Bệnh gây ra bởi Aeromonas hydrophila, Aeromonas sorbia,
Aeromonas caviae, Aeromonas spp Các vi khuẩn này thường nhiễm ở cá chẽm nuôi
nước ngọt, làm cho cá bị xuất huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang
nhợt nhạt. Bệnh thường xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương [32].

7
Bệnh do Streptococcus nhiễm trên cá được xem là một bệnh ảnh hưởng đến cá nuôi
và cá ngoài tự nhiên trên khắp thế giới [45], [17], [64]. Streptococcus iniae là tác nhân
gây bệnh chính của bệnh streptococcosis ở cá rô phi (Oreochromis spp.) tại Mỹ và Israel,
và cá hồi vân tại Israel. Tuy nhiên, S. iniae cũng được phân lập từ cá biển bao gồm cá
chẽm châu Âu và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) tại Israel, và cá chẽm (L. calcarifer) ở
Úc với liều gây chết LD
50
là 2,5 x 10
5
CFU/g trong 2 ngày và 3,2 x 10
4
CFU/g trong 10
ngày [60], [27], [28], [29], [18]. Loài này cũng được phân lập từ cá tự nhiên từ Vịnh Eilat
[23]. Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn và kết quả là làm cho
cá chết với tỷ lệ cao. Bệnh này được ghi nhận là tác nhân gây bệnh trên cá chẽm nuôi lồng

biển ở Northern Territory (Australia) năm 2005. Trong trường hợp cấp tính, cá có thể gần
chết hoặc chết với một vài dấu hiệu bên ngoài và trong các nội tạng. Trong trường hợp ít
trầm trọng hơn thì cá bị nhiễm bệnh có thể bơi nhấp nhô gần mặt nước, có thể bị mù và
không đáp ứng với sự kích thích bên ngoài, xuất huyết có thể thấy ở da và đặc biệt ở chân
vây. Cầu mắt bị lồi và xuất huyết bên trong mắt, mang bị xung huyết. Bên trong, sự xuất
huyết nhiều có thể thấy ở bề mặt của các nội quan lớn, thường thì cơ xương có màu đỏ
hồng [35].
Ngoài ra vi khuẩn Flexibacter cũng liên quan đến bệnh lở loét ở cá. Flexibacteriosis
nước mặn gây bệnh ở cá nuôi và cá ngoài tự nhiên ở châu Âu, Nhật Bản, Bắc Mỹ và
Australia [76], [57], [20], [24], [37], [68], [14]. Trong nhóm cá nuôi, căn bệnh này đã
được báo cáo ở cá chẽm. Bệnh xuất hiện trên cả cá trưởng thành và cá giống, tuy nhiên cá
nhỏ chịu ảnh hưởng bệnh nặng hơn cá lớn. Bệnh gia tăng về tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng
khi nhiệt độ nước nuôi cao (trên 15
o
C). Ngoài ảnh hưởng bởi nhiệt độ nước, bệnh này ảnh
hưởng bởi điều kiện gây sốc của môi trường (stress) và yếu tố liên quan đến vật chủ (điều
kiện bề mặt da). Nhìn chung, cá bị bệnh biểu hiện miệng bị xuất huyết và mòn cụt, lở loét
ở da, vây bị xơ và thối đuôi [52].
1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam
Ở Việt Nam, theo báo cáo “ Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên
động vật nuôi biển” của Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2007) thuộc viện Nghiên
Cứu Nuôi trồng Thủy sản II cho thấy một số vi khuẩn như: Vibrio anguillarum, V. ordalii,
V. salmonicida, V. vulnificus là tác nhân chủ yếu gây lên bệnh lở loét trên cá mú, cá chẽm

8
khu vực Đông Nam Á với biểu hiện: xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, vây bị ăn mòn [1]. Kết
quả nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển
ven bờ, mật độ Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biến
động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới [3].
Ở Việt nam, trong nghề nuôi cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số

loài cá biển có giá trị kinh như cá mú, cá chẽm, vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc,
vào mùa mưa ở miền Nam [3].
Theo Đỗ Thị Hòa và cs (2008), cá biển nuôi tại Khánh Hòa có 10 bệnh thường gặp
trên cá biển nuôi là trong đó có bệnh Vibriosis gây bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú, cá
hồng, cá chẽm. Thời gian xuất hiện bệnh chính là mùa khô [4].
1.4. Một vài đặc điểm về vi khuẩn V. alginolyticus
1.4.1 Hệ thống phân loại của V. alginolyticus
Giới Bacteria
Ngành Proteobacteria
Lớp Gamma proteobacteria
Bộ Vibrionales
Họ Vibrionaceae
Giống Vibrio
Loài Vibrio alginolyticus
( Vibrio alginolyticus) [85]

1.4.2 Đặc điểm phân bố của V. alginolyticus
Vibrio alginolyticus là một loài vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng có mặt ở
hầu hết các mẫu thu từ nhiều đối tượng thuỷ sản khác nhau như cá, giáp xác, nhuyễn thể,
rong biển V. alginolyticus có mặt trong môi trường nước mặn ở vùng biển nhiệt đới ôn
hòa và liên quan tới tỷ lệ chết cao trong hệ thống nuôi trồng thủy sản ở vùng biển
Tunisian. Vi khuẩn này thường có mặt ở những người thường ăn hải sản tươi sống hoặc
chưa nấu chín dẫn đến viêm dạ dày ruột và bệnh đại tràng. Những bệnh này thường xuất
hiện vào mùa hè, khi nhiệt độ nước tăng [70].

9
Stephen đã phân lập V. alginolyticus từ 9 / 12 loại hải sản ở vùng biển Ả Rập, với
hầu hết các chủng có nguồn gốc từ việc đánh bắt cá mòi tươi, cá thu, và cua [71] . Vi
khuẩn V. alginolyticus đã được biết là cùng môi trường sống giống với vi khuẩn V.
parahaemolyticus và thường được phân lập từ cùng một loại mẫu. Cả hai đều có thể tồn

tại ở mẫu hải sản bán phổ biến ở chợ tại Jakarta [43].
Vi khuẩn V. alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với V. parahaemolyticus
đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập tại Na Uy, Hà Lan, và Nhật
Bản [34], [44], [67]. Sự phong phú tương đối của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus
trong nước biển nhiệt đới và các nguồn hải sản ít được nghiên cứu, nhưng một báo cáo
gần đây cho thấy một tỷ lệ lớn các mẫu cá biển tươi sống thu được khuẩn lạc màu vàng
hơn là khuẩn lạc xanh trên môi trường thạch TCBS [69]. Sakazaki đã đề xuất V.
alginolyticus là một chỉ số so sánh cho bề mặt bị ô nhiễm thứ cấp của hải sản và đồ dùng
so với V. parahaemolyticus. Tuy nhiên, đề xuất này nên áp dụng đối với các vùng ở khu
vực nhiệt đới, nơi và 2 loài vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus phát triển
phong phú [67].
Theo Zhi, V. alginolyticus được phát hiện từ mẫu tôm ướp muối từ vụ ngộ độc thực
phẩm, là tác nhân gây bệnh thông qua điều tra dịch tễ và kiểm tra nguyên nhân gây bệnh.
V. alginolyticus gây nhiễm trùng máu cho người và nhiễm vào vết thương và nó được tìm
thấy từ mẫu phân của người bị tiêu chảy chưa tìm được nguyên nhân gây bệnh. Từ các
mẫu thức ăn dẫn đến ngộ độc thức phẩm [82]. Vi khuẩn V. alginolyticus cũng liên quan
đến dịch bệnh ở cá biển nuôi và tự nhiên cũng như dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của
nhuyễn thể và giáp xác trên thế giới [84], [81], [19], [41]. Dựa vào nghiên cứu của
Hörmansdorfer, V. alginolyticus được tìm thấy sự có mặt của chúng trong nước biển, chất
lắng cặn ở bề mặt đá san hô [40].
1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V. alginolyticus
Dựa theo nghiên cứu của Hoa T.T.T , V. alginolitycus có đặc điểm phản ứng
dương tính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với ure, arginine và
không phát sáng. Vi khuaant phát triển tốt trong môi trường peptone 1% có chứa 3, 6, 8,
10% NaCl, nhưng lại không phát triển ở 0% NaCl. Ngoài ra vi khuẩn còn dương tính với
glucose, glycerol, mannitol, sucrose nhưng âm tính với lactose, salicin và H
2
S [38].

10

Theo miêu tả của Austin, V. alginolitycus có đặc điểm đặc trưng là phát triển thành
từng cụm trên bề mặt thạch rắn, di động và lên men, Gram (-), hình que, phản ứng dương
tính với catalase, oxidase, Indol, LDC, ODC, nhưng âm tính với ADH. Vi khuẩn này có
khả năng làm tan huyết, phân giải chitin, lipid, gelatin và tinh bột, nhưng không phân giải
aesculin. Lên men đường với Glycerol, maltose, mannitol, mannose, salicin và sucrose
nhưng không lên men đường với arabinose, inositol và lactose. Vi khuẩn phát triển tốt ở
37
0
C, và trong môi trường 7%NaCl, có hoặc không trong 10% NaCl, không mọc trong
0%NaCl, nhạy với 0/129 [13].
Theo một nghiên cứu gần đây của Viên Đại Phúc, V. alginolyticus là vi khuẩn
gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng, bờ
không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Vi Khuẩn
V. alginolyticus có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 3, 7, 10%, nhưng không mọc
được trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+),
ONPG (-) [8]
Ulitzur đã xác định Vibrio alginolyticus có tốc độ phát triển tốt nhất ở 37
o
C. Yếu tố
nhiệt độ, độ muối và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển của vi
khuẩn nghiên cứu này, trong đó nhiệt độ có tác động lớn nhất. Ở 39
o
C thời gian phát triển
giữa các thế hệ là 10 – 11 phút, còn ở 21° C thời gian là 60 phút [74]. Cũng theo Ulitzur ,
sự phát triển các lông rung của roi và hoạt động bơi của vi khuẩn V. alginolyticus phụ
thuộc vào một mối quan hệ phức tạp giữa nhiệt độ, nồng độ muối và độ pH. Ở nhiệt độ
trên 28 ° C các các lông rung của roi V. alginolyticus không phát triển, trừ khi sự có mặt
nồng độ NaCl trong đó; ở nhiệt độ và nồng độ NaCl cao thì quy định sự tổng hợp các lông
rung của roi. Quy định này thấy rõ hơn ở pH 9 so với ở pH 6. Khi nhiệt độ cao và nồng độ
NaCl thấp thì cũng ức chế hoạt động bơi của các tế bào roi có lông rung. Các ion dương,

chẳng hạn như Li
+
, K
+
và Mg
2+
, chỉ thay thế NaCl ở nhiệt độ dưới 28 ° C [75].
Theo Gjerde và Boe cho biết tỷ lệ tăng V. alginolyticus ở trai, cá, nước, và các
mẫu trầm tích từ bờ biển Na Uy trong những tháng hè (tháng Sáu đến tháng Chín) khi
nhiệt độ nước ấm nhất (10 - 16 ° C) . Trong kết quả một báo cáo ở đây, sự xuất hiện của
V. alginolyticus biến động theo mùa, phụ thuộc vào nhiệt độ nước ấm hơn trong mùa khô
(tháng 5-Tháng 9) tại các khu vực nhiệt đới [34].

11
1.4.4 Yếu tố gây độc của V. alginolyticus
Theo nghiên cứu của Josenhans và cs (2002), nhiều vi khuẩn gây bệnh của người,
động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển. Sự xem xét lại các kết luận nghiên cứu gần
đây đã phân tích vai trò của việc di động của các vi khuẩn gây bệnh. Những nghiên cứu
này đã chỉ ra rằng đối với nhiều tác nhân gây bệnh, vận động là điều cần thiết trong một
số giai đoạn của chu kỳ cuộc sống của nó và độc tính đó cùng với sự vận động được điểu
khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen [42]. Hörmansdorfer và cs (2000), V. alginolyticus được
tìm thấy trong 5 mẫu từ 20 mẫu thu từ biển và chất lắng cặn ở bề mặt đá san hô. Dựa vào
đặc điểm hóa sinh đã xác định được 45 chủng vi khuẩn trong đó có 13 chủng là
V. alginolyticus. Tất cả các chủng này đều có tính độc tạo ra sản phẩm men phân
giải casein và lipid, 11 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7 chủng thể hiện tác
dụng với lecithin và 2 chủng có men phân giải hồng cầu. Tất cả các chủng thể
hiện tính không độc với mẫu tế bào thực vật ở tảo nước mặn Asteromonas
gracilis. Điều này có thể khẳng định vai trò của vi khuẩn trong việc làm tàn lụi
và tẩy trắng các rạn san hô cũng như tác nhân gây bệnh trên người [40]. Vi khuẩn
V. alginolyticus là một trong những tác nhân chính gây bệnh Vibriosis trên cá

tráp Sparus aurata L. [22], [15], [83]. Tuy nhiên, một vài chủng V. alginolyticus không
độc và được sử dụng làm chủng vi sinh ở các trại tôm giống thuộc Ecuado, có tác dụng
ngăn chặn bệnh do Aeromonas salmonicida, V. anguillarum và V. ordalii [12].
Xie và cs (2005) cũng báo cáo rằng độ bám dính và các hoạt động thủy phân là
những yếu tố cần thiết cho dấu hiệu bệnh lý và sự nhiễm bệnh của vi khuẩn V.
alginolyticus [81]. Hoạt động thủy phân đã được xem là yếu tố độc tính bởi vì chúng cho
phép vi khuẩn sống sót, sinh sản và xâm lấn các mô vật chủ. hoạt động phân giải protein
của các sản phẩm ngoại bào đã được tương quan với các khả năng gây bệnh của nhiều
loài vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Kết quả đã chỉ ra rằng hầu hết các chủng V.
alginolyticus phân lập trong nghiên cứu này đều có sản phẩm của enzym gelatin, lipid,
ADN và casein, tất cả các yếu tố độc này có thể giúp các sinh vật khác nhiễm vào và sinh
sôi nảy nở [30], [9].
Theo nghiên cứu của Narjol và cs (2006), V. alginolyticus phân lập từ hầu ở
Alaskan có chứa gen trh (thermostable direct haemolysin-related haemolysin), quy định

12
tiết ra chất có tác dụng làm tan hồng cầu, trước đây đã được báo cáo chỉ có ở Vibrio
parahaemolyticus (là yếu tố gây độc của vi khuẩn này). Gen giống trh này đã được tách
dòng và giải trình tự giống đến 98% so với gen trh2 V. parahaemolyticus [54]. Snoussi
(2008) nghiên cứu trên 28 chủng V alginolyticus phân lập từ nước biển từ các bờ biển của
Monastir (Khenis; Tunisia) trên TCBS và xác định các tính chất hóa sinh, eyzym phân
giải protein và khả năng làm tán huyết. Tám gen độc của vi khuẩn V. cholerae (toxR,
toxS, toxRS, toxT, ctxA, VPI, ace, zot) dùng làm mồi trong phân tích PCR để tìm các gen
tương tự trong bộ gen của chủng V. alginolyticus. Hầu hết các chủng nghiên cứu có gen
tán huyết dạng β và sản phẩm phân giải của vài enzym protein. Kết quả phân tích PCR
dựa trên các gen V. cholerae cho thấy sự phân bố lớn trong bộ gen của tất cả các chủng V.
alginolyticus. Các gen mở toxR đã được tìm thấy trong 9 V. alginolyticus chủng trong số
28 chủng nghiên cứu. Chỉ 1 chủng dương với toxS và toxRS, 5 chủng dương với tính độc
của tác nhân gây bệnh (vpi), 7 chủng với toxT, 3 chủng với ctxA và 9 chủng đối với độc
tố (zot). Các chủng này có thể sản xuất ra vài enzyme có tính độc và dễ nhiễm vào các

biểu mô ở người và cơ của cá [70].
Wang và cs (2007) đã chứng minh rằng sự tiết ra enzym phân giải protein ngoại
bào và các chất làm tan huyết cũng như sự lấy sắt được theo quy định của LuxO và σ54
của V. alginolyticus [77].
Gần đây, Amel Ben Kahla-Nakbi (2009) nghiên cứu trên 34 chủng vi khuẩn V.
alginolyticus phân lập từ cá tráp biển (Sparus aurata L.) và cá chẽm (Dicentrarchus
labrax L.) nuôi trong trang trại nuôi cá trên bờ biển Địa Trung Hải Tunisia cho thấy sự
hiện diện của một số độc tính như sự sản sinh các sản phẩm ngoại bào (ECP), tăng trưởng
trong điều kiện giới hạn sắt và sự tồn tại trong huyết thanh cá. Ngoài ra ông còn kiểm tra
sự hiện diện của gen độc tương đồng với với các gen độc ở V. cholerae (toxR, toxS, vpi
và ace); toxR đã được tìm thấy trong 16 chủng V. alginolyticus và toxS trong 17 chủng và
vpi trong 12 chủng trong số 34 chủng phân tích . Như vậy, khả năng gây bệnh của V.
alginolyticus có thể là kết quả của một sự kết hợp của tất cả các yếu tố. Một số yếu tố,
chẳng hạn như khả sắt trong huyết thanh cá, mà ảnh hưởng đến sự sống còn, đã được liên
quan đến đóng góp cho căn bệnh do vi khuẩn V. alginolyticus gây bệnh [11]. Độc lực
cũng liên quan đến khả năng của mầm bệnh để sản xuất các sản phẩm ngoại bào [48],

13
[16]. Theo Balebona và cs (1998b), ECPs chủ yếu bao gồm protease, có thể tạo thuận lợi
các vi khuẩn nhiễm vào phần lớn mô tế bào vật chủ, do đó làm giảm sự cung cấp protein
[16].

14
Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu:
Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên Cứu NTTS III
Thời gian nghiên cứu: từ ngày 15/05/2010 đến ngày 15/03/2011
Đối tượng nghiên cứu: 4 chủng V. alginolyticus phân lập từ cá chẽm nuôi
lồng bị bệnh lở loét, lưu giữ ở tủ đông băng -70
o
C và trong bình nitơ lỏng tại Viện

Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập của đối tượng nghiên cứu
STT

Ký hiệu Nguồn phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét
1 CH10 Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán
2 CoVL03

Vết loét cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán
3 CoS01

Lách cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán
4 CoK03

Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán

2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1 Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng:
Các chủng vi khuẩn được thu thập ở Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III,
được nuôi cấy tăng sinh trong 10ml môi trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30
o
C sau
24 giờ bổ sung 20% glycerol tiệt trùng, phân liều vào trong các tube với thể tích 0,5 ml
dịch khuẩn/tube, dán nhãn và lưu ở tủ đông băng -70
o
C. Khi lấy chủng ra nghiên cứu cần
phục hồi chủng bằng cách, lấy mỗi chủng 1 tube, để ra ngoài ở nhiệt độ phòng cho tan
băng, sau khi tan băng, chuyển dịch khuẩn trong mỗi tube sang ống nghiệm chứa 5ml môi
trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30
o

C sau 18 đến 24 giờ, đưa các chủng cấy ria trên
đĩa thạch TSA 2% NaCl, ủ ở 30
o
C sau 18 đến 24 giờ ta được các khuẩn lạc rời và tiếp tục
đưa các chủng kiểm tra đặc điểm sinh hóa.
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa:
Theo phương pháp truyền thống. Gồm các đặc điểm sinh hóa sau:
- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb &
Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên,1992) [5]. Các bước tiến hành:

15
+ Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng hay từ
khuẩn lạc.
+ Dùng que cấy phết , dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch.
+ Để mẫu khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn
cồn để cố định vi khuẩn.
+ Nhuộm Gram theo các bước sau:
 Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây.
 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
 Nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút.
 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
 Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton, nghiêng lam cho cồn chảy qua vi khuẩn
để tẩy màu.
 Rửa nhanh nước và vẩy cho khô.
 Nhỏ dung dịch Fuchsin trong 1-2 phút.
 Rửa nước, để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô nhưng không
làm xước mẫu).
 Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản
 Vi khuẩn có màu xanh tím – Gram dương (+).
 Vi khuẩn có màu đỏ hồng – Gram âm (-).

- Thực hiện dãy các phản ứng sinh hóa bằng test kit API-20E (Analytical Profile
Index) để xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn:
1. Oxidase
2. Catalase
3. ONPG
4. ADH (Arginine)
5. LDC (Lysine)
6. ODC (ornithine)
7. CIT (Citrate)
8. H
2
S
9. URE (Urea)
10. TDA (Tryptophane)
11. IND (Indol)
12. VP
13. GEL (Gelatine)
14. GLU (Glucose)
15. MAN (Malnitole)
16. INO (Inositole)
17. SOR (Sorbitole)
18. RHA (Rhaminose)
19. SAC (Sucrose)
20. MEL (Melibiose )
21.AMY(Amygdalin)
22. ARA (Arabinose)
23. NO
2
(khử nitrate)

+ Kiểm tra khả năng chịu đựng muối của vi khuẩn ở các nồng độ 0%, 3%, 7% và 10%.

16
+ Kết quả định danh dựa vào kết quả dãy phản ứng sinh hóa, bảng tra kết quả API – 20E
và hệ thống phân loại vi khuẩn của Faddin (1980) [31] , Frerichs (1993) [33] , Holt và cs
(1994) [39].
2.2.3 Nghiên cứu độc lực, xác định LD
50
của vi khuẩn
2.2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực
Lấy vi khuẩn được giữ đông băng ở nhiệt độ -70
o
C để ở nhiệt độ phòng cho rả
đông, lấy 0.2 ml dịch khuẩn nuôi trong bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trường
TSB 2% NaCl. Sau đó đặt trên máy lắc với tốc độ lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng.
Sau khoảng thời gian 18h nuôi cấy thu 1 ml mẫu đem ly tâm với tốc độ 6000 rpm/4
o
C
trong thời gian 10 phút. Hút bỏ phần dịch nổi, rồi hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lý
sao cho mật độ vi khuẩn ở khoảng 10
8
(tạm gọi là dịch gốc). Pha loãng dịch vi khuẩn để
cấy xác định mật độ tế bào trên môi trường TCBS.
 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trên môi trường TCBS
+ Hệ thống pha loãng: hệ số pha loãng bằng 10.
+ Lấy 0.1 ml nước mẫu ở 2 độ pha loãng cuối cùng, nuôi cấy trên môi
trường TCBS. Mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 3 hộp lồng
+ Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-32
o
C, sau 24 giờ đem ra đếm số khuẩn lạc mọc

trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa hợp lồng có cùng độ pha
loãng.
+ Số lượng vi khuẩn tính theo công thức:

X: Số lượng vi khuẩn/ml (cfu/ml)
A: Số khuẩn lạc trung bình ở một độ pha loãng
V: Thể tích mẫu đưa vào nuôi cấy (0.1 ml)
K: Hệ số pha loãng (10)
Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn được lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện.


X =
A
V

x K

17
2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực:
Cá thí nghiệm: cá chẽm mua từ trại sản xuất giống nhân tạo có chiều dài khoảng
10- 12 cm, được nuôi thuần dưỡng trong bể composit trong 2-3 tuần cho đến khi cá quen
với bể nuôi và bắt mồi bình thường. Chọn cá khoẻ mạnh cân đo và phân bố vào hệ thống
bể thí nghiệm.
Điều kiện nuôi:
 Mật độ: 10 con/bể composit 200 lít.
 Độ mặn: 33-35 ‰.
 Nhiệt độ: 27-28
o
C.
 Sục khí liên tục, nước biển qua xử lý chảy liên tục.

 Cho ăn thức ăn tổng hợp Uni-president.
Thí nghiệm cảm nhiễm: Các chủng vi khuẩn thu từ các đợt cá chẽm dịch bệnh bị lở
loét tại địa điểm nuôi ngoài bè Vũng Ngán – Nha Trang của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản III được bố trí thí nghiệm cảm nhiễm. Mỗi chủng vi khuẩn được bố trí ở 4 thang
nồng độ cảm nhiễm lần lượt là 10
2
, 10
3
, 10
4
, 10
5
cfu/g cá bằng cách tiêm dưới da 0.1 ml dịch
khuẩn/con cá. 1 nhóm đối chứng tiêm mỗi con 0.1 ml nước muối sinh lý tiệt trùng và 1 nhóm
đối chứng không tiêm vi khuẩn. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần cho mỗi chủng vi khuẩn.
Chăm sóc cá thí nghiệm: Theo dõi tình trạng sức khoẻ cá thí nghiệm trong thời
gian 10 ngày, hàng ngày cho ăn, siphon lấy thức ăn thừa. Theo dõi ghi chép tình trạng sức
khỏe cá trong thời gian thí nghiệm. Khi xuất hiện cá bệnh, quan sát ghi lại dấu hiệu lâm
sàng và thu mẫu để tiến hành phân lập lại vi khuẩn. Ghi chép số lượng cá chết, tính LD
50
.
Công thức tính LD
50
theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [58]


(Ở đây, bậc pha bằng 10)
A: Độ pha gây tỷ lệ chết tích lũy cao nhất dưới 50%
a: Tỷ lệ chết tích lũy ở độ pha A
B: Độ pha gây tỷ lệ chết tích lũy thấp nhất trên 50%

50 - a
LgLD
50
=
[ LgA + (
b-a
x Lg (bậc pha)) ]