Chẩn đoán virus viêm não nhật bản (japanese encephalitis virus) bằng kỹ thuật rt lamp (loop mediated isolathermal amplification)

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chủ đề:
CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT
BẢN (JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS)
BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP (LOOP-
MEDIATED ISOLATHERMAL
AMPLIFICATION)
Nhóm thực hiện: Giáo viên hướng dẫn:
Nhóm 3 PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10/2009
MỤC LỤC
I. Đặt vấn đề
II. Tổng quan tài liệu
1. Định nghĩa bệnh VNNB
2. Virus VNNB
3. Phân bố virus VNNB
4. Chu trình lây nhiễm của virus VNNB
5. Đặc điểm bệnh VNNB
6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP
a. Khái niệm kỹ thuật LAMP
b. Thiết kế mồi cho LAMP
c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP
d. RT-LAMP
e. LAMP phát hiện SNP
f. Đọc kết quả
III. Vật liệu và Phương pháp
1. Định tính virus VNNB
a. Vật liệu

b. Phương pháp
c. Đọc kết quả
2. Định lượng virus VNNB
d. Vật liệu
e. Phương pháp và tính toán
IV. Kết luận
V. Tài liệu tham khảo
I. Đặt vấn đề
Theo thông báo của viện vệ sinh dịch tễ trung ương, mỗi năm có
khoảng 3.000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có từ 30-40% bị viêm não
Nhật Bản. Bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) do muỗi truyền
và phát triển mạnh vào mùa nắng nóng, phù hợp với điều kiện hoạt động của
muỗi truyền bệnh nên thường gọi là bệnh viêm não mùa hè hay viêm não B.
Viêm não Nhật Bản là bệnh do muỗi truyền virut gây bệnh, giống các bệnh
nhiễm virus khác do muỗi truyền như sốt xuất huyết (Dengue fever), sốt
vàng (Yellow fever) Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc
trị do vậy thường có tỷ lệ tử vong cao hoặc để lại di chứng nặng nề.
Trong thập kỷ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là
hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại
hầu hết các địa phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng
bằng châu thổ sông Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6 -
10/100.000 dân với tỷ lệ tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác
nhân gây ra 50% - 70% HCNC. Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải
rác quanh năm, số mắc cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100.000 dân và
tỷ lệ tử vong 27,46%, thưòng tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long
vựa lúa của miền Nam, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà. Chưa tiến hành
nghiên cứu có hệ thống tại đây, nhưng qua kết quả báo cáo sơ bộ của bệnh
viện lớn tại TP. HCM, từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện có tác
nhân gây bệnh là virút VNNB, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16% (BS. Võ
Công Khanh, 2007).

Vì hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB và người bị bệnh
VNNB có nguy có tử vong cao, nếu có điều trị khỏi bệnh thì cũng để lại
những di chứng hết sức nặng nề về thần kinh. Do đó, để hạn chế những hậu
quả do bệnh VNNB đem lại cần sử dụng kỹ thuật gene để chẩn đoán phát
hiện sớm virus VNNB sớm ngay khi virus mới xâm nhâp vào cơ thể hay
trong thời gian ủ bệnh.
II. Tổng quan tài liệu
1. Định nghĩa bệnh VNNB
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra
bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần
kinh, có tên là virút viêm não Nhật Bản. Virút lây truyền qua người nhờ
trung gian của loại côn trùng tiết túc là muỗi. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay
thành dịch.
Tùy theo mức độ và vị trí bị tổn thương tại hệ thần kinh trung ương
(HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như:
viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối
hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống (BS.Võ Công Khanh,
2007).
2. Virus VNNB
Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flavivudae, được
tách từ họ Togavirudae. Hình cầu, nhân chứa ribonucleic acid (RNA), kích
thước 45 - 50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ
giàu chất lipid (hình 1).
Hình 1: virus VNNB
Cấu trúc kháng nguyên của virus VNNB B có liên quan mật thiết với
kháng nguyên của virus viêm não Murray Valley, virus viêm não West Nile,
virus viêm não Saint Louis. Do vậy, ba virus viêm não này được xếp vào
nhóm virus VNNB B (Phạm Sỹ Lăng – Nguyễn Thiện, 2004).
Hình 2:các chủng virus VNNB
3. phân bố của virus VNNB

Các virus trong nhóm virus VNNB phân bố và gây bệnh khắp nơi trên
thế giới, riêng virus VNNB lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông á,
Nam Á, và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam (hình 3).
Hình 3: phân bố của virus VNNB và các virus trong nhóm VNNB
4. Chu trình lây nhiễm virus VNNB
Virus VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ
động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung
gian của côn trùng tiết túc hút máu là muỗi. Chim là vật chủ cơ bản của chu
trình Chim - Muỗi trong việc duy trì virus VNNB trong tự nhiên, nhưng
chưa có nghiên cứu rõ về vai trò quan trọng của chim trong việc truyền virus
VNNB qua muỗi đến người.
Hình 4: Đường lây truyền bệnh viêm não Nhật Bản
Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus
VNNB, và chu trình Heo - Muỗi tồn tại quanh năm. Người sống gần chu
trình sinh thái tự nhiên này, có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt. Người được
coi là vật chủ cuối cùng đối với virus VNNB vì virus trong máu người tồn
tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người
này sang người khác qua muỗi đốt.
5. Đặc điểm của bệnh VNNB
a. Phân bố theo mùa
Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa cũng có ảnh hưởng đến
tình hình bệnh. Vào mùa mưa, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho
muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp với thời điểm
bệnh xảy ra nhiều.
Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 27
0
C – 30
0
C, virus thường
phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 20

0
C thì sự phát triển của virus
dừng lại. Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa hai miền
Nam, Bắc Việt Nam. Tại Miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh,
tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5 - 6 - 7. Tại miền Nam, thời
tiết nóng bệnh rải rác quanh năm (BS. Võ Công Khanh, 2007).
b. Phân bố theo tuổi và giới tính
Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những
vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh
nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 10 tuổi, phần đông ở thể không
triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên
tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Người nước ngoài không phân
biệt tuổi tác nếu chưa có miễn dịch đặc biệu đều có thể mắc bệnh khi đến
vùng có VNNB lưu hành. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong
thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ.
Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên không thay
đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như
thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội
được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối
cùng là thuốc chủng ngừa VNNB đã được sử dụng (BS. Võ Công Khanh).
6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)
a. Khái niệm kỹ thuật LAMP
LAMP là kỹ thuật nhân bản acid nucleic đơn giản, nhanh, đặc hiệu và
cho hiệu quả cao. LAMP được phát triển bởi công ty hóa chất Eiken, Nhật
Bản. nó sử dụng bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng
trình tự trên acid nucleic đích và quá trình phản ứng thực hiện ở nhiệt độ
không đổi từ 60
0
C – 65
0

C (thường 63
0
C), với thời gian phản ứng từ 30-60
phút nhanh hơn rất nhiều so với phản ứng PCR. thành phần phản ứng gồm:
mẫu, 4 đoạn primer, DNA polymerase, dung dịch đệm, dNTP, tất cả các
thành phần phản ứng cho vào một test tube và thực hiện phản ứng trong tủ
ổn nhiệt. trong kỹ thuật này cả hai quá trình nhân bản và kiểm tra kết quả
phản ứng chỉ trong một bước (Eikenchemical.com).
Đặc điểm của kỹ thuật LAMP (Eikenchemical.com):
• Không cần bước biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn.
• Phản ứng khuếch đại thực hiện dưới một nhiệt độ không đổi.
• Hiệu quả khuếch đại cực kỳ cao.
• Sử dụng bốn đoạn mồi để nhận diện sáu vùng trình tự trên trình
tự đích.
• Giảm giá thành do không yêu cầu hóa chất đắt tiền và thiết tinh
vi.
• Trong sản phẩm khuếch đại có các vòng.
• Có thể khuếch đại trình tự đích là RNA giống như DNA nhờ
enzyme reverse transcriptase.
b. Thiết kế mồi cho LAMP
sở dĩ kỹ thuật LAMP có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật PCR là do các
mồi dùng trong kỹ thuật LAMP được thiết kế đặc biệt giúp cho sự biến tính,
bắt cặp và nhân đôi DNA nhanh chóng.
LAMP được thực hiện với bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để
nhận ra sáu vùng trình tự khác nhau trên DNA đích bao gồm: Vùng F3c,
F2c, F1c ở đầu 3’ và B1, B2, B3 ở đầu 5’.
Hình 5: các mồi và vị trí gắn trên DNA đích
Mồi được thiết kế tốt sẽ quyết định kết quả của phản ứng khuếch đại.
Mồi được sử dụng trong LAMP đều được thiết kế và kiểm tra bằng phần
mềm PrimerExplore là phần mềm đặc biệt được viết dành riêng để thiết kế

mồi cho LAMP (Eikenchemical.com).
c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP
sau khi DNA mẫu và các chất phản ứng được cho vào trong test tube
sẽ được đưa vào trong tủ ổn nhiệt và giữ nhiệt độ không đổi từ 60
0
C - 65
0
C.
Quá trình phản ứng bắt đầu qua các bước sau:
bước 1: DNA sợi đôi bị mất trạng thái cân bằng khi nhiệt độ đột ngột
lên 65
0
C nên sẽ bị tách ra thành hai sợi đơn DNA, một mồi gắn vào trình tự
bổ sung trên DNA đích bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung nhờ enzyme DNA
polymerase. Đối với kỹ thuật LAMP không cần bước biến tính DNA bằng
nhiệt như PCR mà dựa vào việc tạo sợi đơn dựa vào mồi (hình 6).
Hình 6: Bước 1 của kỹ thuật LAMP
Bước 2: DNA polymerase thực hiện phản ứng tổng hợp sợi DNA bổ
sung với sợi DNA đích, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP (hình 7).
Hình 7: Bước 2 của kỹ thuật LAMP
Bước 3: Primer F3 gắn vào vùng F3c và tổng hợp sợi bổ sung thay thế
vị trí và giải phóng sợi bổ sung chứa FIP (hình 8).
Hình 8: Bước 3 của kỹ thuật LAMP
Bước 4: Một sợi đôi DNA được tổng hợp từ primer F3 và sợi DNA
mẫu (hình 9).
Hình 9: Bước 4 của kỹ thuật LAMP
Bước 5: Sợi bổ sung gắn với primer FIP được giải phóng trở thành sợi
đơn nhờ phản ứng thế chỗ của primer F3 khi tổng hợp sợi bổ sung. Khi ở
dạng sợi đơn thì sợi này sẽ tạo thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ do sự bổ sung
của vùng F1 và F1c (hình 10).

Hình 10: Bước 5 của kỹ thuật LAMP
Bước 6: DNA sợi đơn ở bước 5 sẽ là sợi khuôn để cho primer BIP
tổng hợp sợi bổ sung và sau đó primer B3 sẽ tổng hợp sợi bổ sung khác thế
chỗ cho sợi có chứa primer BIP. Primer BIP gắn với đầu 3’ và khi tổng hợp
sẽ làm cho cấu trúc vòng chuyển thành cấu trúc thẳng. Primer B3 cũng bắt
đầu từ đầu 3’ nhưng gắn ở phía ngoài của primer BIP, DNA tổng hợp từ B3
sẽ thế chỗ và giải phóng sợi đơn có chứa primer BIP (hình 11).
Hình 11: Bước 6 của kỹ thuật LAMP
Bước 7: DNA sợi đôi được tạo ra từ bước 6 nhờ primer B3 (hình 12).
Hình 12: Bước 7 của kỹ thuật LAMP
Bước 8: DNA sợi đơn ở bước 6 sẽ tạo thành cấu trúc dạng vòng ở hai
đầu nhờ trình tự bổ sung của vùng F1 với F1c của primer FIP và vùng B1c
với B1 của primer BIP. Đây là cấu trúc khởi đầu cho chu trình khuếch đại
DNA đích của kỹ thuật LAMP (hình 13).
Hình 13: Bước 8 của kỹ thuật LAMP
Bước 9-11: Cấu trúc DNA ở bước 8 sẽ nhanh chóng bị thay đổi do
hoạt động tổng hợp của các mồi và DNA polymerase. Primer FIP sẽ gắn vào
một vòng của DNA đích và tổng hợp sợi bổ sung và tạo sợi đơn DNA có
chứa một vòng do sự bổ sung của vùng B1 và B1c (bước 9). DNA sợi đơn
được giải phóng nhanh chóng tạo câu trúc như bước 8, cấu trúc này tiếp tục
tham gia làm khuôn để tiếp tục tổng hợp DNA (bước 11).
Hình 14: bước 9-11 của kỹ thuật LAMP
d. RT-LAMP (reverse transcriptase LAMP)
Kỹ thuật RT-LAMP cần phải tổng hợp c.DNA từ khuôn RNA và sử
dụng kỹ thuật LAMP để khuếch đại và kiểm tra kết quả. Với khuôn là RNA
nên thành phần các chất phản ứng ngoài các thành phần phản ứng của kỹ
thuật LAMP (primer, DNA polymerase, dNTP, dung dịch đệm) còn có thêm
enzyme reverse transcriptase trong thành phần phản ứng. Sau đó thành phần
phản ứng được hòa trộn và đưa vào tủ ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ từ 60-65
0-

C.
Các bước của kỹ thuật RT-LAMP tương tự như kỹ thuật LAMP cho
DNA, nhưng có thêm bước tạo cDNA từ RNA như hình 15.
Hình 15: Tổng hợp cDNA từ RNA
e. LAMP phát hiện SNP (single nucleotide polymorphis)
vì kỹ thuật LAMP có độ đặc hiệu cao nên chỉ có những trình tự DNA
đích có độ tương đồng ở mức từng nucleotide mới được khuếch đại khi sử
dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện các dạng SNP. Hơn nưa đặc điểm của
phản ứng khuếch đại của LAMP có thể sự khác nhau một nucleotide trong
chu trình khuếch đại cho cả sợi sene và anti-sene, và các dạng SNP có thể
được phát hiện dễ dang, nhanh chóng bằng sự khuếch đại DNA có chứa SNP
chỉ trong một phản ứng duy nhất. Phản ứng cho kết quả nhanh chỉ trong
khoảng 30 phút.
Đặc điểm của LAMP cho SNP:
 Sử dụng 4 primer được thiết kế để xác đinh 6 vùng trình tự trên
khuôn, chỉ có DNA đích bổ sung hoàn toàn mới được khuếch đại .
 Phản ứng đặc hiệu có thể phân biệt sự khác nhau một nucleotide.
⇒ Các SNP có thể được phát hiện chỉ trong một bước nhờ sự hiện diện
của sản phẩm khuếch đại.
Nguyên lý của LAMP cho SNP: Như hình 16, nguyên lý cơ bản khi
sử dụng primer cho dạng hoang dại (WT primer). Primer FIP và BIP được
thiết kế chứa một nucleotide SNP (trường hợp này là allen cho kiểu hoang
dại) ở đầu 5’. Sử dụng WT primer, khi mà DNA đích có allen WT, DNA
được tổng hợp nhờ sự tạo thành cấu trúc vòng đôi ở hai đầu. Nếu như DNA
đích có sự đột biến allen WT (MUT) thì sẽ không tạo ra DNA có cấu trúc
vòng kép ở hai đầu nên sự khuếch đại không xảy ra.
Hình 16: nguyên lý của LAMP cho SNP
f. Đọc kết quả
Kết quả sau khi khuếch đại bằng kỹ thuật LAMP có thể dùng để định
tính hoặc định lượng. Nếu chỉ cần định thì kết quả có thể đọc bằng mắt

thường dựa vào màu của test tube sau khuếch đại, hoặc đọc dưới tia UV để
hiện màu của chất phát huỳnh quang như SYBR green, hoặc cũng có thể đọc
trên bảng gel điện di với nồng độ agarose 2% - 3%. Khi cần định lượng thì
cần xây dựng đường chuẩn với các với độ cản quang ( chỉ số OD), sau đó
dựa vào đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính nồng độ DNA có tròn mẫu.
Hình 17: Đọc kết quả nhờ UV (a) và bằng mắt thường (b)
Hình 18: Đọc kết quả trên bảng gel điện di
Hình 19: Đường chuẩn dùng định lượng
III. Vật liệu và phương pháp
1. Định tính virus VNNB
Bởi vì virus VNNB có bộ máy di truyền là RNA nên sử dụng kỹ thuật
RT-LAMP cho việc định tính virus.
a. Vật liệu
Thiết kế mồi đặc trưng cho virus VNNB: Bốn đoạn mồi cho RT-
LAMP được thiết kế từ gene E của virus VNNB. Trình tự của gene E được
lấy từ GeneBank. Bốn đoạn mồi này có khả năng xác khuếch đại trình tự
đích khoảng 235bp tương ứng với vị trí từ 992 đến 1225. Tất cả các đoạn
mồi được thiết kế và kiểm tra trên phần mềm PrimerExplore (M. M. Parida
và ctv, 2006). Trình tự bốn đoạn mồi dùng cho phản ứng RT-LAMP chẩn
đoán virus VNNB như sau:
• Outer primer (19 base):
− Forward outer primer F3: GGAATGGGCAATCGTGACT
− Backward outer primer B3: CGTTGTGAGCTTCTCCAGT
• Inner primer:
− forward inner primer FIP (F1c+TTTT+F2) gồm 22bp:
GCGGACGTCCAATGTTGGTTTG
− Backward inner primer BIP (B1+TTTT+B2c) gồm 18bp:
GCCACTTGGGTGGACTTG
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được lấy từ bệnh nhân VNNB khi bệnh nhân có các
biểu hiện triệu chứng bệnh từ ngày thứ một đến ngày thứ bảy. Mẫu sau đó sẽ

được trữ lạnh ở -80
0
C nếu chưa tiến hành tách RNA ngay. Ngoài mẫu bệnh
phẩm thì còn cần phải chuẩn bị đối chứng âm, mẫu đối chứng âm này phải
được kiểm tra kỹ để loại bỏ sự xâm nhiễm virus VNNB hoặc các loài thân
thuộc từ bên ngoài. Đối chứng dương là virus được nuôi trên tế bào C6/36
(dòng tế bào của ấu trùng muỗi Aedes albopictus).
Các thành phần khác cho kỹ thuật RT-LAMP: Bst DNA polymerase
and AMV reverse transcriptase, dNTP, Tris-HCl (ph 8.8), KCl, MgSO
4
,
(NH
4
)
2
SO
4
, Tween 20, betaine.
b. phương pháp
Tách RNA: RNA của virus được tách từ 140µl dịch nổi của bình nuôi
virus VNNB (đối chứng dương), 140µl đối chứng âm và 140µl mẫu máu của
bệnh nhân sử dụng QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức) với quy
trình theo bộ kit. RNA được tách ra khỏi cột QIAspin có thể tích cuối cùng
100µl bao gồm cả dung dịch rửa và được trữ ở -70
0
C cho đến khi sử dụng.
Thực hiện phản ứng RT-LAMP: Tất cả thành phần phản ứng của RT-
LAMP có tổng thể tích phản ứng 25µl sử dụng Loopamp RNA amplification
kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Nhật Bản) với thành phần phản ứng
bao gồm:

− 50 pmol mỗi loại inner primer (FIP và BIP)
− 5 pmol mỗi loại outer primer (F3 và B3)
− 1.4 mM dNTP
− 0.8 M betaine
− 0.1% Tween 20
− 10 mM (NH
4
)
2
SO
4
− 8 mM MgSO4
− 10 mM KCl
− 20 mM Tris-HCl (pH 8.8)
− 8 UI enzyme DNA polymerase (New England Biolabs)
− 0.625 UI enzyme avian myelablastosis virus reverse transcriptase
(Invitrogen, USA)
− 2 µl RNA mẫu
Tất cả hỗn hợp phản ứng được cho vào một test tube đưa vào bể ổn
nhiệt giữ ở 63
0
C trong 60 phút và tiếp theo là ở 80
0
C trong 2 phút để kết thúc
phản ứng do làm bất hoạt các enzyme.
Mẫu, đối chứng dương, đối
chứng âm
Ly trích RNA bằng bộ kit QIAamp
viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức)
Sử dụng ngay hay trữ ở

-80
0
C nếu chưa dùng
Sử dụng ngay hay trữ ở
-70
0
C cho đến khi sử dụng
Sử dụng bộ kit Loopamp RNA amplification kit
(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Nhật Bản) để
thực hiện phản ứng khuếch đại ở 63
0
C trong 60
phút
Hình 20: Sơ đồ thực hiện của kỹ thuật RT-LAMP để chẩn đoán
VNNB
c. Đọc kết quả
Đọc kết quả trên bản điện di, kết quả là dương tính nếu trên bản điện
di có sự tạo thành vệt dài khi nhuộm với ethidium bromide, nếu không có sự
xuất hiện của sản phẩm khuếch đại là kết quả âm tính.
Hình 21: kết quả điện di trên gel Agarose 3% (mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6
dương tính; mẫu 7 âm tính với virus VNNB)
Đọc kết quả bằng mắt thường nhờ vào màu của test tube sau phản ứng
so với mẫu đối chứng âm (mẫu dương tính màu của SYBR Green chuyển
sang màu vàng, trong khi mẫu đối chứng âm vẫn giữ màu da cam). Hoặc có
thể đọc kết quả khuếch đại nhờ vào sự phát huỳnh quang của SYBR Green
dưới đèn UV (dương tính cho màu xanh).
Hình 22: đọc kết quả khuếch đại gene E của virus VNNB bằng mắt
thường và dưới tia UV
2. Định lượng virus VNNB
Nâng nhiệt độ lên 80

0
C trong 2 phút
để kết thúc phản ứng
a. Vật liệu
Vật liệu cho phản ứng RT-LAMP định lượng (Real Time RT-LAMP)
cho virus VNNB tương tự như RT-LAMP định tính. Điểm khác biệt ở đây là
cần chuẩn bị chuẩn với các nồng độ khác nhau của virus VNNB để xây dựng
đường chuẩn. Để định lượng virus cần sử dụng máy đo độ đục Loopamp
Real Time turbidimeter (LA-200; Teramecs, Nhật Bản).
b. Phương pháp và tính toán
Các bước từ chuẩn bị mẫu, các mẫu chuẩn với nồng độ khác nhau,
tách RNA và nồng độ các thành phần phản ứng như ở phần sử dụng RT-
LAMP để định tính. Bước tiếp theo tiến hành xây dựng đường chuẩn nhờ
thiết bị Loopamp Real Time turbidimeter. Thiết bị này sẽ đo chỉ số OD của
mỗi mỗi nồng độ chuẩn theo thời gian đồng thời xác định thời gian mà
chuẩnbắt đầu cho kết cho tín hiệu dương tính (hình 23).
Hình 23: giá trị OD theo thời gian của các nồng độ chuẩn
Dựa vào nồng độ virus trong các mẫu chuẩn và thời gian bắt đầu cho
phản ứng dương tính để xây dựng đường chuẩn với trục X là nồng độ virus
và trục Y là thời gian bắt đầu cho phản ứng dương tính ( Tp: Time of
positivity) như hình 24.
Hình 24: Đường chuẩn để định lượng virus VNNB
Tiến hành thực hiện phản ứng khuếch đại mẫu trong Loopamp Real
Time turbidimeter để kiểm tra thời gian bắt đầu cho phản ứng dương tính.
Để tính lượng virus trong mẫu ta thay giá trị Tp của mẫu vào phương trình
đường chuẩn.
Chuẩn bị mẫu và các mẫu chuẩn đã biết
lượng virus VNNB
Sử dụng ngay hay trữ ở
-80

0
C
Ly trích RNA bằng bộ kit QIAamp viral
RNA mini kit (QIAGEN, Đức)
RNA được sử dụng ngay hoặc trữ
ở -70
0
C cho đến khi sử dụng
Thực hiện phản ứng khuếch đại các mẫu chuẩn
trong Loopamp Real Time turbidimeter để xác
định giá trị Tp
Xây dựng đường chuẩn dựa trên Tp và lượng
virus trong mẫu chuẩn
Hình 25: Các bước thực hiện của kỹ thuật Real Time RT-LAMP
IV. Kết luận
Như đã trình bày ở trên, kỹ thuật RT-LAMP nói riêng và kỹ thuật
LAMP nói chung là kỹ thuật hứa hẹn sẽ được phát triển rộng rãi cho việc
khuếch đại acid nucleic, cũng như chẩn đoán bệnh trực tiếp chỉ trong một
bước phản ứng. Đây có thể chính là kỹ thuật sẽ thay thế kỹ thuật PCR do
những ưu điểm của nó so với phản ứng PCR như: Nhanh (chỉ mất từ 30-60
phút), đặc hiệu, đơn giản, không cần máy móc đắt tiền…
RT-LAMP định tính và định lượng là kỹ thuật hiệu quả cho việc chẩn
đoán virus VNNB. Cần nghiên cứu sâu hơn để xây dựng một quy trình
chuẩn cho việc chẩn đoán virus VNNB.
V. Tài liệu tham khảo
- M. M. Parida, S. R. Santhosh, P. K. Dash, N. K. Tripathi, P. Saxena1,
Ambuj, A. K. Sahni1, P. V. Lakshmana Rao and Kouichi Morita, 2006;
development and evaluation of reverse transcription Loop mediated
isothermal amplification assay for rapid and Real-time detection of
japanese encephalitis virus.

- Xue-en FANG, Jian LI and Qin CHEN, 2008; One New Method of
Nucleic Acid Amplification-Loop-mediated Isothermal Amplification of
DNA.
- Motoki Goto, Eiichi Honda, Atsuo Ogura, Akio Nomoto, and Ken-Ichi
Hanaki, 2009; Colorimetric detection of loopmediated isothermal
amplification reaction by using hydroxy naphthol blue.
- Hiroko Toriniwa, and Tomoyoshy Komiya, 2006; Rapid detetion and
quantification of Japanese encephalitis virus by Real-Time reverse
transcriptase loop-mediated isothermal amplification.
- Narong Nitatpattana, Audrey Dubot-Pérès, Meriadeg Ar Gouilh, Marc
Souris, Philippe Barbazan, Sutee Yoksan, Xavier de Lamballerie, and
Khuếch đại mẫu trong Loopamp Real Time
turbidimeter để xác định giá trị Tp
Thay giá trị Tp vào phương trình đường
chuẩn để tính lượng virus VNNB trong
mẫu
Jean-Paul Gonzalez, 2005; Change in Japanese Encephalitis Virus
Distribution, Thailand.
- Boonyos Raengsakulrach, Ananda Nisalak, Montip Gettayacamin, Vipa
Thirawuth, G. David Young, Khin Saw Aye Myint, Laura M. Ferguson,
Charles H. Hoke Jr., Bruce L. Innis, And David W. Vaughn, 1999; an
intranasal challenge model for testing japanese encephalitis Vaccines in
rhesus monkeys.
- Noboru Inoue, Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA
(LAMP) General Introduction.
- Norihiro Tomita, Yasuyoshi Mori, Hidetoshi Kanda & Tsugunori
Notomi, 2008; Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene
sequences and simple visual detection of products.
- BS. Võ Công Khanh, 2007; Bệnh viêm não Nhật Bản.
- Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện và cs, 2004; Một số bệnh mới do virus ở

gia súc và gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị.
- Viện kí sinh trùng sốt rét Quy Nhơn; Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét
bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Wikipedia .com.vn
- Eikenchemical.com