Biểu hiện protein Hemagglutinin của virus cúm AH5N1 trên hệ thống Baculovirus/ tế bào côn trùng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN VĂN KHOA


BIỂU HIỆN PROTEIN HEMAGGLUTININ
CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN HỆ THỐNG
BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG



Chuyên ngành: Sinh lý Động vật
Mã số chuyên ngành: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. CAO THỊ BẢO VÂN




Tp. Hồ Chí Minh-Năm 2011
LỜI CÁM ƠN

Em xin chân thành cám ơn cô TS. Cao Thị Bảo Vân đã tận tình quan
tâm, hướng dẫn và giúp đỡ trong suốt thời gian em làm luận văn.
Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô trong bộ môn Sinh lý Động
vật, khoa Sinh học đã truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm trong

nghiên cứu khoa học tạo cơ sở vững chắc giúp em hoàn thành luận văn.
Chân thành cám ơn các anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm
Sinh học Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM đã hỗ
trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.


Tp. HCM, ngày 13 tháng 11 năm 2011
Học viên



Nguyễn Văn Khoa

Danhmục chữ viết tắt

Luận văn thạc sĩ iv

 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa: axít amin (amino acid)
bp: cặp bazơ (base pair)
cDNA: DNA bổ sung (complementary DNA)
cm: centimeter
dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate
DNA: Deoxyribonucleic acid
E.coli: Escherichia coli
EDTA: Ethylene-Di-amine-Tera-acetic acid
g: gram
HPAI: virus cúm gia cầm độc lực cao (highly pathogenic avian Influenza)

LPAI: virus cúm gia cầm độc lực thấp (low pathogenic avian Influenza)
kb: kilobasepairs (1000 bazơ)
ml: mililiter
mM: milimolar
mRNA: RNA thông tin (messenger RNA)
nm: nanometer
OD: mật độ quang (optical density)
PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction)
pfu: đơn vị hình thành vệt hòa tan (plaque forming unit)
RNA: Ribonucleic acid
RNP: Ribonucleoprotein
UV: tia cực tím (ultraviolet)
Danhmục chữ viết tắt

Luận văn thạc sĩ v

v/v: tỉ lệ phần trăm theo thể tích (v/v)
vRNA: RNA của virus (viral RNA )
WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)
μg: microgram
μl: microliter
μM: micromolar

Mục lục

Luận văn thạc sĩ

 i
MỤC LỤC

Trang
Trang phụ bìa
Lời cám ơn
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt iv
Danh mục bảng và hình vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 3
1.1.1. Tình hình thế giới 3
1.1.2. Tình hình trong nước 5
1.2. Đại cương về virus cúm A/H5N1 6
1.2.1. Phân loại 6
1.2.2. Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1 7
1.2.3. Bộ gen của virus cúm A/H5N1 7
1.2.4. Kháng nguyên hemagglutinin 9
1.2.5. Chu trình sinh sản của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 13
1.2.5.1. Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ 13
1.2.5.2. Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus 13
1.2.5.3. Quá trình đóng gói và nẩy chồi 14
1.3. Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng 15
CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Hóa chất 19
2.1.2. Bộ tách chiết sử dụng 20
2.1.3. Các plasmid 20
2.1.4. Tế bào 20
Mục lục

Luận văn thạc sĩ ii


2.1.5. Thiết bị 20
2.1.6. Các vật liệu khác 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp chứa gen H5 21
2.2.1.1. Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5 21
2.2.1.2. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 22
2.2.1.3. Định lượng sản phẩm khuếch đại 22
2.2.1.4. Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1 22
2.2.1.5. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23
2.2.1.6. Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23
2.2.1.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 24
2.2.2. Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 25
2.2.2.1. Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp 25
2.2.2.2. Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp 25
2.2.2.3. Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp 26
2.2.3. Biểu hiện protein hemagglutinin 26
2.2.3.1. Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp
vào tế bào côn trùng Sf9 26
2.2.3.2. Thu nhận và bảo quản baculovirus tái tổ hợp 27
2.2.3.3. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp 27
2.2.3.4. Biểu hiện protein hemagglutinin 28
2.2.3.5. Thu nhận protein hemagglutinin 28
2.2.3.6. Phản ứng ngưng kết hồng cầu 28
2.2.3.7. Điện di SDS-PAGE 30
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp mang gen H5 32
3.1.1. Thu nhận sản phẩm khuếch đại mang gen H5 32
3.1.2. Tạo dòng plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 33
3.1.3. Kiểm tra plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 35

Mục lục

Luận văn thạc sĩ iii

3.2. Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 38
3.3. Kiểm tra bacmid tái tổ hợp 40
3.4. Biểu hiện protein hemagglutinin 41
3.4.1. Biểu hiện baculovirus tái tổ hợp mang gen H5 41
3.4.2. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp 44
3.4.3. Biểu hiện protein hemagglutinin 46
3.4.4. Xác định và kiểm tra hoạt tính của protein hemagglutinin 48
3.4.5. Xác định vị trí của protein hemagglutinin 50
CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 53
4.2. Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 62
Danh mục bảng và hình 

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Các phân đoạn bộ gen của virus cúm A và protein được mã hóa 8
Bảng 3.1. Hình thái tế bào côn trùng bị baculovirus xâm nhiễm 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 trên thế giới 5
Hình 1.2. Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 tại Việt Nam 6
Hình 1.3. Cấu trúc hạt virus cúm A 7

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc sơ cấp của protein hemagglutinin 10
Hình 1.5. Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer và monomer 12
Hình 1.6. Chu trình sao chép của virus cúm A 14
Hình 1.7. Sơ đồ tạo baculovirus tái tổ hợp dùng BacPAK6 16
Hình 1.8. Sơ đồ mô tả hệ thống Bac-to-Bac® Baculovirus Expression 18
Hình 2.1. Nguyên tắc phản ứng ngưng kết hồng cầu 29
Hình 2.2. Hình minh họa phương pháp điện di SDS-PAGE 31
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại
từ plasmid tái tổ hợp pHW2000-7BTV(H5) 32
Hình 3.2. Sơ đồ plasmid tái tổi hợp pFastBac1-7BTV(H5) 33
Hình 3.3. Các khuẩn lạc E.coli TOP10 trên môi trường sàng lọc 34
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid thu nhận 35
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự plasmid thu nhận 37
Hình 3.6. Khuẩn lạc E.coli DH10Bac trên môi trường sàng lọc 49
Hình 3.7. Sơ đồ chuyển vị pFastBac1 tái tổ hợp vào bacmid 40
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ bacmid thu nhận 41
Hình 3.9. Tế bào Sf9 được chuyển nhiễm 43
Luận văn thạc sĩ vi

Danh mục bảng và hình 

Luận văn thạc sĩ vii

Hình 3.10. Tế bào Sf9 trước và 96 giờ sau khi bị baculovirus xâm nhiễm 45
Hình 3.11. Phản ứng ngưng kết hồng cầu 59
Hình 3.12. Kết quả điện di SDS-PAGE tế bào Sf9 51

Lời mở đầu

LỜI MỞ ĐẦU

Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh, làm từ vong ở người và động vật đang
là mối quan tâm, lo ngại của thế giới. Năm 1997, tại Hồng Kông, virus cúm gia cầm
H5N1 lần đầu tiên lây truyền sang người làm tử vong 6 người trên 18 trường hợp
dương tính
[2], [26]
. Cuối năm 2003, virus cúm H5N1 phát triển thành đại dịch trên
gia cầm ở các nước Đông Nam Á, sau đó lan sang các quốc gia ở châu Âu và châu
Phi. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến ngày 22/06/2011,
tổng số người tử vong trên thế giới là 329 trên 562 trường hợp dương tính với virus
cúm H5N1. Riêng tại Việt Nam, số ca tử vong là 59 trên 119 trường hợp dương tính
H5N1, đứng thứ hai thế giới sau Indonesia
[46]
. Do đó, việc nghiên cứu, phòng ngừa
và ngăn chặn virus H5N1 là công việc hết sức cấp thiết.
Trong số 11 hoặc 12 protein của virus cúm A/H5N1
[7], [45]
, hemagglutinin là
một trong hai protein bề mặt quan trọng nhất mang yếu tố quyết định kháng nguyên.
Đến nay, nhiều công trình nghiên cứu biểu hiện protein hemagglutinin trên các hệ
thống khác nhau đã được công bố như: hệ thống E.coli
[11]
, nấm men
[43]
, thực
vật
[39]
, côn trùng
[26]
và động vật

[19]
.
Trong đề tài này, chúng tôi biểu hiện protein hemagglutinin của chủng virus
cúm A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008(H5N1) trên hệ thống baculovirus/tế bào côn
trùng Sf9 bởi chúng có ưu điểm biểu hiện nhanh chóng một protein có hoạt tính
sinh học. Protein hemagglutinin này được ứng dụng cho những nghiên cứu sâu hơn
như: tạo kháng thế đơn dòng, tạo Kit chẩn đoán hay phát triển vaccine.

Luận văn thạc sĩ 1

Lời mở đầu

Luận văn thạc sĩ 2

Mục tiêu của đề tài:
- Khuếch đại đoạn DNA mang gen H5 của chủng virus cúm
A/DK/VietNam/7B-TV/2008 (H5N1) từ plasmid tái tổ hợp pHW2000-
H5(7BTV).
- Chèn đoạn DNA mang gen H5 vào plasmid pFastBac1.
- Chuyển gen H5 cùng promoter polyhedrin hoạt tính mạnh vào bacmid nhằm
tạo bacmid-H5 tái tổ hợp.
- Chuyển nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 nhằm tạo
baculovirus tái tổ hợp mang gen H5.
- Nhân bản baculovirus tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein hemagglutinin trên tế bào côn trùng Sf9.
- Kiểm tra hoạt tính sinh học của protein hemagglutinin.
- Xác định vị trí của protein hemagglutinin trong tế bào côn trùng Sf9.

Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn: đề tài được thực hiện tại
phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch,Viện Pasteur

thành phố Hồ Chí Minh.

Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 7/2010 – 11/2011.




CHƯƠNG 1:




TỔNG QUAN
TÀI LIỆU
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 3

1.1. Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1
1.1.1. Tình hình thế giới
Virus cúm A/H5N1 được phát hiện đầu tiên trên loài ngỗng tại tỉnh Quảng
Đông, Trung Quốc vào năm 1996, và được đặt tên A/Goose/Guandong/1/96. Chỉ
trong vòng một năm, gen HA (H5) của chúng tái sắp xếp với các gen của virus
H9N2 (A/Quail/HK/G1/97 [H9N2]) và H6N1(A/Teal/HK/W312/97 [H6N1]) phổ
biến ở loài chim cút. Ngoài ra, protein NA của chủng virus H5N1 này mất vùng
thân (stalk region) liên quan đến sự thích nghi của chúng với gia cầm trên cạn. Đến
năm 1997, chủng virus H5N1 tái tổ hợp này lan rộng, gây nên đại d
ịch làm chết hơn
75% gia cầm tại Hồng Kông và truyền trực tiếp từ vật sang người làm 6 người tử
vong trên 18 trường hợp dương tính

[9], [25] [26], [28], [36]
. Tuy nhiên, chúng không có
khả năng truyền từ người sang người. Nhằm loại bỏ các nguồn nhiễm bệnh, hơn 1.5
triệu gia cầm tại Hồng Kông bị tiêu hủy. Thế nhưng, chủng virus cúm H5N1 này và
chủng virus cúm H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông vẫn lưu hành, tiếp tục gây
nên những trận dịch trên gia cầm và chim hoang dã ở Châu Á, làm lo lắng về sự tái
xuất hiện chủng virus H5N1 trên người
[36]
.
Kể từ năm 2000, nhiều chủng virus H5N1 mới được phát hiện ở gà, vịt và
các loài gia cầm khác trên cạn do sự tái sắp xếp giữa gen H5 của chủng
A/Goose/Guandong/1/96 với các gen của virus cúm ở loài chim. Sự đa dạng kiểu
gen của virus H5N1 được phát hiện từ các trận dịch gia cầm tại Hồng Kông vào
những năm 2001-2002
[17], [28]
. Năm 2003-2004, virus thuộc kiểu gen Z (genotype Z)
lưu hành tại miền nam Trung Quốc, sau đó lan sang các nước lân cận như Việt
Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia. Trong khi đó, cũng trong
thời gian này, virus xâm nhập vào Nhật Bản và Hàn Quốc (South Korea) thuộc kiểu
gen V
[22], [28], [31]
. Nguyên nhân chính cho sự lan truyền nhanh chóng này bao gồm
sự di trú của các loài chim hoang dã và sự giao thương, buôn bán gia cầm, các loài
chim hoang dã giữa các quốc gia
[13], [22]
.
Tháng 4 năm 2005, phân dòng Thanh Hải (Qinghai-like sublineage hay
clade 2.2), thuộc kiểu gen Z, bắt nguồn từ một trận đại dịch trên loài chim di trú tại
Tổng quan tài liệu


Luận văn thạc sĩ 4

miền tây Trung Quốc, chỉ trong 7 tháng đã nhanh chóng lan sang các nước
Mongolia, Siberia, Trung Á, Trung đông, Đông Âu, Tây Âu và đến châu Phi vào
năm 2006
[17], [21], [22]
. Từ năm 2007 – 2010, phân dòng này được phát hiện tại các
nước Bangladesh, West Bengal, Nepal, Bhutan
[20]
.
Cuối năm 2005, phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like sublineage hay clade
2.3.4), thuộc kiểu gen V, phổ biến và thay thế hầu hết các phân dòng trước đó tại
Trung Quốc. Phân dòng này cũng gây nên những trận dịch trên gia cầm vào năm
2006 tại các quốc gia Lào, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia
[3], [17], [24], [42]
và tiếp tục
lan rộng tại các tỉnh phía bắc Việt Nam, Trung Quốc vào năm 2009 và Hồng Kông
vào năm 2008.
Phân dòng 2.3.2 (clade 2.3.2) cũng được phát hiện tại Trung Quốc vào năm
2007 và Hồng Kông vào năm 2006. Từ năm 2008-2010, phân dòng này lan sang các
nước Nhật Bản, Lào, Nga, Hàn Quốc, Romania, Nepal. Ngoài ra, phân dòng 7
(clade 7) được phát hiện trên gia cầm tại các tỉnh phía bắc Việt Nam vào năm 2008.
Phân dòng này cũng lưu hành tại Trung Quốc
[20]
.
Từ năm 2003 đến tháng 6/2011, thế giới có 63 quốc gia, lãnh thổ phải gánh
chịu những thiệt hại nặng nề từ các trận dịch do virus cúm H5N1 gây nên
[19]
. Tính
đến ngày 22/06/2011, thế giới có 562 người nhiễm virus cúm H5N1 tại 15 quốc gia,

trong đó số người tử vong là 329 (tỉ lệ 58,5%)
[46]
.
T

L



tr
h
i
c
ủ
l
ư
g
i
n
h
N
ph
n
ê
K
c
á
2
0
T

ổ
ng quan
uận văn t
h
Hìn
1.1.2. Tìn
Việ
t
ận đại dịc
h
i
ện trên gi
a
ủ
a chủng
v
ư
ờng trước
i
a cầm H5
N
h
iên,
t
ừ n
ă
N
ăm 2006,
h
ân dòng

P
ê
n những
t
K
iến, phân
d
á
c
t
ỉnh phí
a
0
07
[3], [24]
.
tài l
i
ệu

h
ạc sĩ
h 1.1. Số tr
ư
h hình tr
o
t
Nam là
m
h

cúm gia
a
cầm tại
V
v
irus H5N
và làm
t
ử
N
1 chủ yế
u
ă
m 2006, p
h
Việt Na
m
P
húc Kiến
tr
ận dịch
c
d
òng clad
e
a
Nam. P
h
Từ năm 2
0

ư
ờng hợp n
h
o
ng nước
m
ột trong
n
cầm H5
N
V
iệt Nam t
ừ
1 kiểu ge
n
vong ở n
g
u
xảy ra tr
ê
h
ần lớn cá
m
đã xuất
h
. Phân dò
n
c
hủ yếu tạ
i

e
1 và thể
t
h
ân dòng P
h
0
08 đến n
ă
h
iễm và tử
v
n
hững quố
c
N
1. Chủng
ừ
năm 200
n
Z đã gâ
y
g
ười
[24]
. T
ừ
ê
n vùng c
h

c t
r
ận dịc
h
h
iện thêm
c
n
g này tha
y
i
các
t
ỉnh
p
t
ái
t
ổ hợ
p

g
h
úc Kiến
g
ă
m 2010,
m
5
v

ong do cú
m
c
gia chịu
virus cú
m
1. Tuy nhi
y
nên nhữ
n
ừ
cuối nă
m
h
âu thổ sô
n
h

t
ậ
p
trung
c
hủng vir
u
y
thế
p
hâ
n

p
hía Bắc.
T
g
iữa hai p
h
g
ây bệnh
ở
m
ột số trậ
n
m
A/H5N1 t
r
ảnh hưởn
g
m
H5N1 đ
ộ
ên, đến nă
m
n
g t
r
ận đại
m
2003-20
0
n

g Hồng v
à
tại các tra
n
u
s H5N1
m
n
dòng cla
d
T
rong khi
h
ân dòng n
à
ở
người đư
ợ
n
dịch gia
c
r
ên thế giới
[
g
nặng nề
n
ộ
c lực cao
m

2003, s
ự
dịch gia
c
0
6, các t
r
ậ
n
à
sông Mê
K
n
g t
r
ại ch
ă
m
ới có ng
u
d
e 1 t
r
ước
đó, phân
d
à
y được p
h
ợ

c xác nh
ậ
c
ầm diễn r
a

[
46]

n
hất từ cá
c
được phá
t
ự
xuất hiệ
n
c
ầm khôn
g
n
dịch cú
m
K
ông. Tu
y
ă
n nuôi
[21]
.

u
ồn gốc t
ừ
đó và gâ
y
d
òng Phú
c
h
át hiện tạ
i
ậ
n vào nă
m
a

r
ải rác d
o
c

t

n

g

m

y

.

ừ

y

c

i

m

o

Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 6

các chủng virus cúm phân dòng Clade 1, clade 7, clade 2.3.2, clade 2.3.4 (phân
dòng Phúc Kiến) gây nên
[19], [20]
. Tính đến ngày 22/06/2011, Việt Nam có số người
tử vong do virus cúm H5N1 là 59 trên 119 trường hợp dương tính với virus cúm
H5N1, đứng thứ hai thế giới, sau Indonesia
[46]
.

Hình 1.2. Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 tại Việt Nam
[46]

1.2. Đại cương về virus cúm A/H5N1
1.2.1. Phân loại
Virus cúm gia cầm H5N1 là một thứ týp của chi virus cúm A, họ
Orthomyxovidae
[29]
. Họ Orthomyxovidae gồm bốn chi: virus cúm A, B, C và
Thogotovirus được phân biệt dựa trên hai kháng nguyên, nucleoprotein (NP) và
protein chất nền M1 (matrix)
[14], [16]
. Virus cúm A lại được chia thành nhiều thứ týp
dựa trên 2 kháng nguyên glycoprotein bề mặt: hemagglutinin (HA) và
neuraminidase (NA). Cho đến nay, đã có 16 kiểu HA (H1-H16) và 9 kiểu NA (N1-
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 7

N9) khác nhau
[37]
. Sự kết hợp các kiểu HA và NA đã hình thành nhiều thứ týp virus
cúm A khác nhau
[20]
.
1.2.2. Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1
Virion điển hình của virus cúm A/H5N1 có dạng cầu, đường kính 100-
200nm
[3]
. Ở cấp độ vi thể, ngoài cùng của virion là màng lipid có nguồn gốc từ
màng tế bào chủ. Các glycoprotein HA và NA nhô lên khỏi màng lipid. Tỉ lệ HA và

NA khoảng 4:1. Một số lượng nhỏ kênh M2 xuyên qua màng lipid. Tỉ lệ giữa M2
và HA là 1/10-1/100. Bên trong các protein xuyên màng HA, NA, và M2 là lớp chất
nền được tạo thành từ các protein M1. Chất nền M1 bao bọc lõi của virion và xác
định hình thái virion. Phần lõi gồm:
- Protein xuất nhân NEP (Nuclear Export Protein), còn gọi protein không cấu
trúc NS-2 (Nonstructural Protein 2).
- Phức hợp Ribonucleoprotein (RNP) chứa các đoạn RNA quấn quanh
Nucleoprotein (NP).
-
Ba loại RNA polymerase: PB1, PB2 và PA
[7], [22]
.

Hình 1.3. Cấu trúc hạt virus cúm A. (A) Sơ đồ virus cúm A
[15]
. (B) Virus cúm dưới kính
hiển vi điện tử
[13]
.

1.2.3. Bộ gen của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 gồm 8 đoạn RNA mạch đơn (vRNA), mạch âm mã hóa
11 hoặc 12 loại protein: hemagglutinin (HA); neuraminidase (NA); protein M2 và
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 8

M1; 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và PB1-N40 (mới được phát hiện);
nucleoprotein NP; 3 polymerases: PB1, PB2, và PA và PB1-F2.
Các đoạn vRNA số 1, 3, 4, 5 mã hóa lần lượt các protein PB2, PA, HA, NP.

Đoạn vRNA số 2 mã hóa polymerase PB1 và PB1-F2 ở hai khung đọc mở (reading
frame) khác nhau. Gần đây, người ta đã phát hiện thêm protein PB1-N40 có mã mở
đầu AUG thứ 5, bộ ba mã hóa (codon) thứ 40, cùng khung đọc mở với PB1. Đoạn
vRNA số 6 mã hóa protein NA. Đoạn vRNA số 7 mã hóa protein chất nền M1.
Ngoài ra, đoạn vRNA số 7 cũng mã hóa kênh M2 thông qua quá trình ghép nối
(splicing) mRNA. Cuối cùng, đoạn vRNA số 8 mã hóa protein NS1 và bằng cơ
chế
ghép nối mRNA, vRNA số 8 cũng mã hóa protein NEP/NS2.
Phần cuối của mỗi đoạn vRNA hình thành cấu trúc kẹp tóc (helical hairpin).
Phần còn lại của vRNA được bao bọc bởi nucleoprotein thông qua tương tác giữa
điện tích dương của arginine trên nucleoprotein với điện tích âm của khung
phosphate trên vRNA. Các đoạn vRNA đều có trình tự không mang mã (noncoding)
mang tính bảo tồn cao ở cả hai đầu 3’ và 5’. Promoter, nằm trên trình tự không
mang mã, chứa trình tự đặc hiệu đối với phức hợp polymerase, điều này cần thiết
cho quá trình sao chép và phiên mã vRNA. Ngoài ra, trình tự không mã hóa cũng
chứa tín hiệu polyadenyl và một phần tín hiệu đóng gói virus
[7], [28], [45]
.
Bảng 1.1. Các phân đoạn bộ gen của virus cúm A và protein được mã hóa
[7], [45]
.
vRNA Số
Nucleotide
Protein Số
aminoacid
Chức năng
1 2341 PB2 759 Thành phần của phức hợp enzyme
phiên mã; nhận diện mũ chụp trên
mRNA của tế bào chủ.
2 2341 PB1 757 Thành phần của phức hợp enzyme

phiên mã; xúc tác phản ứng kéo
dài RNA; hoạt tính endonuclease.
PB1 – F2 87 Hoạt tính tiền apoptosis.
N40 Chưa biết
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 9

3 2233 PA 716 Thành phần của phức hệ enzyme
phiên mã; hoạt tính protease.
4 1778 HA 550 Glycoprotein bề mặt; gắn kết thụ
thể và có hoạt tính dung hợp; yếu
tố chính quyết định kháng nguyên.
5 1565 NP 498 Kết hợp với các đoạn RNA virus
nhằm hình thành cuộn
ribonucleoprotein; điều hòa vận
chuyển vRNA vào nhân.
6 1413 NA 454 Glycoprotein bề mặt; hoạt tính
sialidase giúp phóng thích virus ra
khỏi tế bào chủ.
7 1027 M1 252 Protein chất nền; tương tác với
vRNP, điều hòa xuất RNA khỏi
nhân, nẩy chồi.
M2 97 Kênh ion; tháo vỏ và đóng gói
virus.
8 890 NS1 230 Protein ức chế sản xuất interferon;
điều hòa biểu hiện gen của tế bào
chủ.
NEP/NS2 121 Xuất RNA của virus khỏi nhân.

1.2.4. Kháng nguyên hemagglutinin
Hemagglutinin H5 là một protein lớn, phức tạp và trải qua quá trình biến
đổi sau dịch mã như gắn đường (glycosylation) và hình thành cầu nối disulfide
[13]
.
Thật vậy, protein H5 được cấu tạo bởi ba tiểu phần (trimeric molecule), trong đó
mỗi tiểu phần (monomer) gồm hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 liên kết với nhau
bởi cầu nối disulfide
[4]
. HA1, kết thúc bằng nhóm amino, chứa nhiều vị trí được
gắn nhóm đường (glycosylation site), vị trí gắn với thụ thể trên tế bào chủ và vị trí
T

L

q
u
ph
pe
l
ư
c
h
pr
H
p
r
v
ớ
b

ề
a
c
m
(
g
v
i
v
ù
tr
ú
H
H
(
2
H
ở
G
T
ổ
ng quan
uận văn t
h
u
yết định
k
h
ần xuyê
n

e
ptide)
[13]
ư
ới nội ch
ấ
h
uyển đến
r
otease củ
a
H
ình 1.4 S
ơ
r
otease nội
b
ớ
i nhóm ami
n
ề
mặt cấu tr
ú
c
id sialic trê
n
m
ục tiêu giúp
Cấ
u

g
lobular h
e
i
rus, hoàn
ù
ng enzy
m
ú
c: Vùng
H
A1 đánh
s
H
A1 (134-
1
2
21-228 H
A
H
179 (Y98,
người và
G
ln226 và
G
tài l
i
ệu

h

ạc sĩ
k
háng ngu
y
n
màng (t
r
. Protein
H
ấ
t, tại đây
c
bề mặt t
ế
a

t
ế bào ch
ủ
ơ
đồ cấu tr
ú
b
ào thành 2
m
n
o và HA2
k
ú
c dạng cầu.

n

t
ế
b
ào. H
A
virus xâm n
h
u
trúc thứ
e
ad) và p
h
toàn được
m
e esterase
xoắn α (
α
s
ố theo H
3
1
38 HA1
đ
A
1 đánh s
W153, H
1
gia cầm

c
G
ly228 trê
n
y
ên
[13]
. T
r
r
ansmemb
r
H
5 được t
ổ
c
húng
t
ậ
p

ế

b
ào thô
n
ủ
như tryp
t
ú

c sơ cấp c
ủ
m
ảnh HA1
v
k
ết thúc với
n
HA1 cũng
A
2 chứa vù
n
h
ập vào tế
bà
cấp của
h
h
ần thân d
ạ
t
ạo thành
vestigial.
V
α
-helix): 1
9
3
); hai vò
n

đ
ánh số th
e
ố theo H3
)
1
83 đánh
s
c
ó hai vị
t
n
H3) gắn
r
ong khi,
H
r
ane porti
o
ổ
ng hợ
p

d
hợp lại th
à
n
g qua bộ
t
ase Clara,

ủ
a protein h
v
à HA2 liên
k
n
hóm carbo
x
chứa các vị
n
g xuyên mà
n
à
o.
h
emagglut
i
ạ
ng sợi (fi
b
bởi HA1,
V
ị trí gắn
v
9
0-helix,
a
n
g (loop)
g

e
o H3) và
)
cùng mộ
t
s
ố theo H3
)
t
rí quan t
r
với liên k
ế
10
H
A2, kết t
h
o
n) và pe
p
d
ưới dạng
p
à
nh dạng t
r
máy Gol
g
phân cắt
H

emagglutin
i
k
ết với nha
u
x
yl. HA1 ch
ứ
trí có gắn n
h
n
g và pepti
d
i
nin gồm
b
rous stal
k
chứa vị tr
í
v
ới thụ th
ể
a
mino aci
d
g
ồm: 130-
l
220-loop,

t
số acid
a
)

[30], [40], [4
8
r
ọng Gln2
2
ế
t
axít sial
i
h
úc bằng
n
p
tide dun
g
p
olypepti
d
r
imer. Sau
g
i. Tại bề
H
A0 thàn
h

i
n. Tiểu phầ
n
u
bởi liên kế
t
ứ
a 5 vị trí k
h
h
óm đ
ư
ờng
d
e kị nước c
hai phần:
k
)
[14]
. Ph
ầ
í
gắn với
t
ể
trên H5 g
d
184-186
l
oop, ami

n
amino aci
a
min bảo t
ồ
8
]
. Đặc biệ
t
2
2 và Gl
y
i
c-
α
2, 3-
g
n
hóm carb
o
g
hợ
p
mà
n
d
e HA0 c
h
đó, chún
g

mặt tế
b
à
o
h
HA1 và
H
n
HA đ
ư
ợc
p
t
disulfide.
H
h
áng nguyên
và vị trí gắ
n
ó khả năng
phần đầu
ầ
n đầu nằ
m
t
hụ thể tế
b
ồm 3 thàn
h
trên HA

1
n
o acid 13
0
i
d 217-22
4
ồ
n khác Y
9
t
, H5 của
v
y
224 (tươ
n
g
alactose
(
S
o
xyl, chứ
a
n
g (fusio
n
h
uỗi đơn
ở
g

được vậ
n
o
, enzym
e
H
A2.
[40]
.
p
hân cắt bở
i
H
A1 kết thú
c
(A – E) trê
n
n
với thụ th
ể
x
uyên màn
g
dạng cầ
u
m
xa màn
g
b
ào chủ v

à
h
phần cấ
u
1
(188-19
0
0
-134 trê
n
4
trên HA1
9
1, W149
,
v
irus H5N1
n
g ứng vớ
i
S
A-α-2, 3
-
a

n

ở

n

e


i

c

n

ể

g

u

g

à

u

0

n


,

i

-
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 11

Gal) trên thụ thể của tế bào chủ
[4], [14], [17]
. Phần thân của protein H5 gần màng
virus, chứa tiểu phần HA2 và hai đoạn trên tiểu phần HA1 tại vị trí acid amin 1-55
và 275-329 tạo thành các cấu trúc xoắn ốc. Ngoài ra, vùng thân còn chứa vị trí phân
cắt giữa HA1 và HA2
[4], [40]
.
Các kháng nguyên trên H5 chủ yếu nằm quanh vùng gắn với thụ thể, phần
còn lại nằm ở vùng enzyme esterase vestigial
[40]
. Quan trọng hơn, trên H5 có 3 vị
trí kháng nguyên thường xuyên đột biến nên thoát khỏi hệ miễn dịch của vật chủ
(escape mutant): vị trí 1: vòng acid amin 136-141 (140-145 đánh theo H3) trên
HA1; vị trí 2: acid amin 152 và 153 (156 và 157 đánh số theo H3) trên HA1; vị trí
3: acid amin 124-129 (129-133 đánh theo H3) trên HA1 (đánh số theo H3)
[11], [40]
.
Glycosyl hóa protein có nhiều vai trò quan trọng đối với virus.
Oligosacharide bảo vệ virus thoát khỏi hệ miễn dịch của vật chủ. Những vị trí có
gắn nhóm đường có thể làm giảm hoặc mất khả năng gắn của kháng thể đơn dòng.
Ngược lại, vị trí mất nhóm đường có thể tạo ra kháng nguyên lạ
[10], [12], [40]

. Trên H5
có các vị trí chứa acid amin được gắn nhóm đường (glycosylation site): 11, 23, 154,
165, 286 trên HA1 (21, 33, 158, 169, 289 trên HA1 đánh số theo H3) và vị trí bảo
tồn 154 (đếm theo H3) trên HA2 (hình 2C và D). Đặc biệt, nhóm đường
oligosacharide gắn với acid amin 154 trên HA1, ngoại biên của vị trí gắn thụ thể
(được đánh dấu vòng 150s hình 2C), làm giảm khả năng gắn với thụ thể. Nhờ đó,
virus có thể dễ dàng xâm nhập giữa các loài vật chủ hay tế bào chủ khác nhau
[4], [8]
.
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 12


Hình 1.5. Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer và monomer. (A) Sơ đồ
protein H5 dạng trimer (A/Dk/Sing/97). Vùng gắn với thụ thể (màu xanh). Vùng enzyme vestigial
(màu vàng). Vùng đuôi HA2 (màu đỏ), đoạn 1-52 trên HA1 (màu hồng) và đoạn 275-307 trên HA1
(màu tía). Chuỗi oligosacharide được đánh dấu bởi các vòng tròn nhỏ. (B) Sơ đồ H5 dạng
monomer (A/Dk/Sing/97). Xoắn ốc A, xoắn ốc B và vòng nối giữa chúng. Peptide dung hợp HA2.
N1 và C1 tại hai đầu HA1. N2 và C2 tại hai đầu HA2. Vị trí gắn với thụ thể và hai vòng kháng
nguyên 140s và 150s. Các chuỗi oligosacharide quan trọng được đánh dấ
u bởi các vòng tròn nhỏ.
Các vị trí có gắn nhóm đường bao gồm: 21, 33, 169, 289 trên HA1 và 154 trên HA2.

Vị trí phân cắt giữa HA1 và HA2 nằm ở vùng thân của HA. Sự phân cắt
HA có liên quan đến độc lực của virus cúm A
[14]
. Trình tự phân cắt R-X-R/K-R
được nhận biết bởi furin là đặc tính chung của trình tự acid amin có tính base. Đối
với H5, HA1 và HA2 bị phân cắt tại những trình tự mang nhiều acid amin có tính

base (base sequence) được thêm vào vị trí phân cắt
[9]
. Ngoài ra, có sự khác biệt
giữa trình tự phân cắt trên H5 của chủng độc lực cao và chủng độc lực thấp. Chẳng
hạn, chủng H5N1 độc lực cao có trình tự phân cắt R-K-K-R, thậm chí R-R-R-K-K-
Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 13

R, trong khi chủng H5N2 hay chủng H5N1 độc lực thấp có trình tự phân cắt R-E-T-
R
[6]
.
Peptide dung hợp, bao gồm một phần nhỏ khoảng 20 amino acid phía đuôi
Nitơ trên HA2, nằm ở gốc của phần thân (fibrous stem)
[5], [14]
. HA2 có vai trò dung
hợp màng tế bào chủ, giúp virus xâm nhập vào tế bào. So với HA1, trình tự HA2 có
tính bảo tồn giữa các phân týp của virus cúm
[28]
. Amino acid ở vị trí 1 kết thúc
bằng nhóm chứa Nitơ luôn là Gly và được bảo tồn giữa các chủng HA. Amino acid
tại vị trí này đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính dung hợp. Đột biến tại vị trí
này, ngoại trừ đột biến thành alanin, sẽ làm mất khả năng dung hợp của virus
cúm
[5],[12]
.
1.2.5. Chu trình sinh sản của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ
1.2.5.1. Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ
Khởi đầu, HA của virus gắn vào acid sialic trên thụ thể của tế bào chủ.

Dưới tác dụng của pH thấp trong thể nội bào (endosome) hiện diện trong tế bào chủ,
cấu trúc của HA bị biến đổi, để lộ đầu N kị nước trên HA2 có vai trò dung hợp
màng virus với màng endosome. Tiếp theo, kênh proton M2 mở ra tạo điều kiệ
n cho
lõi của virus tiếp xúc với pH thấp. Ở điều kiện này, chất nền M1 phân ly và giải
phóng RNP vào tế bào chất. Sau đó, nhờ vào tín hiệu hướng nhân (nuclear
localization signal), RNP được vận chuyển đến nhân thông qua các lỗ màng nhân
theo cơ chế phụ thuộc ATP
[3], [6], [7], [14]
. Thời gian tính từ lúc virus bám vào tế bào
cho đến khi tháo vỏ hoàn toàn là 20-30 phút
[6]
.
1.2.5.2. Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus
Quá trình tổng hợp bộ gen virus được thực hiện trong nhân tế bào chủ
[7]
.
Vùng 5/cap trên mRNA của tế bào chủ bị cắt bởi enzyme PB1 của virus và được
dùng làm mồi (primer) cho quá trình phiên mã bộ gen virus
[3]
. Mồi được tạo ra có
kích thước 10-13 nucleotide, gắn mũ chụp (cap)
m7
GpppXm, chứa trình tự 5’-GCA-
3’ ở gần đầu 3’
[14]
. Virus sử dụng enzyme transcriptase của nó để thực hiện quá
trình phiên mã này
[3]
. RNA polymerase dùng vRNA mạch âm của virus làm mạch

T

L

k
h
d
ị
b
ộ
ri
b
tr
t
h

k
h
v
ậ
T
ổ
ng quan
uận văn t
h
h
uôn (tem
p
ị
ch mã thà

n
ộ
gen viru
s

Qu
á
b
onucleot
i
ình kéo d
à
h
êm poly(
A
1.2.5.3. Q
Rib
o
h
ỏi nhân
đ
ậ
n chuyển
tài l
i
ệu

h
ạc sĩ
p

la
t
e) để t
ổ
n
h protein
s

[7]
.
H
ì
á
trình
t
ổn
i
de G trên
à
i được th
ự
A
) vào cuố
i
uá trình
đ
o
nucleopr
o
đ

ến vị trí t
ậ
đến tế
b
à
o
ổ
ng hợ
p
h
a
và cRNA
ì
nh 1.6. Ch
u
g hợ
p
m
R
mồi với
r
ự
c hiện bở
i
i
mRNA,
c
đ
óng gói v
à

o
tein của
v
ậ
p kết ở m
à
o
chất theo
a
i RNA m
ạ
(complem
e
u
trình sao c
R
NA của
v
r
ibonucleo
t
i
tiểu phần
c
ách 15-22
à
nẩy chồ
i
v
irus (vR

N
à
ng sinh c
h
con đườn
g
14
ạ
ch dương:
e
ntary RN
A
hép của vir
u
v
irus được
t
ide C gầ
n
PB1. Qu
á
nucleotid
e
i

N
P) tổng
h
h
ất để đó

n
g
qua trun
g
mRNA d
ù
A
) cần thi
ế
u
s cúm A
[35]
bắt đầu
b
n
đầu phía
á
trình sao
e
so với đầ
h
ợp xong
n
g gói và
n
g
gian pro
t
ù
ng làm m

ạ
ế
t cho sao
c
]
. 
b
ằng sự b
ắ
3’ trên v
R
mã kết th
ú
ầ
u 5’ trên v
được vận
n
ảy chồi. v
R
t
ein Crm1
ạ
ch gốc đ
ể
c
hép thàn
h

ắ
t cặp giữ

a
R
NA. Qu
á
ú
c khi BP1
RNA
[14]
.
chuyển r
a
R
NP đượ
c
của tế
b
à
o
ể

h

a

á


a

c

o

Tổng quan tài liệu

Luận văn thạc sĩ 15

chủ. Ba protein M1, NP và NEP của virus đóng vai trò quan trọng trong quá trình
này. Các protein Crm1, M1, NP và NEP tương tác với nhau tạo thành phức hợp
Crm1-NEP-M1-vRNP giúp vRNP thoát ra khỏi màng nhân đi vào tế bào chất. Các
protein vỏ HA, NA và M2 sau khi tổng hợp xong được biến đổi sau dịch mã tại hệ
thống lưới nội chất-bộ máy Golgi, sau đó được vận chuyển đến vị trí tập kết
[17]
.
Quá trình nẩy chồi xảy ra ở màng tế bào chủ, được bắt đầu bởi sự tích lũy
protein chất nền M1 tại bề mặt lớp đôi lipid phía trong tế bào chất
[7]
. Khi quá trình
nảy chồi hoàn tất, các mấu gai (spike) HA tiếp tục gắn virion với acid sialic trên thụ
thể tại bề mặt tế bào chủ. Thông qua hoạt tính sialidase của protein NA, các thành
phần của virus chủ động được phóng thích ra ngoài. Protein này có khả năng phá
hủy các thụ thể bằng cách cắt các thành phần liên kết với đuôi acid sialic ra khỏi
glycoprotein và ganglioside trên bề mặt tế bào chủ nhằm giải phóng virus ra khỏi tế
bào
[7]
. Thời gian từ khi virus xâm nhập vào tế bào đến lúc tạo ra virus mới trung
bình khoảng 6 giờ
[6]
.
1.3. Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng

Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng là công cụ dùng để biểu hiện protein
có cấu trúc phức tạp. Một trong những ưu thế của hệ thống này là cung cấp nhanh
chóng protein có hoạt tính sinh học. Ngoài ra, nó còn được dùng để sản xuất kháng
nguyên của virus.
Baculovirus là tác nhân gây bệnh ở côn trùng và không có khả năng sao
chép ở động vật xương sống. Bộ gen của baculovirus có dạng DNA vòng mạch đôi,
kích thước khoảng 130 kb. Tế bào côn trùng có khả n
ăng biến đổi sau dịch mã như
glycosyl hóa, hình thành cầu nối disulfide, phosphoryl hóa cần thiết cho hoạt tính
sinh học của những protein phức tạp. Tuy nhiên, sự hình thành các nhóm đường
phức tạp hiếm khi xảy ra ở tế bào côn trùng. Sau khi baculovirus xâm nhiễm vào tế
bào côn trùng, tế bào thực hiện sao chép DNA bộ gen và biểu hiện protein
baculovirus cho đến khi tế bào chết. Ở hệ thống biểu hiện baculovirus, protein
thường được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter mạ
nh trên gen polyhedrin.
Nhìn chung, protein được sản xuất ở tế bào côn trùng có hoạt tính sinh học
[13]
.