KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM, GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHI
Ê
N
NGUYỄN THỊ THÚY
HẰNG
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA
MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM,
GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES
VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS
LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG
TẾ BÀO UNG TH
Ư
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌ
C
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG
LỜI CẢM
ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương. Cô
đã
hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Và
tôi
cũng rất biết ơn Trung tâm Sâm và Dược liệu T.P.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện
cho
tôi được thực hiện đề tài tại Trung
tâm.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy

D
ươ
ng
đã tạo cho tôi cơ hội được thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm SHPT
của
trường và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học
t
ậ
p.
Tôi cũng trân trọng cảm ơn GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng cùng các Thầy
Cô,
các anh chị em trong khoa Hóa đã cho tôi rất nhiều tình thương cũng như nhiệt
tình
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn
này.
Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Thái Hoàng Tâm và em
Lê
Minh Triết đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều về mặt chuyên
môn.
Tôi chân thành biết ơn cha mẹ và những người bạn thân đã động viên và
giúp
đỡ tôi hoàn thành xong luận văn
này.
Nguyễn Thị Thúy
H
ằ
ng
MỤC
LỤC
Trang

Trang phụ
bìa
Lời cảm
ơ
n
Mục
lục
Danh mục chữ viết
t
ắ
t
Danh mục các
b
ả
ng
Danh mục các
hình
LỜI MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung
thư

3
1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư
3
1.1.2. Đặc tính của tế bào ung thư
4
1.2. Apoptosis và ung thư
4

1.2.1. Phân biệt apoptosis với necrosis
5
1.2.2. Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis
7
1.2.3. Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình apoptosis
11
1.2.4. Apoptosis - mục tiêu trị liệu ung thư
17
1.3. Tóm tắt những nghiên cứu về nấm dược liệu
19
1.3.1. Khái quát chung về nấm dược
li
ệ
u

19
1.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
24
1.3.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý
27
1.3.4. Nghiên cứu và ứng dụng nấm dược liệu theo hướng điều trị ung thư
31
1.4. NCI và việc sàng lọc dược liệu kháng ung
thư

32
i
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
34

2.1.1. Ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú
MCF-7
và ung thư phổi NCI-H460 sử dụng trong đề tài
34
2.1.2. Thuốc đối chiếu
Camptothecin 35
2.1.3. Nấm dược liệu
35
2.1.4. Hóa
ch
ấ
t

37
2.1.5. Thiết
bị 40
2.2. Phương pháp
40
2.2.1. Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu
40
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật
43
2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Tryphan blue
44
2.2.4. Thử nghiệm SRB
46
2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang
v
ớ
i

thuốc nhuộm kép AO/EB
50
2.2.6. Phương pháp tách chiết và điện di
DNA
phân tử lượng nhỏ (phương pháp DNA phân mảnh)
51
2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính caspase-3
53
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết
thô
(cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các mẫu
nấm
Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung
thư
HeLa, NCI-H460 và MCF-7
57
3.1.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết
cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa
57
3.1.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết
cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7
61
i
3.1.3. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết
cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460
63

3.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết từ
nấm
Linh chi vàng trên ba dòng tế bào HeLa, NCI-H460 và MCF-7
66
3.2.1. Tế bào HeLa
67
3.2.2. Tế bào ung thư vú MCF-7
69
3.2.3. Tế bào ung thư phổi
NCI-H460 70
3.2.4. Kết quả xác định cao chiết tiềm năng
72
3.3. Xác định giá trị IC
50
của cao chiết cồn nấm Linh chi
vàng
(Ganoderma colossum) trên dòng tế bào HeLa
73
3.4. Kết quả xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết
cồn
nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế
bào
ung thư
HeLa 75
3.4.1. Kết quả nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB
75

3.4.2. Kết quả phân tích DNA phân mảnh
78
3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính caspase-3
80
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Kết
luận
84
TÀI LIỆU THAM KHẢO
85
PHỤ LỤC
i
DANH MỤC CÁC
BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis
5
Bảng 1.2. Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế bào
8
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum
24
Bảng 2.1. Các loại nấm dược liệu sử dụng trong đề tài
35
Bảng 2.2. Độ ẩm của nguyên liệu và cao
chiết 36
Bảng 3.1. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao
chi
ế
t
nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng

58
Bảng 3.2. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao
chi
ế
t
nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
61
Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
n
ướ
c
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
63
Bảng 3.4. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm
Linh
chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm
ứ
ng

68
v
Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharid thô chiết xuất từ nấm Linh

chi
vàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm
ứ
ng

69
Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết
phân
đoạn có chứa triterpen và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi
vàng
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
71
Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn nấm Linh chi
vàng
trên dòng tế bào HeLa ở các nồng độ thử nghiệm sau 48 giờ cảm ứng
74
Bảng 3.8. Kết quả hoạt tính caspase-3 của quần thể tế bào Hela ở
nh
ữ
ng
thời điểm khác nhau
82
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT
TẮT
AIF : apoptosis inducing
factor
Apaf-1 : protease-activating factor
1
AO/ EB : acridine orange/ ethidium

bromide
BuOH :
buthanol
CAD : caspase activated
DNase
CARD : caspase recruitment
domain
CPT :
camptothecin
DD : death domain DEVD
:
Asp-Glu-Val-Asp
DED :
death
effector
domain
DISC : death inducing signalling
complex
DNA : deoxyribose nucleic
acid
DMSO : dimethyl
sulphoxide
E’MEM : eagle minimal essential
medium
EDTA : ethylenediaminetera-acetic
acid
FasL :
Fas-ligand
FasR : Fas-
receptor

FADD : Fas-associated death
domain
FBS : fetal bovine
serum
HEPES :
n-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane
sulfonic
acid
IC
50
: inhibitor concentration of
50%
ICAD
: inhibitor of caspase activated
DNase
MeOH
:methanol
MTT : 3-(4,5
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide
NCI : national cancer
institute
NST : nhiễm sắc
th
ể
8
PARP : enzyme nuclear polymerase
PARP
PSK : polysaccharopeptide
Krestin
PSP :

polysaccharopeptide
PBS : phosphate buffer
saline
RAIDD : RIP associated Ich-1/CED3 homologous protein with death
domain
R110 : rhodamine
110
SRB : sulforhodamine
B
STD : standard
deviation
TCA : trichloroacetic
acid
TNF : tumor necrosis
factor
TRAIL : TNF- related apoptosis induced-
ligand
TRADD : TNF receptor – associated death
domain
WHO : world health
organization
XTT : sodium
3,3,-[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium-bis(4-
methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid
hydrate
DANH MỤC CÁC
HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư
4

Hình 1.2. Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis
7
Hình 1.3. Cơ chế tự hoạt hóa của caspase
9
Hình 1.4. “Thác” caspase
10
Hình 1.5. Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis
11
Hình 1.6. Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF
13
Hình 1.7. Sự truyền tín hiệu apoptosis thông qua ty thể
15
Hình 1.8. Con đường khởi phát apoptosis thông qua granzyme A, B
17
Hình 1.9. Hình thái quả thể nấm Linh chi
20
Hình 1.10. Hình thái quả thể nấm Vân
chi

21
Hình 1.11. Hình thái quả thể nấm Thượng hoàng mọc trên mạt cưa
23
Hình 2.1. Ba dòng tế bào ung thư sử dụng trong đề tài
34
Hình 2.2. Quy trình thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpen
42
Hình 2.3. Tế bào nhuộm với Tryphan blue quan sát
trong
buồng đếm hồng cầu
44

1
Hình 2.4. Buồng đếm hồng
c
ầ
u

45
Hình 2.5. Sự phân cắt DNA trong apoptosis
51
Hình 2.6. Sự điện di DNA bị phân cắt trong quá trình
apoptosis
và necrosis trên gel
agarose 52
Hình 3.1. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao
chi
ế
t
cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng.
59
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao
chi
ế
t
cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng.
62
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết

cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng.
64
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao cồn
trên
3 dòng tế bào Hela, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng
65
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết
cồn,
các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi
vàng
trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
68
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết
cồn,
các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi
vàng
trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
70
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết
cồn,
các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi
vàng
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
71
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết

cồn,
các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi
vàng
trên 3 dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng
.72
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của
cao
chiết cồn nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa sau 48 giờ cảm ứng
74
Hình 3.10. Hình thái tế bào HeLa quan sát dưới kính hiển vi huỳnh
quang

77
Hình 3.11. Kết quả điện di DNA bộ gen của quần thể tế bào HeLa sau khi
đượ
c
cảm ứng với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml.
79
LỜI MỞ ĐẦU
Theo thống kê gần đây nhất của WHO (World Health Organization), ung
th
ư
gây ra khoảng 7,9 triệu ca tử vong mỗi năm trên thế giới, trong số đó khoảng
70%
(5,5 triệu người) là ở những nước đang phát triển. Ở Việt Nam, số người mắc
b
ệ
nh

ung thư đang có xu hướng ngày một gia tăng, ước tính mỗi năm có 75.000
ng
ườ
i
chết vì ung thư. Trong năm 2010, tại Bệnh viện Ung Bướu, phát hiện hơn
14.000
trường hợp mắc ung thư
m
ớ
i.
So với các loại ung thư khác, ung thư phổi chiếm tỷ lệ và gây tử vong cao
nh
ấ
t
ở nam giới, kể cả ở các nước phát triển và đang phát triển. Theo thống kê của
Tổ
chức Y tế Thế giới, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường
g
ặ
p
và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các loại ung thư phụ khoa ở nữ giới, đặc biệt
là
phụ nữ ở các nước đang phát triển. Tại Việt Nam, hai loại ung thư này đứng
đầ
u
trong các loại ung thư thường gặp ở nữ
gi
ớ
i.
Cho đến nay, việc điều trị ung thư vẫn đang là một thách thức rất lớn đối

v
ớ
i
các nhà khoa học. Hiện nay để điều trị ung thư, người ta vẫn dùng ba liệu pháp
phổ
biến nhất là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Tuy nhiên, các liệu pháp này ít nhiều
cũng
gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người do các tác dụng phụ. Chẳng hạn
ph
ươ
ng
pháp hóa trị liệu vẫn còn bị hạn chế bởi việc liều cao của thuốc chữa ung thư có
th
ể
gây độc, làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân
[68].
Con người từ xa xưa đã biết sử dụng nhiều loại dược liệu quý trong tự
nhiên
để chữa bệnh. Chính vì thế, việc tìm kiếm và sàng lọc các hợp chất tự nhiên có
ho
ạ
t
tính kháng ung thư hiện nay đang là đề tài thu hút sự quan tâm của các nhà
khoa
học trên thế giới. Các tổ chức y tế lớn trên thế giới như WHO và NCI
(National
Cancer Institute) đang có những dự án nghiên cứu mở rộng ra khắp các châu
lục
trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới có tiềm năng điều trị được ung thư.
Một

trong những mục tiêu của việc tìm các hợp chất tự nhiên dùng trong điều trị ung
th
ư
hiện nay là tìm kiếm các hợp chất có khả năng cảm ứng tế bào ung thư chết
theo
chương trình
(apoptosis).
Lời mở
1
Qua các nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng ở người cho
th
ấ
y,
các nấm dược liệu như nấm Linh chi, Vân chi và Thượng hoàng có tác dụng
kích
thích chức năng của hệ miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u bằng cách
làm
ngừng chu trình phân bào và cảm ứng quá trình
apoptosis
[33],[36],[39],[44],[51],
[71]; đồng thời ngăn ngừa sự di căn của các tế bào ung
th
ư
[31],[61],[63].
Ở Việt Nam, gần đây việc nuôi trồng thành công nhiều loại nấm dược liệu
quý
đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học trong nước dần dần quan tâm hơn về
vi
ệ
c

nghiên cứu các loại nấm này [1],[4]. Tuy nhiên ở nước ta, việc tiếp cận theo
h
ướ
ng
nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc in vitro các hợp chất tự nhiên có hoạt tính
kháng
ung thư từ các loại nấm này vẫn còn là bước đầu và chỉ mới có một vài nghiên
c
ứ
u
được công bố [3],[6]. Nhằm làm rõ hơn về tác dụng kháng ung thư của các loại
n
ấ
m
Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng nuôi trồng tại Việt Nam trên ba loại ung
th
ư
được xem là phổ biến nhất hiện nay ở nước ta, trong khuôn khổ luận văn, chúng
tôi
tiến hành thực
hi
ệ
n:
Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
n
ướ
c
của 7 mẫu nấm (Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng) trên ba dòng tế bào là
ung
thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư phổi NCI-H460 bằng

th
ử
nghiệm Sulforhodamine B (SRB). Từ đó, chọn ra một loại nấm có tiềm năng
nh
ấ
t.
Bước đầu khảo sát khả năng gây độc trên ba dòng tế bào Hela,
NCI-H460
và MCF-7 của các dịch chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharid
thô
trong loại nấm dược liệu tiềm năng đã được xác định ở trên bằng thử
nghi
ệ
m
Sulforhodamine B
(SRB).
Chọn ra một cao chiết tiềm năng có khả năng gây độc tế bào cao
nh
ấ
t.
Xác định khả năng cảm ứng apoptosis của cao chiết tiềm năng bằng
ba
phương pháp
sau:
Phương pháp kính hiển vi huỳnh
quang
Thử nghiệm DNA phân
m
ả
nh

Thử nghiệm
caspase
1.1. Khái quát về ung
thư
Ung thư là thuật ngữ dùng để chỉ bệnh liên quan đến những tế bào bất
th
ườ
ng
phân chia vô hạn (tăng trưởng không kiểm soát). Các tế bào ung thư có thể xâm
l
ấ
n
sang những mô lân cận và chúng có thể di căn sang những cơ quan khác trong
c
ơ
thể bằng cách di chuyển theo các mạch máu và hệ thống bạch huyết. Hầu hết
ung
thư tạo thành khối u, ngoại trừ một vài dạng, như ung thư bạch
c
ầ
u.
1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung
thư
Trong cơ thể, các tế bào tăng sinh một cách có kiểm soát tạo ra các tế bào
m
ớ
i
thay thế cho những tế bào chết đi. Sự cân bằng giữa quá trình tăng sinh và chết
của
tế bào được điều hòa chặt

ch
ẽ
.
Trong quá trình nguyên phân, tế bào có thể xảy ra những sai hỏng trong
DNA.
Những sai hỏng đó nếu thoát được cơ chế sửa sai của tế bào sẽ dẫn đến sự
hình
thành một số đột biến. Những đột biến này có thể liên quan đến sự tăng sinh,
kh
ả
năng đi vào mạch máu và khả năng di chuyển của tế
bào.
Thông thường, những tế bào mang những sai hỏng trong DNA như thế sẽ
tr
ả
i
qua apoptosis để “tự sát”. Nhưng trong trường hợp tế bào ung thư, những đột
bi
ế
n
sẽ ngăn cản không cho tế bào đi vào quá trình apoptosis. Những đột biến của tế
bào
ung thư làm cho tế bào không nhận diện được những tín hiệu điều hòa tăng
tr
ưở
ng
và chúng trở nên tăng sinh nhanh hơn tế bào bình thường. Vì không thể kiểm
soát
được sự tăng sinh của tế bào ung thư, nên thường sẽ dẫn đến sự hình thành khối
u.

Nói chung, nguồn gốc căn bản của ung thư là do sự tích lũy nhiều đột biến trong
các
gen dẫn đến sự hoạt động bất thường của tế bào (xem hình 1.1), làm cho các tế
bào
vượt khỏi chu trình kiểm soát thông thường cũng như có khả năng xâm lấn và
di
c
ă
n.
Chương 1. Tổng quan tài
Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư
[73].
1.1.2. Đặc tính của tế bào ung
thư
Nhìn chung, các tế bào ung thư bao gồm các đặc điểm sau:
[29]
¾ Không bị kiểm soát bởi các tín hiệu ngoại bào hay nội bào của quá trình
đi
ề
u
hòa chu trình tế
bào.
¾ Không bị cảm ứng
apoptosis.
¾ Tăng sinh vô hạn và không có khả năng biệt
hóa.
¾ Có hoạt động bất thường của emzyme
telomerase
¾ Có khả năng di căn đến các vị trí khác trong cơ
th

ể
.
¾ Có khả năng tồn tại và tăng trưởng tại vị trí
m
ớ
i.
1.2. Apoptosis và ung
thư
Apoptosis được gọi là “sự chết của tế bào theo chương trình”.
Apoptosis
thường xảy ra trong suốt quá trình phát triển bình thường của sinh vật đa bào và
ti
ế
p
diễn trong suốt cả cuộc đời. Đồng thời, nó cũng là một cơ chế nội cân bằng
giúp
duy trì sự cân bằng của quần thể tế bào trong
mô.
Sự điều hòa quá trình apoptosis nếu xảy ra vấn đề sẽ dẫn đến một số căn
b
ệ
nh.
Ung thư là một căn bệnh mà đặc điểm là biểu hiện quá ít
apoptosis.
1.2.1. Phân biệt apoptosis với
necrosis
Tế bào có thể chết theo 2 cơ chế chính: apoptosis và necrosis (hoại tử).
S
ự
khác nhau giữa quá trình apoptosis và necrosis được trình bày trong bảng

1.1.
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis
[11],[17],[20],[67]
Apoptosis Necrosis
Tế bào chết theo “chương
trình”.
Tế bào chết “bất ngờ”
.
Là quá trình sinh lý, nhằm loại
bỏ
những tế bào hư hại hoặc không có
ích
trong cơ thể. Tế bào cũng có thể bị
c
ả
m
ứng apoptosis khi bị sự tác động
của
các tác nhân kích thích như các
h
ợ
p
chất gây độc tế bào, sự thiếu oxi
trong
mô, hoặc nhiễm
virút.
Là quá trình bệnh lý, xảy ra khi tế
bào
bị những tổn thương cơ học
nghiêm

trọng
.
Xảy ra sau vài giờ đến vài ngày bị
kích
thích, phụ thuộc vào chất cảm
ứ
ng.
Xảy ra chỉ sau vài giây hoặc vài phút
b
ị
kích
thích.
Tế bào co lại, các bào quan và tế
bào
chất bị nén chặt, ty thể không bị
thay
đổi hình
d
ạ
ng.
Các cơ quan nội bào và toàn bộ tế
bào,
đặc biệt là ty thể sẽ căng phồng
ra.
Tế bào apoptosis trải qua 3 giai
đo
ạ
n:
 Ở giai đoạn sớm: Chất
nhi

ễ
m
s
ắ
c
cô đặc lại, có hiện tượng tạo
bóng
màng (blebbing), DNA bị phân
c
ắ
t
thành
những phân mảnh có kích thước
50-
300kb.
 Ở giai đoạn giữa, DNA tiếp
tục
b
ị
phân cắt thành những phân
m
ả
nh
có kích thước là bội số của
180bp,
t
ạ
o
thành “thang DNA” khi xuất hiện
trên

gel
agarose.

Ở giai đoạn muộn, có
hi
ệ
n

t
ượ
ng
nẩy chồi. Các chồi tách ra hình
thành
thể apoptotic. Thể apoptotic với
màng
còn nguyên vẹn chứa tế bào chất,
các
bào quan còn toàn vẹn bị nén chặt,
có
hoặc không có mảnh vụn nhân.
Trong
in vivo, các thể apoptotic này sẽ bị
th
ự
c
bào nên không gây ra phản ứng
viêm.
Còn trong in vitro, các thể apoptotic
s
ẽ

phồng lên và cuối cùng là bị ly
gi
ả
i,
giai đoạn cuối cùng này của
apoptosis
được gọi là “secondary
necrosis”
(hình
1.2).
 Chất nhiễm sắc giữ
nguyên
hình
thái. Nhân không thay
đổi.
 Sự phân cắt DNA không
đặ
c
hi
ệ
u,
tạo ra một hỗn hợp phân
m
ả
nh
không đồng nhất, khi xuất
hi
ệ
n
trên

gel
agarose sẽ tạo thành vệt kéo dài
gọi
“smear”.
 Màng tế bào bị phá vỡ,
gi
ả
i
phóng
bào tương ra các mô xung
quanh,
gây ra phản ứng viêm (hình
1.2).
Hình 1.2. Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis
[11]
1.2.2. Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong
apoptosis
Sự “chết theo chương trình” là hiện tượng “tự tử” của tế bào, sự hoạt động
của
các tín hiệu phân tử bên trong bản thân tế bào sẽ dẫn đến cái chết của chính nó.
Quá
trình apoptosis được điều hòa chặt chẽ ở mức độ gen. Sự cảm ứng và biểu
hi
ệ
n
apoptosis đòi hỏi sự cộng tác giữa các phân tử tín hiệu, các thụ thể, các enzyme
và
các protein điều hòa. Trong đó, hệ thống tín hiệu các caspase đóng vai trò
quan

trọng trong việc biến đổi hình thái đặc trưng của
apoptosis.
Các enzyme này thuộc họ cysteine protease, phân cắt protein ở vị trí sau
gốc
aspartic acid, vì thế chúng được đặt tên là caspase. Trong tế bào, một chuỗi
các
caspase tương tác hoạt hóa dây chuyền tạo nên hiện tượng được gọi là
“thác
caspase” (caspase-cascade) (xem hình 1.4). Khi chưa được hoạt hóa, các
caspase
tồn tại ở dạng bất hoạt (procaspase). Dựa trên sự tương đồng trong trình tự
amino
acid, 14 caspase được chia làm 3 nhóm nhỏ: ( xem bảng
1.2)
Bảng 1.2. Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế
bào
Nhóm
Vai
trò
Tên
caspase
I
Khởi sự
apoptosis
(caspase khởi
s
ự
)
Caspase-2
Caspase-8

Caspase-9
Caspase-10
II
Tiến hành
apoptosis
(caspase hành
s
ự
)
Caspase-3
Caspase-6
Caspase-7
III
Nhân tố trung
gian
phản ứng
viêm
Caspase-1
Caspase-4
Caspase-5
Caspase-11
Caspase-12
Caspase-13
Caspase-14
Các procaspase khởi sự (procaspase-2, 8, 9 và 10) sẽ tự hoạt hóa hình
thành
các caspase khởi sự có hoạt tính. Sau đó, các caspase khởi sự sẽ phân cắt
các
procaspase hành sự (procaspase-3, 6 và 7) thành các caspase hành sự. Sự tự
ho

ạ
t
hóa của procaspase theo cơ chế: hai hoặc nhiều procaspase tập hợp lại gần nhau,
do
procaspase không hoàn toàn mất đi hoạt tính phân cắt protein nên khi chúng tập
h
ợ
p
lại gần nhau, phân tử procaspase sẽ bị cắt tại vị trí gốc aspartic acid tạo ra một
ti
ể
u
phần lớn (khoảng 20 kDa) và một tiểu phần nhỏ (khoảng 10 kDa) đồng thời
phóng
thích prodomain. Sau đó, xảy ra quá trình nhị trùng hợp (dimer hóa), hình thành
liên
kết ái lực giữa đầu C của tiểu phần lớn với đầu N của tiểu phần nhỏ trình hình
thành
cấu trúc tetramer α2β2 gồm 2 tiểu phần lớn và 2 tiểu phần nhỏ [10],[24] ( hình
1.3).
Hình 1.3. Cơ chế tự hoạt hóa của caspase. Phân tử procaspase gồm có 3
phần:
Pro (prodomain) - L (tiểu phần lớn) -S (tiểu phần nhỏ)
[10]

Các caspase khởi sự: gồm có caspase-2, 8, 9 và 10 (xem hình
1.4)
Caspase-8, 9 và 10: có nhiệm vụ hoạt hóa các procaspase hành sự 3, 6 và
7.
Caspase-8 còn có thêm một chức năng gián tiếp tham gia vào con đường hoạt

hóa
apoptosis thông qua ty thể, đó là phân cắt proapoptotic protein Bid dạng bất
ho
ạ
t
thành tBid có hoạt tính, kích thích sự giải phóng cytochrome
C.
Caspase-2: Hiện nay, người ta vẫn chưa biết rõ lắm về cơ chế hoạt động
của
caspase-2. Có nghiên cứu cho rằng caspase-2 tham gia vào con đường nội bào
ho
ạ
t
hóa apoptosis thông qua ty thể. Nghiên cứu này cho rằng caspase-2 kích hoạt
tr
ự
c
tiếp con đường hoạt hóa apoptosis thông qua ty thể mà không cần sử dụng đến
ch
ứ
c
năng phân cắt protein của nó
[58].
Hình 1.4. “Thác” caspase – Các caspase có thể phân cắt lẫn nhau hoặc phân
cắt
các protein khác
[74]

Các caspase hành sự: gồm có caspase-3, 6 và 7 ( xem hình
1.4)

Ngoài việc được các caspase khởi sự hoạt hóa, các caspase hành sự cũng
có
khả năng hoạt hóa lẫn
nhau.
Caspase-3 là một yếu tố chủ chốt thi hành apoptosis. Nó được hoạt hóa
b
ở
i
caspase-8, caspase-9, caspase-10, granzyme B và các yếu tố khác. Caspase-3
ch
ị
u
trách nhiệm phân cắt nhiều cơ chất mà một vài cơ chất trong số đó là
procaspase-6,
procaspase-9, PARP, ICAD (inhibitor of caspase- activated deoxyribonuclease).
T
ấ
t
cả các cơ chất của caspase-3 thông thường đều có chứa trình tự DEVD
(Asp-Glu-
Val-Asp).
Ngoài các caspase khởi sự, procaspase-6 có thể được hoạt hóa bởi
caspase-3,
nhưng không bị hoạt hóa bởi granzyme B. Caspase-6 cũng có thể hoạt hóa
l
ạ
i
procaspase-3 bằng con đường “positive
feedback”.
Trong khi đó, procaspase-7 lại có thể được hoạt hóa bởi granzyme

B.
Caspase-7 cũng có thể hoạt hóa procaspase-6
[24].
1.2.3. Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình
apoptosis
Sự hoạt hóa caspase được điều hòa một cách chặt chẽ, thông qua 2 con
đườ
ng
chính: con đường tín hiệu ngoại bào (extrinsic pathway) - thông qua thụ thể
gây
chết và con đường nội bào (intrinsic pathway) - thông qua ty thể [67]. Tuy
nhiên,
hai con đường này không độc lập hoàn toàn mà có sự liên kết với nhau, tín
hi
ệ
u
phân tử của con đường này có thể ảnh hưởng lên con đường kia [20] (xem
hình
1.5).
Hình 1.5. Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis
[75]
Con đường tín hiệu ngoại bào (hoạt hóa procaspase khởi sự thông qua
thụ
thể gây
ch
ế
t)
Thụ thể gây chết (death receptor) trên bề mặt tế bào khi kết hợp với các
ligand
đặc hiệu như TNFα, FasL và TRAIL (TNF- related apoptosis induced- ligand)

s
ẽ
truyền đi tín hiệu
apoptosis.
Những thụ thể gây chết là thành viên của hệ thống thụ thể TNF
(tumor
necrosis factor). Những thành viên của hệ thống thụ thể này thường liên kết
v
ớ
i
những ligand có cấu trúc tương tự TNF. FasL và TRAIL chính là những ligand
có
cấu trúc như thế [10]. TNFR1 và Fas (CD95) là hai trong số những thụ thể có
kh
ả
năng hoạt hóa apoptosis. Sự kết hợp giữa các ligand với receptor đặc hiệu như
sau:
FasL/FasR, TNFα/TNFR1 [20]. Trên domain nội bào của các receptor TNF
này
chứa một vùng đặc biệt gọi là “death domain”
(DD).
Để hoạt hóa yếu tố khởi sự apoptosis, cần phải có các phân tử protein nội
bào
làm cầu nối trung gian, các phân tử protein này được gọi là các adaptor.
TRADD
(TNF receptor – associated death domain) và FADD (Fas-associated death
domain)
là các adaptor tham gia vào quá trình truyền tín hiệu hoạt hóa apoptosis. Trên cả
hai
phân tử TRADD và FADD đều có chứa “death domain” có thể liên kết trực tiếp

v
ớ
i
“death domain” của thụ thể. Trên FADD, còn có một domain khác gọi là
DED
(death effector domain). Trên phân tử procaspase-8 và procaspase-10 cũng có
2
DED, nhờ đó mà có thể liên kết trực tiếp với adaptor FADD [10]. Sự hoạt
hóa
procaspase-10 cũng tương tự như
procaspase-8.
Tùy theo thụ thể mà sẽ có sự phối hợp các adaptor khác nhau. Đối với thụ
th
ể
TNFR1, cần phải có cả TRADD và FADD. TRADD là phân tử trung gian liên
k
ế
t
FADD và thụ thể TNFR1 thông qua các “death domain”. Sau đó, FADD sẽ kết
h
ợ
p
với procaspase-8 thông qua DED [10]. Đối với thụ thể Fas, các ligand (FasL
và
CD95L) cũng hoạt hóa apoptosis theo cách giống với thụ thể TNFR1. Tuy
nhiên,
adaptor FADD có thể kết hợp trực tiếp với thụ thể Fas mà không cần thông
qua
trung gian TRADD [76] (xem hình
1.6).

Hình 1.6. Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF
[72]
Một phức hợp protein (phần “death domain" của thụ
th
ể
/adaptor/procaspase-8)
được gọi là DISC (death inducing signalling complex). Các caspase được
tuy
ể
n
chọn đến phức hợp DISC chủ yếu là procaspase-8, một vài trường hợp
là
procaspase-10. Trong phức hợp DISC, 2 phân tử procaspase-8 kết hợp với nhau
d
ẫ
n
đến sự tự hoạt hóa procaspase-8 thành caspase-8 hoạt động. Sau đó, con đường
ho
ạ
t
hóa tiếp theo của caspase-8 thay đổi tuỳ loại tế bào. Ở một số dòng tế bào
lympho,
caspase-8 hoạt động mạnh mẽ và có thể hoạt hóa trực tiếp procaspase-3
thành
caspase-3 dạng hoạt động. Ở một số tế bào khác, caspase-8 không hoạt hóa trực
ti
ế
p
procaspase-3 mà hoạt hóa thông qua con đường trung gian ty thể. Khi đó,
caspase-8

cắt protein Bid thuộc họ proapoptotic protein trong tế bào chất thành dạng
ho
ạ
t
động của nó là tBid, sau đó tBid sẽ khởi động con đường hoạt hóa apoptosis
thông
qua ty thể [24] (xem hình
1.5).