ứng dụng kỹ thuật mlpa (multiplex ligation dependent probes amplification) trong xác định kiểu haplotype của các chủng salmonella enterica serovar typhi phân lập ở việt nam và một số nước châu á

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
–R—


PHẠM THANH DUY




ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA (MULTIPLEX LIGATION DEPENDENT
PROBES AMPLIFICATION) TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU HAPLOTYPE CỦA
CÁC CHỦNG SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHI PHÂN LẬP Ở
VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ NƯỚC CHÂU Á



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 604240



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. STEPHEN BAKER


TP. HỒ CHÍ MINH – 2010

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tiến sỹ Stephen
Baker, người trực tiếp hướng dẫn đề tài cũng như tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tiếp theo, tôi xin cảm ơn tiến sỹ
Trần Thụy Châu đã hướng dẫn tôi những thao tác sinh học phân tử trong
quá trình làm thí nghiệm cũng như chỉnh sửa luận văn này. Tôi cũng xin
gửi lời cảm ơn đến bác sỹ James Campbell, anh Hoàng và các anh chị
trong phòng thí nghiệm vi sinh của đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học
Oxford đã tận tình chỉ dạy tôi những thao tác vi sinh cơ bản và giúp đỡ tôi
trong thời gian làm đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giảng dạy tại
khoa Sinh Học trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí
Minh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian đại học cũng
như cao học.
Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong gia
đình tôi đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn các anh chị đồng nghiệp đã luôn ở bên cạnh
động viên, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm cũng như giúp đỡ tôi về mọi
mặt trong quá trình làm đề tài.



i


MỤC LỤC
Lời Cảm ơn
Mục

lục…………………………………………………………………………… i
Danh mục các chữ viết tắt
…………………………………………………………iv
Danh mục các
bảng…………………………………………………………………v
Danh mục các hình
vẽ…………………………………………………………… vi
Giới
thiệu……………………………………………………………… vii
Mục tiêu và ý nghĩa của đề
tài……………………………………………………viii
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype
Typhi (S.Typhi) 2
1.2. Đặc điểm cấu trúc và sinh lý, sinh hóa của S.Typhi 3
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc …4
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5
1.3. Phương pháp phân lập và định danh S.Typhi 5
1.4. Đặc điểm di truyền của S.Typhi 6
1.5. Bệnh học sốt thương hàn do S.Typhi 7
1.5.1. Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm 7
1.5.2. Triệu chứng lâm sàng 7
1.5.3. Sự phát sinh bệnh do S.Typhi 8
1.5.4. Phòng bệnh sốt thương hàn 8
1.5.5. Điều trị sốt thương hàn 10
1.6. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay của S.Typhi và dịch tễ học sốt
thương hàn trên thế giới và Việt Nam 10
1.6.1. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn
trên thế giới 10
1.6.2. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn

tại Việt Nam 13
ii


1.7. Các phương pháp phân biệt S.Typhi trong nghiên cứu dịch tễ và tìm hiểu
cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi 14
1.7.1. Các phương pháp cổ điển dựa trên kiểu hình 14
1.7.2. Các phương pháp phân tử dựa vào DNA 16
1.8. Phát triển phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe
amplification) trong phân biệt các chủng S.Typhi 20
1.8.1. Giới thiệu phương pháp MLPA 20
1.8.2. Nguyên tắc của MLPA 22
1.8.3. Ưu điểm của kỹ thuật MLPA 23
1.9. Golden gate SNP typing 23
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu 26
2.2 Qui trình thực nghiệm 26
2.3 Hóa Chất – Thiết Bị - Phương Pháp Tiến Hành 26
2.3.1 Định danh vi khuẩn 27
2.3.1.1. Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa cơ bản 27
2.3.1.2. Định danh sinh hóa bằng Kít Api 20E (Biomerieux, Paris, Pháp). 29
2.3.1.3. Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên–kháng
thể 30
2.3.2. Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum
inhibitory concentration) 32
2.3.3. Tách chiết DNA bộ gen S.Typhi bằng Wizard (Promega ) Kít 34
2.3.4. SNP typing bằng Golden gate Assay 35
2.3.5. Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification (MLPA) 35
2.3.5.1. Thiết kế mẫu dò 35
2.3.5.2. Quá trình thực hiện MLPA 38

2.3.5.3. Phân tích sản phẩm MLPA 39
2.3.6. PCR thông thường 42
2.3.7. Dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) từ dữ liệu SNP typing và
dữ liệu MLPA) 43
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
iii


3.1 Kết quả xác nhận S.Typhi bằng các phản ứng sinh hóa và Kít Api 20E 44
3.2. Kết quả kháng sinh đồ và MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của các chủng
S.Typhi phân lập ở Việt Nam và các nước Châu Á 44
3.2.1. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở Việt Nam 45
3.2.2. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở một số nước Châu Á 46
3.2.3 . Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với OFX
(ofloxacin) và CIP (ciprofloxacin) của các chủng S.Typhi phân lập từ
Việt Nam và các nước Châu Á 48
3.2.4. Đánh giá giới hạn kháng-nhạy (breakpoint) với ciprofloxacin và
ofloxacin theo hướng dẫn của CLSI hiện nay: 49
3.3. Kết quả SNP typing bằng Golden gate assay 52
3.4. Kết quả phân loại các chủng S.Typhi bằng phương pháp MLPA 54
3.4.1 Kết quả phát hiện các đoạn gắn chèn-bị mất của S.Typhi bằng MLPA 54
3.4.2. Kiểm tra độ chính xác của phương pháp MLPA trên các chủng chứng 56
3.4.3. So sánh kết quả xác định haplotype của S.Typhi bằng Golden gate
SNP typing và MLPA 57
3.4.4. Kết quả phân tích sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của 217
S.Typhi bằng phương pháp MLPA 60
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN 65

4.2 ĐỀ NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………
ix
PHỤ LỤC………………………………………………………………………
xxiii




iv



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp Base pair
CIP Ciprofloxacin
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
GTR General time-reversible
In-del insertion-deletion
IS Insertion sequence
KIA Kligler Iron Agar
Kb Kilobase
MDR Multiple drug resistant
MH Muller-Hinton
MIC Minimum inhibotory concentration
MLEE Multilocus enzyme electrophoresis
MLPA Multiplex ligation dependent-probes amplification

MLST Multilocuc sequence typing

NA Nutrient agar
Na Nalidixic acid
NaR Nalidixic acid resistant
mg/l Miligam/lít
OFX Ofloxacin
PFGE Pulsed- Field Gel Electrophoresis
PSO Polyvalent O
RAPD Random amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SPIs Salmonella Pathogenicity islands
S.Typh
i Salmonella enterica serovar Typhi
TBE Tris-borat / EDTA
µg/ml Microgam/mililít
UV Ultra violet





v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Trang
1.1……………………………………………………………………… 2
2.1……………………………………………………………………… 27
2.2……………………………………………………………………… 34
2.3……………………………………………………………………… 37
2.4……………………………………………………………………… 43

3.1……………………………………………………………………… 45
3.2……………………………………………………………………… 48
3.3……………………………………………………………………… 52
3.4……………………………………………………………………… 56
3.5……………………………………………………………………… 57
3.6……………………………………………………………………… 60














DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình Trang
vi


1.1……………………………………………………………………….3
1.2……………………………………………………………………….4
1.3……………………………………………………………………….11
1.4……………………………………………………………………….12
1.5……………………………………………………………………….13

1.6……………………………………………………………………….18
1.7……………………………………………………………………….21
1.8……………………………………………………………………….22
1.9……………………………………………………………………….25
2.1……………………………………………………………………….29
2.2……………………………………………………………………….30
2.3……………………………………………………………………….31
2.4……………………………………………………………………….32
2.5……………………………………………………………………….40
2.6……………………………………………………………………….41
2.7……………………………………………………………………….42
3.1……………………………………………………………………….46
3.2……………………………………………………………………….50
3.3……………………………………………………………………….51
3.4……………………………………………………………………….53
3.5……………………………………………………………………….55
3.6……………………………………………………………………….55
3.7……………………………………………………………………….62







Giới thiệu
Salmonella Typhi là nguyên nhân chính gây bệnh sốt thương hàn ở Việt
Nam và trên thế giới. Theo thống kê, số ca nhiễm hàng năm lên đến 16-33 triệu
ca với khoảng 500.000-600.000 người chết [9]. Bệnh lây truyền qua đường
vii

phân-miệng nên rất phổ biến ở các nước đang phát triển, đặc biệt ở các nước
Châu Á và Châu Phi [109]. Kháng sinh là biện pháp hiệu quả nhất trong điều trị
sốt thương hàn. Tuy nhiên tình hình kháng thuốc lan tràn và không ngừng gia
tăng hiện nay của S.Typhi gây rất nhiều khó khăn trong điều trị [70]. Nghiêm
trọng hơn là sự gia tăng của quần thể S.Typhi đa kháng thuốc (kháng với
chloramphenicol, ampicillin và co-trimoxazole) kết hợp kháng nalidixic acid.
So với những chủng nhạy thì những chủng đa kháng thuốc gây bệnh nặng hơn;
tỉ lệ biến chứng và tử vong cao hơn đặc biệt ở trẻ em dưới 2 tuổi và giới hạn
kháng sinh điều trị [109]. Không những thế, tỉ lệ mang S.Typhi mãn tính sau
điều trị còn cao hơn gấp 10 lần so với sốt thương hàn gây ra bởi chủng nhạy
[70]. S.Typhi kháng nalidixic acid (kháng sinh thế hệ I thuộc họ quinolone) gây
giảm nhạy với fluoroquinolone, là họ kháng sinh chủ yếu trong điều trị sốt
thương hàn hiện nay. Sự giảm nhạy với fluoroquinolone của các chủng S.Typhi
thường dẫn đến việc điều trị kéo dài, nguy cơ thất bại cao và tăng gánh nặng
điều trị [3, 8, 33, 49, 59, 78, 82].
Do đó, sốt thương hàn gây ra do các chủng S.Typhi đa kháng kết hợp
kháng nalidixic acid đang được quan tâm hiện nay ở nhiều nước đang phát
triển. Nghiên cứu về dịch tễ cũng như cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi
là rất quan trọng và cần thiết để tìm hiểu sự lây lan, ngăn chặn sự bùng phát của
bệnh trong tương lai và có phát đồ điều trị hợp lý. Tuy nhiên, các nghiên cứu
đều gặp nhiều khó khăn do chủng S.Typhi có tính tương đồng di truyền cao. Vi
khuẩn này rất ổn định về mặt di truyền, mức độ đa dạng trình tự thấp, khi so
sánh một vài trình tự gen thường không phân biệt được các dòng S.Typhi [54].
Do đó để phân biệt các chủng S.Typhi cần phải có những phương pháp nghiên
cứu sâu hơn.
Với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật giải trình tự tự động thì SNP
typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)- phương pháp phân biệt dựa
vào sự đa hình các trình tự nucleotide được xem là phương pháp chuẩn hiện

nay. Tuy nhiên phương pháp này rất tốn kém, đòi hỏi thời gian và thiết bị kỹ
thuật đắt tiền nên không thể áp dụng ở những vùng dịch tễ của sốt thương hàn
thường là những vùng kinh tế thấp.
viii


Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi muốn phát triển một
phương pháp giúp xác định nhanh các kiểu di truyền của S.Typhi một cách đơn
giản, có hiệu quả phân biệt cao, lặp lại. Phương pháp này có thể được áp dụng
tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử thông thường ở Việt Nam cũng như
các nước đang phát triển.
Phương pháp này hứa hẹn sẽ trở thành công cụ hiệu quả trong các
nghiên cứu về dịch tễ học giúp tìm hiều nguồn gốc lây lan của dịch bệnh, con
đường lan truyền, tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen với vùng địa lý, mối
quan hệ giữa kiểu gen với kiểu hình kháng thuốc; nguồn gốc và sự tiến hóa các
kiểu gen khác nhau ở S.Typhi…Ngoài ra phương pháp còn giúp xác định cấu
trúc di truyền trong quần thể S.Typhi ở những vùng nhất định, điều mà trước
đây hầu như không thể tiếp cận bằng các phương pháp thông thường.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN














1.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica
serotype Typhi (S.Typhi) [17] [22].
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [16]. Họ
vi khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di
động được. Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella. Trong
đó Kauffmann-White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng
rộng rãi từ năm 2003. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh
với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng

nguyên H.
2


Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng
của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu
đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong thành
phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng
nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết
thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O
9
, O
2
, O
4
…(Ban đầu các
nhóm O phổ biến được qui ước bằng chữ cái và đến nay vẫn còn dùng ở một số
nơi). Ví dụ S.Typhimurium thuộc nhóm O
4
hay còn gọi nhóm B; S.Typhi thuộc
nhóm O
9
(nhóm D1); S.Paratyphi thuộc nhóm O
2
(nhóm A).
Kháng nguyên H là phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn. Kháng
nguyên H có bản chất là protein, hình thành từ các tiểu đơn vị protein flagellin.
Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại kháng
nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [22]. Tuy nhiên hoạt
động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu hiện

ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [22]. Hai kháng nguyên H này được
xếp vào pha 1 và pha 2. Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một
kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên
pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra, một số týp huyết thanh “đơn pha” do tự nhiên như
S.Enteriditis, S.Typhi…
Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài:
Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào
Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân
loài qui định bằng tên hoặc số La Mã. Trong đó S.Typhi thuộc phân loài I.
Bảng 1.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp Kauffmann-
White [17].

Loài và phân loài Số lượng týp huyết Vật chủ
Salmonella thanh trong mỗi phân loài

S.enterica subsp.enterica (I) 1454 Động vật máu nóng
S.enterica subsp.salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường
3


S.enterica subsp.diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường
S.bongori (V) 20 Động vật máu lạnh và môi trường

Tổng cộng: 2463 týp huyết thanh
Tên của týp huyết thanh không được viết in nghiêng và chữ cái đầu tiên
được viết hoa để nhấn mạnh các týp huyết thanh này không phải là những loài
khác nhau. Tóm lại, Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi

(S.Typhi) là chủng vi khuẩn có tên týp huyết thanh (serotype) là Typhi thuộc
giống Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica.
S.Typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I 9,12(Vi):d:-
để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9, 12 và mang
thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không có kháng
nguyên H pha 2.
Phần lớn (59%) týp huyết thanh của Salmonella thuộc S.enterica phân
loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O
2
, O
4
, O
9
…
gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu
nóng [75].


1.2. Đặc điểm cấu trúc và sinh lý, sinh hóa của S.Typhi
Đặc điểm về cấu trúc của S.Typhi đóng vai trò quan trọng trong sự gây
bệnh, tính đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ và các phương pháp chẩn đoán
bệnh.
4


1.2.1. Đặc điểm cấu trúc

S.Typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc gồm 2
màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng
nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các

lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào.
Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi
tế bào chất.
Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở S.Typhi và
S.Paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của acid N-
acetylglucosamine uronic, nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng
nguyên O. S.Typhi còn mang các roi dài 2-5 µm là sự kéo dài của các thể nền
bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp cho sự
gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi lông này có đường kính
khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các tiểu
đơn vị fimbrillin hoặc pilin.
Cấu trúc bề mặt của S.Typhi đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc
tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ. Nếu Salmonella mất hoặc
Hình 1.1 : Cấu trúc tế bào vi khuẩn S.Typhi

[
55
]

5


không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào
chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn
công của các bổ thể của hệ miễn dịch [55].
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa [55]
S.Typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy
ý, di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển
tốt nhất ở 37
o

C; có khả năng lên men glucose nhưng không
lên men lactose, có thể tạo một ít H
2
S từ cơ chất sulphat
tan. Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong
quá trình sống.
S.Typhi khác so với hầu hết Salmonella ở chỗ chúng không
bao giờ sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc
decarboxylate orthinine và không lên men rhamnose. S.Typhi không sinh
indole, thử nghiệm Voges-Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và
urease âm tính. Các đặc tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử
nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh trong định danh S.Typhi.
S.Typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh ở
bất kỳ sinh vật nào khác. S.Typhi có khả năng thay đổi để chống lại các điều
kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp; vì vậy rất khó để loại bỏ tận
gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn. S.Typhi có thể tồn tại ở thịt chưa được
nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạ dày để gây bệnh ở người [44].
1.3. Phương pháp phân lập và định danh S.Typhi
Sốt thương hàn do S.Typhi rất khó chẩn đoán vì bệnh không có triệu
chứng lâm sàng đặc trưng và có nhiều triệu chứng tương tự các bệnh sốt khác
như sốt xuất huyết hay sốt rét. S.Typhi có thể được phân lập từ nhiều nguồn
khác nhau như dịch não tủy, máu, phân, nước tiểu Trong đó cấy máu được
xem là phương pháp chẩn đoán chuẩn, cho kết quả dương tính từ 60-80% bệnh
nhân sốt thương hàn [72]. Độ nhạy của phương pháp cấy máu cao hơn trong
tuần đầu tiên của bệnh, giảm khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó và
tăng khi thể tích cấy máu tăng. Phương pháp cấy tủy có độ nhạy cao hơn, cho
kết quả dương tính 80-95% bệnh nhân sốt thương hàn bất kể bệnh nhân có sử
Hình 1.2
: S.Typhi [111]
6

dụng kháng sinh hay chưa và bất kể thời gian bệnh. Phương pháp cấy phân cho
tỉ lệ thành công 30% trong các bệnh nhân sốt thương hàn cấp tính. Tính nhạy
của phương pháp này tùy thuộc lượng phân dùng để cấy và thời gian bệnh [72].
S.Typhi có thể được định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa kết hợp
với thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh đặc hiệu O
9
, Vi. Tuy nhiên
phương pháp ngưng kết kháng nguyên-kháng thể này gặp trở ngại do một số
týp huyết thanh của Salmonella cũng mang các kháng nguyên thân của
S.Typhi. S.Typhi cũng mang các epitope phản ứng chéo với các
Enterobacteriaceae khác [72]. Ngoài ra thử nghiệm Widal cũng được sử dụng
khá rộng rãi để định danh S.Typhi dựa vào phản ứng ngưng kết để phát hiện
kháng thể kháng S.Typhi trong huyết thanh bệnh nhân. Những kháng thể này
xuất hiện trong thời gian từ tuần thứ hai đến thứ ba của bệnh [55].
1.4. Đặc điểm di truyền của S.Typhi
Trình tự bộ gen của chủng S.Typhi đa kháng thuốc CT18 phân lập ở
bệnh viện Nhiệt Đới TPHCM đã được công bố lần đầu tiên trên thế giới vào
năm 2001 [68]. Bộ gen có kích thước 4.809.037 bp với khoảng 4599 gen, mang
nhiều đoạn gắn chèn lớn gọi là các đảo độc tính ở Salmonella (Salmonella
pathogenicity islands-SPIs). Các đảo độc tính này chứa các gen quan trọng cho
sự xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn trong tế bào chủ. Đặc biệt bộ gen S.Typhi
mang 204 pseudogen chiếm hơn 4% trình tự mang mã, tương tự với bộ gen của
S.Paratyphi [53, 60]. (Pseudogen là những trình tự DNA mang mã nhưng
không được dịch mã. Những gen này có thể bị bất hoạt do đột biến tạo stop
codon, đột biến gây lệch khung, mất đoạn hay tái sắp xếp đoạn). Trong khi hầu
hết các týp huyết thanh của S.enterica đều gây bệnh ở nhiều kí chủ khác nhau
và giới hạn ở viêm dạ dày-ruột thì S.Typhi và S.Paratyphi chỉ gây bệnh ở người
và còn gây nhiễm trùng hệ thống. Trình tự DNA bộ gen S.Typhi và S.Paratyphi

có mức độ tương đồng cao nhất so với các týp huyết thanh còn lại. Sự bất hoạt
những gen đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các tế bào chủ, các gen
làm thay đổi chu trình kí sinh nội bào…được xem là cơ chế tiến hóa để S.Typhi
cũng như S.Paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [53, 60].
Sự tích lũy pseudogen cũng diễn ra ở vi khuẩn gây nhiễm trùng hệ thống khác
7


như Yesinia Pestis và vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc như Mycobacterium
lepriae.
Một đặc điểm quan trọng khác ở S.Typhi là vi khuẩn này mang rất ít đặc
tính đa dạng di truyền. Khi giải trình tự vài gen để phân biệt S.Typhi chỉ thu
được rất ít vị trí đa hình [54]. Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di
truyền thấp như S.Typhi gặp rất nhiều khó khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức
tạp [2].
1.5. Bệnh học sốt thương hàn do S.Typhi
1.5.1. Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm
Sốt thương hàn là bệnh nhiễm trùng hệ thống do S.Typhi gây ra. Con
người là kí chủ duy nhất của S.Typhi [14, 55, 72, 105]. Người lành mang trùng
có thể thải từ 10
6
đến 10
9
vi khuẩn thương hàn trong mỗi gram phân. S.Typhi
có thể tồn tại trong nước ao, hồ, nước ngầm; trong sữa, thịt, trứng và sò bị
nhiễm khuẩn. Liều gây bệnh là 10
3
đến 10
6
vi khuẩn theo đường miệng [72].

Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa. Đa số các trường hợp mắc
bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu chín.
Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực phẩm và
nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc được rửa
bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh [14, 55, 72].
Nguy cơ khác bao gồm tiếp xúc với người lành mang mầm bệnh, điều kiện vệ
sinh ăn ở kém và tiền sử nhiễm Helicobacter pilori. Những người từng nhiễm
Helicobacter pilori bị giảm acid trong dạ dày tạo điều kiện thuận lợi cho
S.Typhi xâm nhập qua rào cản acid dạ dày [14]. Do liên quan đến những yếu tố
điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những nơi có mật độ dân số cao
cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh.
1.5.2. Triệu chứng lâm sàng
Sau khi S.Typhi xâm nhập vào cơ thể từ 7-21 ngày thì bắt đầu xuất hiện
các triệu chứng khó ở, mệt mỏi, nhức đầu, biếng ăn, sốt nhẹ. Sau đó sốt cao
dần, đặc biệt về đêm (39-40
o
C), kéo dài hàng tuần nếu không điều trị; cùng với
đó là tiêu chảy hoặc táo bón, ho, nôn mửa, đau bụng, cổ cứng. Bệnh nhân còn
có thể bị chậm nhịp tim, lách to, mơ sảng [14, 55, 72, 105]. Trong tuần thứ hai
8


30% bệnh nhân có những đốm hồng ở bụng, ngực, lưng còn gọi là hồng ban
[72]. Sau tuần thứ ba bệnh nhân dần hồi phục. Tuy nhiên 10% bệnh nhân bị tái
phát hay biến chứng nặng hơn [14, 105]. Các biến chứng nguy hiểm bao gồm
xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột.
Ngoài ra, 1-6% bệnh nhân trở thành nguồn mang S.Typhi mãn tính.
Những người này có thể mang vi khuẩn S.Typhi trong tủy xương hay túi mật từ
vài tháng đến cả cuộc đời, đồng thời thải vi khuẩn qua phân và nước tiểu theo
định kỳ mà không hề biểu hiện triệu chứng bệnh nào [14, 29, 46, 55, 62]. Đây

là vấn đề y tế công cộng quan trọng vì những người này là có thể là nguồn lây
nhiễm và làm bùng phát dịch bệnh trong tương lai.
1.5.3. Sự phát sinh bệnh do S.Typhi [14, 32, 55, 62]
Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh do S.Typhi gặp nhiều khó khăn do
con người là kí chủ duy nhất của vi khuẩn này. Hầu hết những hiểu biết về sự
phát sinh bệnh do S.Typhi đều dựa trên những nghiên cứu ở S.Typhimurium-
một týp huyết thanh gây bệnh tương tự bệnh sốt thương hàn ở chuột [14].
Sau khi vào cơ thể, vi khuẩn tấn công vào ruột. Tại đây chúng xâm nhập
qua các tế bào M của mảng Peyer hoặc di chuyển qua các tế bào biểu mô hấp
thu để xuyên qua lớp dưới niêm mạc ruột non. Tiếp đó vi khuẩn kích thích
phản ứng viêm và hoạt động thực bào bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào;
đồng thời huy động tế bào bạch huyết B và T. Vi khuẩn này có thể tồn tại và
nhân lên trong các bạch cầu đơn nhân, qua đó giúp S.Typhi phát tán theo đường
máu và bạch huyết đến các hạch bạch huyết mạng treo ruột và các mô sâu hơn
[55]. Sau khi phát tán vi khuẩn sẽ gây nhiễm trùng máu sơ cấp với các triệu
chứng nhẹ như hồng ban, ho; tiếp đó S.Typhi nhiễm vào lách, gan và tủy xương
gây nhiễm trùng máu thứ cấp. Trong tuần thứ hai của bệnh, S.Typhi nhiễm vào
túi mật. Sau đó vi khuẩn nhân lên, theo ống mật vào ruột non và được thải ra
ngoài qua phân [55].
1.5.4. Phòng bệnh sốt thương hàn
Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm
khuẩn nên biện pháp quan trọng hàng đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn thực
phẩm, cải thiện hệ thống xử lý chất thải và nguồn cung cấp nước [14, 38, 51,
9


55, 70, 71]. Ở các nước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở khách du lịch trở về
từ các nước có dịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến
vấn đề an toàn thực phẩm [26].
Do S.Typhi chỉ gây bệnh ở người nên nguồn gốc lây lan bệnh luôn liên

quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnh mãn tính.
Những người chế biến thực phẩm mang mầm bệnh mãn tính có thể là nguyên
nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng. Ví dụ điển hình cho
nguy cơ từ những người mang S.Typhi mãn tính là trường hợp “Typhoid Mary
” những năm 1900. Mary-một phụ nữ khỏe mạnh mang S.Typhi mãn tính làm
nghề nấu ăn được xem là người gây ra dịch sốt thương hàn năm 1903 làm chết
1300 người [46, 55]. Những người mang S.Typhi mãn tính có thể làm lan tràn
bệnh dịch nếu họ gây nhiễm nguồn cung cấp nước. Vì vậy, việc tầm soát và
chữa trị cho những người mang S.Typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong
công tác phòng chống dịch.
Vắc-xin là một biện pháp hiệu quả trong phòng bệnh sốt thương hàn.
Vắc-xin đầu tiên là chủng S.Typhi bị bất hoạt do nhiệt, phenol…Tuy nhiên vắc-
xin này gây nhiều phản ứng phụ [14, 71, 72]. Tiếp theo là Vắc-xin Ty21a có
nguồn gốc từ chủng S.Typhi Ty2 được làm yếu và không mang vỏ Vi. Đây là
vắc-xin dạng uống, uống 3 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày. Vắc-xin này tương
đối an toàn cho hiệu quả bảo vệ trong 5 năm và ít có tác dụng phụ, tuy nhiên lại
không được sử dụng cho trẻ em dưới 6 tuổi [14, 55, 72, 108]. Vắc-xin thứ 3 có
bản chất là polysaccharide Vi tinh chế, được dùng ở dạng tiêm một lần duy
nhất. Do vắc-xin này ít tác dụng phụ nên được sử dụng rộng rãi và có thể dùng
cho trẻ em trên 2 tuổi. Tuy nhiên hiệu quả bảo vệ cũng chỉ khoảng 2-3 năm.
Sau 3 năm phải tiêm nhắc lại [14, 71, 104, 107]. Vắc-xin này thường được tiêm
cùng với một số vắc-xin khác cho những người đi du lịch đến các vùng lưu
hành dịch. Ngoài ra còn có vắc-xin tái tổ hợp Vi cho trẻ em từ 2-5 tuổi ở Việt
Nam. Vắc-xin này cho hiệu quả bảo vệ 91.1% trong 27 tháng, có thể dùng cho
trẻ em dưới 2 tuổi và đã được đưa vào chương trình tiêm chủng quốc gia mở
rộng [14].
10


1.5.5. Điều trị sốt thương hàn

Ở các vùng dịch tễ sốt thương hàn, hơn 60-90% trường hợp bệnh được
điều trị tại nhà bằng kháng sinh và nghỉ ngơi hợp lý [72]. Đối với bệnh nhân
nhập viện sẽ được điều trị bằng kháng sinh, dinh dưỡng, chăm sóc hợp lý, cân
bằng điện giải, bù nước và dịch…
Trong các kháng sinh sử dụng điều trị sốt thương hàn hiện nay thì
fluoroquinolone (oxfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin) được
xem là họ kháng sinh hiệu quả nhất [71, 72]. Hiệu quả của các kháng sinh này
đã được chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng [25, 70, 73].
Tuy nhiên việc vi khuẩn kháng quinolone ở những vùng lưu hành dịch
đã làm giảm hiệu quả của fluoroquinolone. Ở những nơi vi khuẩn vẫn nhạy với
quinolone thì fluoroquinolone là lựa chọn tốt nhất để điều trị sốt thương hàn.
Ngược lại, nếu vi khuẩn kháng quinolone thì hiệu quả điều trị với
fluoroquinolone giảm, thời gian điều trị kéo dài, liều dùng phải cao và tăng
nguy cơ thất bại [8, 57, 69, 71, 81].
Ngoài fluoroquinolone thì azithromycin và cephalosporin thế hệ thứ 3
(ceftriaxone, cefixime, cefotaxime và cefoperazone) cũng là những kháng sinh
hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn [25, 70]. Chloramphenicol, amoxicillin
và co-trimoxazole vẫn là lựa chọn thích hợp trong điều trị sốt thương hàn ở
những nơi vi khuẩn vẫn còn nhạy với các kháng sinh này.



1.6. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay của S.Typhi và dịch tễ học sốt
thương hàn trên thế giới và Việt Nam
1.6.1. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt
thương hàn trên thế giới
Năm 1948 chloramphenicol là kháng sinh được lựa chọn hàng đầu trong
điều trị sốt thương hàn [110]. Hai năm sau khi sử dụng kháng sinh này, chủng
S.Typhi kháng chloramphenicol bắt đầu xuất hiện. Tuy nhiên, trong những năm
1950-1960 hầu hết các chủng S.Typhi phân lập được đều nhạy với

11


chloramphenicol. Năm 1972, dịch sốt thương hàn gây ra do chủng S.Typhi
kháng chloramphenicol bùng phát ở Mexico, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Hàn
Quốc và Peru [63]. Những chủng này cũng kháng sulfonamides, tetracycline và
streptomycin. Amoxcilin và co-trimoxazole là những kháng sinh thay thế để
điều trị sốt thương hàn do S.Typhi kháng chloramphenicol [72].
Vào những năm 1980-1990, S.Typhi đa kháng với tất cả kháng sinh ưu
tiên sử dụng trong điều trị sốt thương hàn (gồm chloramphenicol, co-
trimoxazole và ampicillin) [63]. Các chủng S.Typhi đa kháng thuốc-MDR
(multiple drug resistance) tiếp tục gây ra các đợt dịch liên tiếp ở thung lũng
Kashmir (Ấn Độ) với 230 ca, Pakistan (1990), Bangladesh, Việt Nam (1993),
Trung Đông và Châu Phi [72]. Các nghiên cứu cho thấy chủng S.Typhi đa
kháng thuốc mang các gen kháng nằm trên một plasmid duy nhất [37, 72].
Fluoroquinolone, cephalosporin phổ rộng và gần đây là azithromycin là
những kháng sinh thay thế hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn đa kháng
thuốc. Tuy nhiên những kháng sinh này khá đắt tiền và một số phải sử dụng
dạng tiêm. Ngoài ra S.Typhi kháng các kháng sinh họ cephalosporin phổ rộng
và fluoroquinolone cũng đã xuất hiện và trở thành vấn đề quan trọng ở nhiều
khu vực Châu Á [11, 15, 79, 80, 85, 103].
Sự xuất hiện quần thể chủng S.Typhi kháng nalidixic acid và nhạy với
ciprofloxacin nhưng có MIC từ 0.125-1 mg/l ngày càng trở nên phổ biến.
Những chủng này được xem là kháng nalidixic acid và giảm nhạy với
fluoroquinolone. Chủng S.Typhi kháng nalidixic acid và giảm nhạy với
fluoroquinolone đã gây ra đợt dịch ở Tajikistan năm 1997 làm 8000 người mắc
bệnh trong 6 tháng và 150 người chết [61]. Tình hình kháng fluoroquinolone sẽ
còn diễn biến phức tạp hơn khi chủng S.Typhi kháng hoàn toàn ciprofloxacin
đã được công bố tại Ấn Độ [79, 80], Bangladesh [3] Nepal [24] và Kuwait [30].

12









Theo số liệu gần đây ước tính sốt thương hàn làm 21.6 triệu người bị
bệnh và 216.500 người chết trong năm 2000 [28]. Tỉ lệ mắc sốt thương hàn cao
(>100 ca/100.000 người/năm) ở Nam Á, Đông Nam Á và phía nam Châu Phi ;
trung bình (10-100 ca/100.000 người/năm) ở phần còn lại của Châu Á, Châu
Phi, Mỹ Latin, Châu Đại Dương (ngoại trừ Úc và New Zeland); tỉ lệ nhiễm
thấp ở phần còn lại của thế giới (<10 ca/100.000 người/năm) (hình 1.4). Ở các
nước trong vùng dịch, hầu hết người mắc bệnh là trẻ em 1-5 tuổi và thanh niên
[14]. Đa số ca nhiễm đều tập trung ở những nước đang phát triển như Việt
Nam, Nepal, Ấn Độ, Bangladesh …Ở các nước phát triển như Mỹ, sốt thương
hàn chủ yếu ở khách du lịch trở về từ vùng có dịch. Theo số liệu báo cáo từ
năm 1993-1999 tại Mỹ có 1393 ca nhiễm sốt thương hàn, trong đó 74% liên
quan đến những người trở về từ vùng có dịch [67].

Hình
1.
4

: S
ự

phân b
ố

đ
ị
a lý c
ủ
a sốt thương hàn năm
2000

[28]
.

13






1.6.2. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt

thương hàn tại Việt Nam [24] [42, 70] [58] [20, 83, 101, 102]
Việt Nam là một trong những nước phải đối mặt với sốt thương hàn
trong nhiều năm qua, đặc biệt là các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và một số
vùng của thành phố Hồ Chí Minh. Chủng S.Typhi gây sốt thương hàn kháng
chloramphenicol đầu tiên được phân lập năm 1973 tại bệnh viện Chợ Quán
[20]. Tỉ lệ chủng phân lập kháng chloramphenicol tăng đến 80% vào năm 1975
nhưng sau đó giảm xuống 54% khi co-trimoxazole được sử dụng thay thế cho
chloramphenicol trong điều trị sốt thương hàn [42, 58]. Năm 1995, 90% chủng
S.Typhi phân lập từ mẫu cấy máu ở bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh
đều là chủng đa kháng thuốc và số bệnh nhân nhập viện tăng vọt.
Fluoroquinolone sau đó được sử dụng rộng rãi trong điều trị sốt thương hàn ở
bệnh viện và trong cộng đồng. Điều này giúp giảm số ca nhập viện trong năm
1996 và đầu năm 1997.
Cuối năm 1997 và đầu năm 1998, dịch bệnh lại xuất hiện tại một số
quận của thành phố Hồ Chí Minh, gây ra bởi chủng S.Typhi đa kháng thuốc và
kháng nalidixic acid [69]. Năm 1998, 87% chủng S.Typhi phân lập kháng với
nalidixic acid. Từ năm 1998, số lượng bệnh nhân sốt thương hàn nhập viện vào
bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh giảm đáng kể. Tuy nhiên tại một số
tỉnh của đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Kiên
Giang…sốt thương hàn vẫn rất phổ biến.
Ở S.Typhi, sự kháng nalidixic acid xảy ra do các đột biến điểm trong
vùng gen gyrA mã hóa cho tiểu đơn vị A của men gyrase (còn gọi là vùng quyết
định cho sự kháng quinolone) [19, 102]. Các đột biến này gây ra sự thay thế
amino acid tại vị trí serine 83 hoặc aspartate 87, do đó làm thay đổi cấu trúc
của gyrase, là men giúp cho quá trình sao chép DNA của vi khuẩn [24, 69,
102].
14


Trong nghiên cứu công bố năm 2006 của Roumagnac thì ở Việt Nam

đang có sự mở rộng của quần thể vi khuẩn S.Typhi kháng nalidixic acid [83].
Hầu hết các chủng S.Typhi kháng nalidixic acid phân lập ở Việt Nam đều là
chủng đa kháng thuốc [24]. Những chủng này gây giới hạn lựa chọn kháng
sinh, tăng nguy cơ thất bại điều trị (lên đến 20%) và kéo dài giai đoạn mang
khuẩn trong phân [70, 72].








1.7. Các phương pháp phân biệt S.Typhi trong nghiên cứu dịch tễ và tìm
hiểu cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi
Tình hình dịch tễ sốt thương hàn và kháng kháng sinh của S.Typhi cho
thấy sốt thương hàn vẫn là vấn đề y tế quan trọng ở Việt Nam và trên thế giới.
Có nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển nhằm nghiên cứu dịch tễ
cũng như tìm hiểu cấu trúc di truyền của S.Typhi, bao gồm các phương pháp cổ
điển và các phương pháp dựa trên DNA.
1.7.1. Các phương pháp cổ điển dựa trên kiểu hình
Trong các phương pháp phân biệt S.Typhi dựa trên kiểu hình như phage typing,
plasmid typing, MLEE (multilocus enzyme electrophoresis)… thì phage typing
được xem là phương pháp có hiệu quả phân biệt tốt nhất.
Phage typing [4-7, 10, 35, 88, 92]
Hình 1.5. Biểu đồ kháng kháng sinh của S.Typhi phân lập từ các nghiên cứu lâm
sàng ở miền Nam Việt Nam từ 1993-2005.
Biểu đồ thể hiện % của các chủng đa kháng; % các chủng kháng nalidixic acid và số
lượng chủng phân lập được mỗi năm [23]
15

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một
chủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng một loài
[6, 7, 92]. Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa
trên tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác
nhau.
Phương pháp Vi-phage typing cho S.Typhi cũng dựa trên nguyên tắc
trên, sử dụng các Vi-phage là các phage chỉ tấn công và gây ly giải vi khuẩn có
kháng nguyên Vi. Vi khuẩn được trải lên môi trường thạch đã kẽ ô ở mặt dưới.
Mỗi ô được bơm vào một phage riêng biệt. Các chủng S.Typhi sẽ được phân
biệt thành các kiểu Vi khác nhau dựa trên tính nhạy khác nhau của chúng với
hỗn hợp phage này. Ví dụ S.Typhi kiểu Vi A có đặc tính nhạy với toàn bộ Vi-
phage trong hỗn hợp. Hiện nay có tổng cộng 33 kiểu Vi của chủng S.Typhi
được công nhận trên toàn thế giới [7].
Phage typing là phương pháp đầu tiên nhằm phân biệt S.Typhi trong các
nghiên cứu về dịch tễ thương hàn và cho hiệu quả khá tốt. Tuy nhiên phương
pháp này vẫn nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí
nghiệm chuẩn như International Reference Laboratory for Enteric Phage
Typing (London). Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa
dạng của hỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một
vùng địa phương. Ngoài ra nhiều chủng S.Typhi không thể xác định được kiểu
Vi do chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo với
nhiều loại Vi-phage khác nhau.
Plasmid typing là phương pháp phân biệt S.Typhi dựa trên khác biệt về
kiểu hình cắt giới hạn của plasmid. Phương pháp này không có hiệu quả do
không phải chủng S.Typhi nào cũng mang plasmid và plasmid lại là một nhân
tố có thể di chuyển được.
MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) là phương pháp phân tích
cấu trúc di truyền dựa vào sự khác biệt điện di của 24 enzyme bảo tồn trong tế

bào chất của vi khuẩn S.Typhi (tương ứng với 24 locus). Khác biệt về điện di
của mỗi enzyme được xem là các alen tại locus gen tương ứng. Sự kết hợp khác
nhau của các alen tại nhiều locus tạo thành một kiểu di truyền đa locus